ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動
May 13th, 2021
ショウジョウバエでは、卵母細胞核は卵発生時に微小管依存性の移動を受ける。ここでは、卵室ex-vivoでライブイメージングを行うことで、移行に追随するために開発されたプロトコルについて説明します。私たちの手順は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してマルチポジション3Dタイムラプス映画を取得するために12時間生きている卵室を維持します。
この技術により、生体イメージング顕微鏡を用いて、卵母細胞核遊離など、解剖されたショウジョウバエ卵室における長い生物学的プロセスを観察することが可能となる。このプロトコルは、生画像顕微鏡を実行するために12時間生きている解剖卵室を維持する方法を説明します。まず、シュナイダーミディアムのピペット200マイクロリットルを、ミリリットルインスリンあたり10ミリグラムの30マイクロリットルで補い、4マイクロリットルの熱不活性化胎児子牛血清を加えます。
ピペットチップを使用して、穿刺されたスライドの下側の穴の周りに少量のシリコーングリースを塗布します。カバースリップを配置し、ピペットチップの広い端を使用してカバースリップに圧力をかけ、シリコーングリースを平らにしてシリコーンリング内部をスライドに作成します。麻酔をした雌のハエを、150マイクロリットルの撮像媒体を含む解剖ウェルに移す。
女性を解剖するには、鉗子を使用して胸郭をつかみ、後部腹部のキューティクルを2番目の鉗子でつまみます。子宮、卵管、筋鞘を慎重に取り除きます。キューティクルの開口部に見える卵巣のペアを分離し、取り外します。
10~15マイクロリットルの画像媒体を卵巣に置き、1つの卵巣を画像チャンバーに移す。卵巣を分離するために、針を使用して卵巣の後端を保持する。別の針を使用して、卵胞を引き離すためにゲルマリウムを慎重に引っ張ります。
1本の針で鞘を保持し、卵室の残りの筋肉鞘を取り除くために別の針で大きな部屋を通して卵巣を引っ張ります。覆いの外に出たオヴァロルを沈め、カバースリップに接触させる。鉗子を使用してマイクロチャンバーから後期および卵巣の残りの部分を取り除く。
針を使用して、慎重に卵巣子を距離を計り、取得を容易にします。透過性膜の小さな10を10ミリメートル四方に切ります。慎重に任意の気泡を排出するために、イメージング媒体の上部に膜を適用します。
その後、膜の輪郭の井戸の周りにハロカーボン油の薄い層でチャンバーを密閉します。反転顕微鏡のスライドホルダーにイメージング設定を置き、40Xの目的を使用します。野生型卵室の卵母細胞核の移動は、ライブイメージング顕微鏡を用いて捕捉した。
核は、2つの原形質膜の交点で最終的な位置に到達するために軌道に沿ってスライドする前に、前形質膜または横形形質膜のいずれかに達する。膜の変形、組織化されていない濾胞細胞、スタント細胞、および縮んだ核は、死にかけている卵室の最初の徴候である。8時間のイメージング前の脱退卵卵細胞は、通常は検出されない。
しかし、初期変性のまれなケースは、解剖または取り付けステップ中の問題によるものです。卵室にダメージを与えると、その生存が損なう。だから繊細な手の精密解剖とマイクロチャンバーの準備が最も重要です。
この手順により、卵母細胞核は移動中に3つの異なる軌道を取ることができ、異なるオルガネラが卵母細胞内のこれらの軌道を調節できることを視覚化することができました。
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概要
このプロトコルは、生きたイメージング顕微鏡を通じてショウジョウバエの卵母細胞核移動を観察する方法を詳細に説明しています。この技術により、解剖された卵巣卵室を12時間維持し、複数位置からの3Dタイムラプスムービーを撮影することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- ショウジョウバエは卵形成の研究モデルとして機能します。
- 微小管依存性の移動は卵母細胞の発達に不可欠です。
- 生きたイメージング技術は、動的な細胞プロセスの理解を深めます。
- 長期のイメージングのために卵巣卵室の生存率を維持することが重要です。
研究の目的
- 卵母細胞核移動の生きたイメージングのためのプロトコルを開発すること。
- 観察中に卵巣卵室を長期間生きたまま維持すること。
- 詳細なイメージングのためにスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用すること。
使用された方法
- インスリンと胎児ウシ血清を補充したSchneider Mediumの調製。
- 安定したイメージング環境を作るためにシリコングリースを塗布。
- イメージングのために卵巣卵室を得るためにメスのハエを解剖。
- タイムラプスムービーを撮影するためにスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用。
主要な結果
- イメージング中に12時間にわたる卵巣卵室の維持に成功。
- 卵母細胞核移動プロセスの明確な視覚化。
- 生きたイメージング技術の有効性の実証。
- ショウジョウバエの発生生物学の理解への貢献。
結論
- このプロトコルにより、卵母細胞のダイナミクスの詳細な観察が可能になります。
- 生きたイメージングは細胞移動メカニズムへの洞察を提供します。
- この方法はショウジョウバエの他の生物学的プロセスにも適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding nuclear migration dynamics in model systems like Drosophila oocytes provides foundational insights into cytoskeletal regulation and intracellular transport mechanisms relevant to target validation in cell-based assays. Live imaging of 3D organelle movement enables mechanistic de-risking of hypotheses involving motor proteins, microtubule stability, or polarity establishment—key considerations in early discovery where phenotypic screening relies on subcellular readouts. This approach supports predictive confidence by linking molecular perturbations to observable, quantifiable cellular behaviors in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cytoskeletal regulators and nuclear positioning proteins through direct visualization of migration trajectories.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating genetic or pharmacological perturbations with alterations in 3D nuclear movement patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by providing quantitative, time-resolved readouts of nuclear position and migration kinetics in a controlled, long-term imaging environment.
- Operational Value: Enhances screening readiness through reproducible chamber preparation and stable viability of Drosophila egg chambers for up to 12 hours, enabling multi-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to study polarity defects linked to developmental disorders, supporting translational biomarker exploration via correlation of nuclear mislocalization with phenotypic outcomes.
- Operational Value: Promotes translational continuity by allowing discovery-phase findings to be validated in a genetically tractable, live-imaging-compatible model before mammalian system translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through assay optimization to preclinical validation, particularly when nuclear dynamics or cytoskeletal function are central to the mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by visualizing how specific gene knockdowns or compound treatments alter nuclear migration in real time.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chamber setup and quantitative 3D tracking of nuclear position as a functional readout for compound effects.
- Analytics: Generates measurable outputs such as migration velocity, trajectory choice, and final nuclear positioning, which can be statistically compared across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing a causal link between nuclear positioning defects and developmental phenotypes, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying intracellular transport, organelle positioning, or polarity establishment across multiple projects in developmental and cell biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing ambiguity in how molecular interventions affect subcellular organization and dynamics.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility via a validated chamber preparation protocol that maintains tissue viability for extended live imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, observable phenotypic anchors for targets involved in cytoskeletal regulation or intracellular transport.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated impact on nuclear migration, a process linked to cell fate and developmental integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection, live imaging microscopy, and fluorescent sample preparation.
- Depends on access to spinning-disk confocal or equivalent long-term 3D imaging systems with environmental control.
- Necessitates standardization of chamber sealing and medium composition across teams to ensure consistent egg chamber survival.
- Involves adaptation considerations when applying the chamber system to other tissue types or developmental stages beyond mid-oogenesis.
- Limited by the physiological relevance of Drosophila to human disease, necessitating orthogonal validation in mammalian systems for translational targets.
