Name: オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 学ぶオンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖・精製・滴定法。バイオセーフティレベル2の研究室で高品質なウイルスストックを製造し、前臨床研究におけるがん免疫療法の研究に応用できます。

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サハラボの研究は、DOD(W81XWH-20-1-0702)とダッジ・ジョーンズ財団-アビリーンからの資金によって部分的に支援されました。サミュエル・D・ラブキンとメリッサ・R.MハンフリーはNIH(R01 CA160762)によって部分的にサポートされました。

1) oHSVの成長
注:oHSVと協力する前に、機関バイオセーフティ委員会の承認を確認してください。この研究は、承認されたIBCプロトコルNo.18007の下で行われました。BSL2の注意を維持する:すべてのピペット、先端、チューブ、およびウイルスに接触する他の材料を漂白する。手がBSL2細胞培養フードを離れる前に70%イソプロピルアルコールとスプレー手袋。ウイルスを扱った後は、常に石鹸水で手を洗ってください。
<ol><li>1日目に、20-150 cm2 フラスコの低通路ベロ細胞を、通常のベロ細胞培地で10個の細胞 /フラスコの密度を7~8×10個の細胞/フラスコに播種する。 注:ベロ培地は、ダルベッコの修飾ワシ培地(DMEM)に10%熱不活性化胎児子牛血清(IFCS)を加えることによって調製されます。</li>
	<li>0日目(細胞は80-90%コンフルエント)、ベロ細胞にoHSV接種を加える。<ol>
<li>ウイルス接種の準備<ol>
<li>ウイルス増幅のために0.01(MOIはウイルスの複製能力によって0.01から0.1まで変化する可能性がある)の多重度(MOI)を使用してください。20 フラスコのウイルス (mL) の量を計算するには、式 (1) を使用します。 20フラスコのウイルス量(mL)=必要なウイルス量(pfu)/ウイルスストックの力量(pfu/mL)(1)</li>
			<li>高グルコースダルベックコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS)を1%IFCSを加えて使用して、ウイルス接種物(T-150 cm2 フラスコあたり7 mL、すなわち20フラスコで〜140mL)を調製する。必要量のoHSVを140 mLの高グルコースDPBS/1%IFCS溶液に加え、1分間ボルテックスを加え、ベロ細胞に添加する準備ができておきます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>T-150 cm2 フラスコ 2x を 1%IFCS (10 mL/洗浄) を補った高グルコース DPBS で洗浄します。DPBS/1% IFCS を吸引し、7 mLのウイルス接種/T-150 cm2 フラスコを加えます。</li>
		<li>ベロ単層上の接種物の適切な分布のためにフラスコロッカーを使用して5分間フラスコを穏やかに揺らし、37°Cでフラスコを1.5〜2時間インキュベートします。インキュベーター棚がレベルであることを確認してください。</li>
		<li>接種を取り除き、1%のIFCS(25 mL/フラスコ)を添加してDMEMを加えます。フラスコを2~4日間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フラスコの CPE が毎日 90~100% かどうかを確認します( 図 2を参照)。</li>
	<li>oHSV感染したベロ細胞を収穫する。<ol>
<li>培養上清(〜20mL)を各フラスコ(各フラスコに約5mL)から50mL円錐形遠心分離管または媒体容器に入れて回収する。</li>
		<li>セルスクレーパーを使用して、フラスコの底部から細胞を優しく削ります。 注:セルはすぐにフラスコから外れるはずです。</li>
		<li>各フラスコ(各フラスコに〜20mLの体積、すなわち20個のフラスコに400mL)に培養上清(ステップ1.4.1で収集)の〜15mLを加え、10mLの滅菌血清学的パイプを使用してフラスコの底部を数回静かに洗います。 注:積極的にピペット しないでください 。すべてのセルをそのままに保つことを目指します。</li>
		<li>氷上の50 mL円錐形遠心分離管に細胞(+培地)を収集します(8チューブを使用して、20フラスコから400mLの収穫細胞を保持します)。</li>
		<li>4°Cで10分間 300g で細胞を回転させ、上清を吸引します。</li>
		<li>1.25 mL (50%)のウイルスバッファー (VB) および 1.25 mL (50%)各遠心管に(ステップ1.4.1で収集された)培養上清の各遠心管に、そして各ペレットを十分に再懸濁する。再懸濁した細胞を8本の50 mL遠心分離管から1本の50 mL円錐形遠心分離管に移します。 注: 表 1の VB ソリューションの準備を参照してください。メディア滅菌フィルターを使用してVB溶液をフィルター殺菌します。再懸濁液用のT-150cm2 フラスコあたり0.5mLの上澄み物を使用し、すなわち、20フラスコ(20mL)、10mLのVBと10mLの培養上清を使用する。</li>
		<li>ドライアイス/100%エタノールを使用して再懸濁セルをスナップフリーズし、-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) oHSV精製
<ol><li>スナップフリーズ(ドライアイスと100%エタノール)/解凍(37°C温水浴中)に、細胞に続いて1分間水浴超音波処理を行い、細胞の適切なリシスを確実にして上清にウイルスを放出させる。 注:40 kHz、120 Vパワーを使用して1分間の超音波処理を行います。チューニング可能な超音波処理器が利用できない場合は、超音波水浴超音波処理器を使用してください。セクション3の滴定に対して50 μLのアリコートを取り、精製手順中にウイルス損失の原因となる可能性のあるステップを特定するのに役立ちます。</li>
	<li>ベンゾナーゼヌクレアーゼ(175単位/mL)+2 mMMgCl2(1M ストック=2μL/mL)、渦、37°Cで30分間インキュベートを使用して細胞リセートを処理します。 チューブを氷の上に置き、4°Cで次の手順を実行します。</li>
	<li>低速遠心分離により細胞デブリをペレット化する。<ol>
<li>300gで細胞ライセートを10分間回転させます。</li>
		<li>上清を新しい50 mL円錐形遠心分離管に集める(細胞ペレットをVBの0.5 mLで再中断し、ペレット-1と指定し、ステップ2.3.5で使用するために4°Cで保存する; 図1参照)。</li>
		<li>上清を 500g で再び10分間回転させます(ステップ2.3.2で得られます)。</li>
		<li>上清を新しい50 mL円錐形遠心分離管に集める(細胞ペレットをVBの0.5 mLに再中断し、ペレット-2と指定し、ステップ2.3.5で使用するために4°Cで保存する; 図1参照)。</li>
		<li>再懸濁されたペレット-1(2.3.2から)とペレット-2(2.3.4から)を新しい1.7 mL遠心管、渦/超音波(水浴)2xに組み合わせ、400 g で10分間スピンします。上清を収集し、ステップ2.3.4で得られた上清とそれを組み合わせます。 図 1を参照してください。 注:ステップ2.4の濾過手順の前にウイルス凝集を防ぐために40 kHz、120 Vパワーを使用して1分間の超音波処理を行います。セクション3で滴定のために結合された上清の50 μLアリコートを取る。</li>
	</ol></li>
	<li>次の3ステップ濾過法を使用して、結合した上清(〜21mL、すなわち1.4.6から20mL、2.3.2から0.5mL、2.3.4から0.5 mL)をフィルター処理します。<ol>
<li>上清の21mLを10mLシリンジ(フィルターを通り抜けやすくするために毎回5〜7mL)を使用して引き出し、新しい50 mL円錐形遠心分離管 (TUBE 1とラベル付け)に配置された無菌5μmポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜フィルターを通してそれを渡す。<ol>
<li>2.4.1で空になった50 mLの円錐形遠心分離管に1 mLを加え(ウイルス上清の残りの微量を収集するため)、渦、 およびチューブ1 に配置された同じ5 μm PVDFフィルターを通過します(合計で22 mLの濾液をもたらします)。ステップ 2.4.2 に進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>チューブ1から濾液の22mLを引き出し(2.4.1のように)、新しい50 mL円錐形遠心分離管(TUBE 2として標識)に置かれた無菌0.8 μm混合セルロースエステル(MCE)膜フィルターを通します。<ol>
<li>ステップ2.4.2で空になった 1mLのVBを、 渦に加え、 チューブ2 に配置された同じ0.8 μm MCEフィルタを通過します(合計で23mLの濾液を持ち込みます)。ステップ 2.4.3 に進みます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>チューブ2から23mLの濾液を引き出し(2.4.1のように)、新しい50 mL円錐形遠心管(チューブ3としてラベル付け)に配置された無菌0.45 μm PVDFフィルターを通します。<ol>
<li>ステップ2.4.3で空になった チューブ2 にVBの1mLを追加し、ボルテックス、チューブ 3 に配置された同じ0.45 μm PVDFフィルタを通過します(合計で24mLの濾液をもたらします)。 注:セクション3で滴定のために濾液の50 μLアリコートを取ります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>スクロース勾配法による高速遠心分離 注: 固定角度 F13-14x50cy ローターはこのプロトコルで使用されました。ローターと遠心分離機は、次の手順に進む前に4°Cでなければなりません。<ol>
<li>氷冷、滅菌濾過25%スクロース溶液(ハンクのバランス塩溶液100 mLに25gのスクロース粉末を溶解して調製)を新しい50 mL円錐形遠心分離管に加えます。</li>
		<li>ゆっくりと(3 mL/分)スクロース層の上に24mLのウイルス濾液(ステップ2.4.3.1から得られる)を加える。ウイルス濾液とスクロース溶液の別々の層を維持するように注意してください。 注:最大30mLのウイルス層をスクロース溶液の10mL以上に添加することができます。</li>
		<li>4°Cで22,620gで90分間チューブを遠心分離します。</li>
		<li>上清とスクロース層を50 mL円錐遠心管から取り除きます。 注:ウイルスペレットは白っぽいはずです。上清の50 μLのアリコートと、セクション3の滴定用ショ糖層の50 μLアリコートを取ります。</li>
	</ol></li>
	<li>ペレットを10%グリセロール/PBS溶液に再懸濁します。<ol>
<li>50 mL円錐形遠心分離チューブに滅菌10%グリセロール(PBSで希釈)を1 mL加えてペレットを覆います。 注: 再懸濁液の量はペレットサイズによって異なる場合があります(0.8~1.2 mLなど)。より小さいボリュームは、ウイルスのより高い濃度を与えるだろう.</li>
		<li>50 mL円錐形遠心分離チューブを氷の上に2〜4時間置きます。この期間中、ペレットを取り外す/再中断するのを助けるために30 sのための15分ごとにペレットを超音波処理/渦。</li>
		<li>再懸濁ペレット(10%グリセロール/PBSの1 mL+ペレットサイズは、2 mLマイクロ遠心分離管で、総容積を〜1.3 mLにする)を収集します。[オプション:同じ50 mL円錐遠心管にさらに0.3 mLを加えてペレットの残りの微量を収集し、上下にピペットし、ステップ2.6.3で再懸濁ペレットと組み合わせて総体積を~1.6 mLにします。<ol>
<li>ステップ2.6.3の懸濁液が濁ったり曇り(細胞の破片による)、チューブを500gで10分間遠心し、上澄を新しい2mLマイクロ遠心分離チューブに移し、ステップ2.6.4に進む。</li>
		</ol>
</li>
		<li>セクション3でoHSV滴定のための50 μLアリコートを取ります。アリコート溶液の残りの部分(250 μL/アリコート)は、スクリューキャップ(長期保存のためによく密封された)を備えた無菌マイクロ遠心チューブに、スナップフリーズ、使用まで-80°Cで保存します(oHSV力価が決定されると実験試験の準備ができています)。 注:ウイルスに接触するすべての材料は、フードや処分から除去する前に、漂白または紫外線で処理する必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>3. oHSV滴定とプラークアッセイ
<ol><li>Seed 1.7-1.8 x 105 ベロ細胞/ウェルをベロ細胞培地の 6 ウェル細胞培養プレートに含めます (DMEM 10% IFCS; ステップ 1.1 参照)。 注: セルがウェル全体に均一に分布していることを確認してください。ウェルの真ん中に細胞の蓄積を引き起こす可能性があるプレートを旋回しないでください。渦巻きを防ぐために、ゆっくりと縦に手でプレートを揺らし、水平に、そしてゆっくりとインキュベーターにプレートを置きます。</li>
	<li>翌日(細胞が70-80%合流に達したとき)、培養培地を吸引し、1%IFCSを添加した高グルコースPBSの1mL/wellを加える。ステップ3.3が完了するまで、プレートを細胞培養フードに残します。</li>
	<li>PBS/1% IFCS を使用して、5 mL ポリプロピレンチューブでウイルスを連続的に希釈します (図 3)。 メモ:シリアル希釈には、ステップ2.6.4で収集した50 μLのアリコートを使用してください。第1管(10-3希釈)で、1998 μLのPBS/1%IFCS、渦の2μLのウイルスを加える。第2管(10-5希釈)で、PBS/1%IFCS、渦の990 μLの1番目のチューブから10 μLを取ります。3番目のチューブ(10-6希釈)では、PBS/1%IFCS、渦の900 μLの2ndチューブから100 μLを取ります。10-9希釈までこの10倍の連続希釈を続ける。図 3の詳細を参照してください。</li>
	<li>PBS/1% IFCS を吸引し、連続希釈ウイルス (10-5 から 10-9)の 0.7 mL/ウェルを Vero 細胞に加えます。 メモ:細胞を乾燥させないでください。</li>
	<li>プレートをロッカーにゆっくり揺らす 5 分間室温(ウイルス接種の均質な分布を確保するため)。</li>
	<li>プレートを37°Cで1.5時間インキュベートします。 注:この潜伏期間中、1%IFCSを補充したDMEMでヒト免疫グロブリンG(IgG)の1:1000希釈を調製してください。6ウェルプレートの場合、ステップ3.7で2 mL/wellを使用できるように12.5mLを準備します。ヒトIgGのロット変動を考慮して希釈を調整します。</li>
	<li>ウェルからウイルス接種を除去し、1%IFCSを添加したDMEMに0.1%のヒトIgG(培養培地中のoHSVを中和し、二次プラークの形成を防ぐために)の2mL/wellを加える。37°Cでプレートを3〜4日間インキュベートします。 注:クリアプラークは通常3日で形成されます。</li>
	<li>プレートの固定と染色<ol>
<li>上清を取り除き、純粋なメタノール(1 mL/well)で5分間細胞を固定します。メタノールを取り出し、プレートを空気乾燥させます。</li>
		<li>ギムサ染色(1:5)を脱イオン水で希釈し、希釈したギームサ染色を1mL加えます。プレートを室温で10〜15分間インキュベートします。</li>
		<li>汚れを取り除き、水道水ですすいで、プレートを空気乾燥させます。</li>
		<li>解剖顕微鏡を使用してプラークを数えます。</li>
		<li>lacZ式を使用する oHSV の場合はオプションです。<ol>
<li>上清を取り除き、室温で5〜10分間、冷たい0.2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。</li>
			<li>固定液を取り出し、細胞3倍をPBSで洗浄する。</li>
			<li>細胞にX-gal溶液(1 mL/well)を加え、プレートを37°Cで2時間インキュベートします。 注:X-gal染色は、染色の日に新鮮に調製する必要があります。長期保存は色の退色につながる可能性があります。 表 1の X-gal 溶液の準備を参照してください。</li>
			<li>X-gal染色を取り出し、水道水で1分間洗浄します。</li>
			<li>ニュートラルレッド溶液(1 mL/well)を常温で2分間カウンター染色。 注: 表 1のニュートラルレッドソリューションの準備を参照してください。</li>
			<li>水道水でプレートを1分間洗います。プレートを空気乾燥させます。</li>
			<li>解剖顕微鏡を用いて青いプラークを数える(図4)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>式を使用して、titer を計算します (2) pfu/mL (プラーク形成単位) の力価 = プラーク数/0.7 mL ×希釈係数 (2) 注: たとえば、10-9 希釈ウェルに 25 個のプラークが見つかった場合、力価は 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 ×10 pfu/mL です。これはステップ2.6.4で準備されたアリコートの最終的なoHSVの上昇です。</li>
</ol>

<ol><li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses%3A+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li>
<li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+herpes+viruses+as+oncolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).</li>
<li>Nguyen, H. -M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virotherapy%22%5BJournal%5D)">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li>
<li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside%3A+an+overview+of+current+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514(2020).</li>
<li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy%3A+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).</li>
<li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400(2020).</li>
<li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+growth%2C+preparation%2C+and+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407(2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li>
<li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li>
<li>Herpes simplex virus: methods and protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).</li>
<li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+trial+to+prepared+%CE%B31+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Review+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li>
<li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-Flop+HSV-BAC%3A+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40(2006).</li>
<li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li>
<li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).</li>
<li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li>
<li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li>
<li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li>
<li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224(2013).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel%2C+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).</li>
<li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li>
<li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).</li>
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SDRは、ジョージタウン大学とマサチューセッツ総合病院が所有・管理する腫瘍性ヘルペス単純ヘルペスウイルスに関する特許の共同発明者であり、アムジェンとActiVec社からロイヤリティを受け、EG 427の科学諮問委員会に参加しています。他の著者は開示するものは何もない。

プロトコルは、低通路ベロ細胞におけるoHSVの増殖から始まる。Vero細胞単層の合流率は、増殖細胞がVero細胞20へのoHSVの侵入を減少させることができるタイトな線維構造を開発することができるので、ウイルス接種時に〜80%であるべきである。90〜100%CPEが観察されると、培養上清が除去され、細胞が収穫され、VB/上清(ステップ1.4.6を参照)に再懸濁され、スナップ凍結、後で精製するために-80°Cで保存される。Blahoたちは、感染したベロ細胞の収穫と保存のわずかに異なる方法を採用した。例えば、細胞および培養培地を含むフラスコ(1%ウシ血清アルブミンおよびカリウムを添加したPBS)は、最初は−80°Cで少なくとも15分間保存され、続いてフラスコを室温でゆっくりと温める。次いで、細胞を回収し、滅菌乳と混合し、精製20まで-80°Cで保存する。この場合、滅菌乳は安定剤として働き、かつ、ウイルスストックの力力が培地単独で20に保存される場合よりも滅菌乳/培地に貯蔵されると劇的に高いことが実証...

腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の新しいユニークな形態です。OVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら腫瘍細胞(正常/健康細胞を温かく温かみ)1に選択的に複製およびライゼする。単純ヘルペスウイルス(oHSV)は、すべてのOVの中で最も広範に研究されたウイルスの一つです。それは、タリモジーン・ラヘルパレプベック(T-VEC)が進行黒色腫3の治療のために米国でFDAの承認を受けた最初で唯一のOVである、診療所で最も遠いです。T-VECに加えて、他の多くの遺伝子組み換えoHSVは、異なる癌タイプ3、4、5、6、7、8で前臨床的および臨床的にテストされている。現在の高度な組換えDNAバイオテクノロジーは、治療トランスジーン3、5にコードする新しいoHSVをエンジニアリングする可能性をさらに高めています。oHSVの伝播、精製、およびタイターの決定の効率的なシステムは、(新しく開発された)oHSVをインビトロおよびインビボ研究のためにテストする前に重要である。本論文ではoHSV成長(ベロ細胞)、精製(ショ糖勾配法による)、および滴定(Vero細胞におけるoHSVプラークアッセイによる)の簡単なステップバイステップの方法について説明する(図1)。これは、任意のバイオセーフティレベル2(BSL2)実験室の設定で簡単に前臨床試験のための高品質のウイルスストックを達成するために採用することができます。
ベロは、アフリカの緑色のサルの腎臓細胞株であり、vero細胞が欠陥のある抗ウイルスインターフェロンシグナル伝達経路14を有するoHSV伝播9、10、11、12、13に最も一般的に使用される細胞株である。インターフェロン遺伝子の不活性化刺激因子(STING)シグナル伝達を有する他の細胞株も、oHSV増殖12,13に使用することができる。このプロトコルは、oHSV増殖およびプラークアッセイのためにベロ細胞を利用する。伝播後、oHSV感染細胞は、採取、分解、精製を行い、そこで、細胞をまずベンゾナーゼヌクレアーゼで処理して宿主細胞DNAを分解し、核酸タンパク質凝集を防止し、細胞ライセートの粘度を低下させる。ベンゾナーゼの適切な活性化は、多くの場合、Mg2+を必要とするため、1-2 mM MgCl2がこのプロトコル15で使用されます。ベンゾナーゼ処理細胞リセートからの宿主細胞の破片は、高速スクロース勾配遠心分離の前に連続濾過によってさらに除去される。粘性25%のスクロース溶液クッションは、スクロース層を介したウイルス移動の速度を遅くし、宿主細胞関連成分を上清に残し、ペレット16の浄化およびウイルス損失の制限を改善するのに役立つ。精製されたoHSVは、次いでベロ細胞上で滴定され、そしてウイルスプラークは、17またはX-gal染色(LacZコードoHSV用)18のギムサ染色によって視覚化される。

<table><tbody><tr><td>1.7 mL遠心チューブ</td><td>Sigma</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 mLポリプロピレン遠心チューブ</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリプロピレンチューブ</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン遠心チューブ</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル細胞培養プレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaseヌクレアーゼ</td><td>シグマ</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>細胞スクレーパー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド<td>シグマ</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'改造イーグルミディアム</td><td>コーニング</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>コーニング</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクロン</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>ギムサ染色</td><td>シグマ</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>ハンク平衡塩溶液 (HBSS)</td><td>コーニング</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>高血糖ダルベッコ'リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>ヒト免疫グロブリン</td><td>ガマスタン</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>培地滅菌フィルター、250 mL</td><td>Nalgene、フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>培地滅菌フィルター、500 mL</td><td>Nalgene、フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルレッド溶液</td><td>シグマ</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>&nbsp;15710S</td><td></td></tr><tr><td>の版のロッカー</td><td>フィッシャー</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>カリウムのフェリシアン化物</td><td>ΣP8131</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カリウムのフェロシアン化</td><td>物ΣP9387</td><td></td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>Fisherの化学薬</td>品<td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16Rの遠心分離機</td><td>のサーモフィッシャー科学</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 21R遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ付き滅菌マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、0.45 PVDF</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター、0.8 MCE</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLAA033SSシ</td><td></td></tr><tr><td>リンジシリンジフィルター、5&micro;m PVDF</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150培養フラスコ</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>超音波ウォーターバス</td><td>Branson</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Corning</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

腫瘍分解性ヘルペス単純ヘルペスウイルス(oHSV)などの腫瘍分解ウイルス(OV)は、がん免疫療法の分野で急速に成長している治療戦略です。oHSVを含むOVは、抗腫瘍免疫を誘導しながら、癌細胞(健康/正常細胞を温見する)で選択的に複製し、殺す。これらのユニークな特性のために、oHSVベースの治療戦略は、FDA承認タリモジーンラヘルパレベック(T-Vec)を含む、前臨床的および臨床的に癌の治療のためにますます使用されています。成長、精製、滴定は、実験的研究に活用する前に、oHSVを含むあらゆるOVに不可欠な3つの実験室技術です。本論文では、Vero細胞でoHSVを増幅する簡単なステップバイステップの方法について述べている。oHSVが増殖するにつれて、ベロ細胞に細胞パシー効果(CPE)を生み出す。感染細胞の90〜100%がCPEを示すと、それらは穏やかに収穫され、ベンゾナーゼおよび塩化マグネシウム(MgCl2)で処理され、濾過され、スクロース勾配法を用いて精製を行う。精製後、感染性oHSV(プラーク形成単位またはPPFとして指定される)の数は、Vero細胞における「プラークアッセイ」によって決定される。本明細書に記載されたプロトコルは、細胞培養および生体内動物実験におけるインビトロ研究のための高い対値oHSVストックを調製するために使用することができる。

図 1 は、oHSV の成長、精製、および滴定に関連する重要なステップを表す図 1に、プロトコル全体の簡単な概要を示しています。ベロ細胞のCPEは、HSV感染後の4時間の早い時期に検出することができる。図2は、oHSV感染後の3つの異なる時点におけるベロ細胞におけるCPEを示す。CPE のレベルは時間の経過とともに増加します。このプロトコルでは、90-100%CPEは、通常、低MOI oHSV接種の48時間以内に観察される(これは精製のために細胞を収穫するのに最適な時期である)。ただし、ステップ 1.2 で接種された oHSV MOI や oHSV の複製の可能性によっては、最大 4 日かかる場合があります。この期間を超えて、CPEを有する細胞は、上清中のウイルスの放出につながる、除去することができる。したがって、高いウイルス性のチターを得るためには、それらが無傷である場合にCPE影響を受けた細胞を収穫することが重要である。最終的なウイルス価に寄与するもう一つの重要な因子...

本稿では、前臨床用の単純ヘルペスウイルスの増殖、精製、滴定の簡単な方法について述べる。

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

単純ヘルペスの腫瘍は、がん免疫療法の創発的な形態である。ウイルスの伝播、精製、およびタイテリック定量の効率的なシステムは、実験研究での使用に不可欠です。この方法は非常に簡単で、前臨床試験のための高品質のウイルスストックを受け取るために任意のバイオセーフティレベル2の実験室の設定で容易に採用することができる。それは抗癌免疫応答を研究し、ウイルスベースの癌免疫療法の新しい形態を開発するために使用されるため、高品質、純粋なウイルスストックの生産は非常に重要です。このプロトコルは、野生型または遺伝子操作されたヘルペス単純ヘルペスウイルスを浄化するために使用することができます。このプロトコルは、これまでこのテクニックを実行したことがない個人のために読みやすく、従いやすいものでなければなりません。この技術を初めて試す前に、リストされた材料と試薬を設置する必要があります。T-150平方センチメートルのフラスコを1%IFCSを補った2倍の高グルコースDPBSで洗浄し始めます。DPBSを吸引し、フラスコあたり7ミリリットルのウイルス接種を加える。フラスコを5分間軽く揺らし、摂氏37度で1.5~2時間インキュベートします。次に、接種を取り除き、各フラスコに1%IFCSを加えたDMEMの25ミリリットルを加えます。摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜4日間インキュベートした後、各フラスコから20ミリリットルの培養上清を50ミリリットルの遠心管に集める。細胞スクレーパーを使用して、フラスコの底部から細胞を削ります。各フラスコに、以前に採取した培養上清の約15ミリリットルを加え、体積を20ミリリットルまで引き上げ、10ミリリットルの滅菌血清学的ピペットを使用してフラスコの底部を数回静かに洗います。氷の上に置かれた50ミリリットル円錐形遠心分離管に培地で細胞を収集します。チューブを摂氏4度で10分間300倍Gで遠心分離する。各ペレットを1.25ミリリットルのウイルスバッファー、VB、および1.25ミリリットルの以前に採取した培養上清で完全に再懸濁させる。再懸濁されたペレットをすべて50ミリリットル円錐形遠心分離チューブ1個に混ぜます。ドライアイスと100%エタノールを使用して再懸濁セルを凍結し、マイナス80°Cで保存します。以前にスナップした冷凍細胞を摂氏37度の温水浴で解凍し、水浴で3サイクル1分間超音波処理します。ベンゾナーゼヌクレアーゼ175単位と、細胞のライセートと渦のミリリットル当たり2ミリモル塩化マグネシウム2マイクロリットルを加えます。30分のインキュベーションと37°Cの温水浴の後、氷の上にチューブを置きます。細胞のライセートをGの300倍に10分間回転させます。新しい50ミリリットル円錐型遠心分離管に上澄み物を集め、VBの500マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁しま

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

の世代のための迅速、簡単かつコスト効率の良いプロトコルドナー由来のCMV、前売またはEBV感染症を発症する危険性がある同種造血幹細胞移植（HSCT）の受信者に注入するためmultivirus特異的CTL（rctlを）。この製造プロセスはGMPに準拠しており、専門センターを超えてT細胞免疫療法の広範な実施を確保すべきである。...

同種造血幹細胞移植後のウイルス感染を予防/治療するMultivirus -特異的T細胞の生成

腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。...

腫瘍溶解性ウイルスと生きている組織のex vivoでの感染

我々は、モデルヘルペスウイルス、ガンマヘルペスウイルス68（γHV68）の溶菌複製における宿主シグナル伝達分子の重要な役割を識別するためのプロトコルを記述します。 γHV68溶菌レプリケーション用に遺伝子改変されたマウス系統と胎児線維芽細胞を利用して、プロトコルは、表現型の特徴とウイルス溶解複製におけるウイルス -...

モデルヘルペスウイルスの溶菌レプリケーションにおける解剖ホストウイルス作用

プロトコルは、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）の待ち時間と再活性化ヘルペスを研究するための効率的かつ再現可能なモデルシステムを説明しています。アッセイは、均質な交感神経ニューロンの培養を採用し、RNA干渉と組換えタンパク質の発現を含むさまざまなツールを使用してウイルスニューロンの相互作用の分子解剖を可能にします。...

単純ヘルペスウイルスの待ち時間と再活性化の研究の主ニューロン培養システム

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

このプロトコルは、世代のためと麻疹ウイルスの例として二重特異性 T 細胞化クリニカルパスをエンコードを使用して免疫の発現は、腫瘍溶解性ウイルスの体内における性状 ex 詳細なワークフローを説明します。アプリケーションと他のベクトルのプラットフォームや遺伝子への適応は、臨床的翻訳の新規 immunovirotherapeutics...

腫瘍標的免疫のパラミクソ ウイルス: 設計と評価 Ex Vivo

プラーキングは、集団内の生きたウイルスを定量化するために使用される日常的な方法です。プラーキングは、細菌やバクテリオファージを用いたさまざまな微生物学のカリキュラムで頻繁に教えられていますが、哺乳類ウイルスのプラーキングはより複雑で時間がかかります。このプロトコルは、単純ヘルペスウイルスとの定期的な作業のために確実に機能する手順を説明しています。...

単純ヘルペスウイルスのプラーキング

このプロトコルは、BAC16由来のビリオンを使用して、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのde novo溶解感染をモデル化するin...

無細胞カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる De Novo 溶解性感染の確立と定量化

学ぶオンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖・精製・滴定法。バイオセーフティレベル2の研究室で高品質なウイルスストックを製造し、前臨床研究におけるがん免疫療法の研究に応用できます。

オンコ分解性ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖、精製、滴定

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