ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング
2021年7月16日
ここでは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能性と神経疾患や治療におけるグリア細胞を含むメカニズムを研究するために、神経様組織をバイオファブリケートするための3Dバイオプリン皮質アストロサイトの方法を報告する。
アストロサイトの3Dバイオプリンティングは、神経組織工学の進歩を表し、神経疾患に関与するメカニズムを理解するのに有用なインビトロモデルのバイオファブリケーションを可能にする。3Dバイオプリンティングの主な利点は、組織の生化学的および機械的特徴を模倣する細胞補助構造をバイオファブリケートし、健康と疾患における細胞ダイナミクスをよりよく理解することです。このプロトコルは、天然ポリマーと細胞外マトリックス成分で構成されるバイオインクの3Dバイオプリンティングに基づいているため、他の軟組織のバイオファブリケーションに適用できます。
まず、安楽死させたマウスから分離した皮質組織を、湾曲したマイクロハサミで小片に切り取ります。上下にピペットを入れ、1ミリリットルのHBSSで組織片を3回洗います。3回目に添加したHBSSを取り除いた後、0.05%トリプシンの1ミリリットルを加え、37°Cで5分間組織をインキュベートします。
機械的組織解離の場合、トリプシン混合物を15回上下に静かにピペットします。次に、解離した混合物を15ミリリットルの円錐管に移し、同量のFBSを加えてトリプシン活性を中和する。0.4マイクロメートルの細胞ストレーナーフィルターを通して懸濁液をフィルターし、解約されていない断片を除去します。
フィルターを1ミリリットルのアストロサイト培地で洗います。遠心分離によって濾過された細胞懸濁液を下にペレット。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に懸濁させる。
細胞懸濁液をT25培養フラスコに移す。3.5ミリリットルの総培地量を構成し、37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終濃度でフィブリノーゲンを得るために、ゼラチンゼラチンメタクリロイル溶液に1ミリリットルフィブリノーゲン溶液あたり10ミリグラムの0.9ミリリットルを移す。
体積で0.5%重量の最終的な濃度で写真のイニシエーターを得るために、調製されたゼラチンゼラチンメタクリロイルフィブリノーゲン溶液に0.015グラムの写真のイニシエーターを加えます。ボルテックス後、溶液を40°Cに保ち、PIの劣化を防ぐために光から保護します。次に、0.2マイクロメートルのフィルターを通して溶液を無菌15ミリリットルの円錐管にフィルターします。
生体材料溶液980マイクロリットルを15ミリリットルの円錐チューブに移します。1ミリリットル当たり2マイクログラムの最終濃度でラミニンを得るために、バイオインクを含むチューブに希釈ラミニンを20マイクロリットル加えます。上下にピペットを入れて穏やかに混ぜ、泡を避け、細胞と混合する準備ができるまでバイオインク溶液を摂氏37度に保ちます。
0.05%トリプシンで1次アストロサイトを5分間トリプシンし、FPSでトリプシン活性を1対1の割合で中和する。その後、細胞を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、遠心分離機を200倍Gで5分間移動させる。細胞を数えた後、実演したように、6細胞に10回10回移して、異なる円錐形チューブと遠心分離機を作り出した。
上清の200マイクロリットルのみをチューブに残し、円錐管の底部を軽くタップして細胞ペレットを吊り下げます。1ミリリットル当たり6細胞に10倍の最終濃度を得るために、ゼラチンゼラチン・メタクリロイル・フィブリノゲン溶液を細胞を含むチューブに1ミリリットル移動し、上下に軽くピペッティングして均質化する。1000マイクロリットルピペットを使用して、ゼラチンゼラチンメタクリロイルヒビロイジェンバイオインク溶液に置かれたアストロサイトを5ミリリットルのプラスチックシリンジにゆっくりと移し、泡形成を避けます。
滅菌22ゲージの鈍い針を注射器に接続します。バイオプリンターを15分間UV光に当て、70%エタノールでバイオプリンターを拭き取り、シリンジをバイオプリンターのプリントヘッドに接続し、バイオインクを手動でフラッシュして残りの気泡を取り除きます。バイオプリンティングを行うために、バイオプリンターテーブルの上に35ミリメートルの培養皿に置き、針の動きを可能にするために培養皿表面から0.1ミリメートル離れた場所に針を置き、印刷ボタンを押します。
バイオプリンティングが終わったら、シリンジが皿から離れ、文化の皿を閉じてください。ゼラチンメタクリロイル架橋用UV光の下に培養皿を置きます。滅菌スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを24ウェルプレートに移します。
500マイクロリットルのトロンビン塩化カルシウム溶液を加え、30分間放置してフィブリン架橋を可能にします。架橋液を取り除いた後、2ミリリットルのPBSで構築物を洗浄し、次にPBSを1ミリリットルのアストロサイト培養培地に置き換える。摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。
スパチュラを使用して、バイオプリントコンストラクトを35ミリメートル培養皿に移します。PBSの1ミリリットルで構造を洗います。100マイクロリットルの生きた死んだ試薬をコンストラクトの上に入れ、37°Cで30分間保ち、光から保護します。
生死んだ試薬を取り除いた後、実演したようにPBSで構造を洗浄する。サンプルを共焦点皿に移し、画像取得のために488および570ナノメートルの励起を使用して共焦点顕微鏡の下で構築物内の細胞を観察する。3Dバイオプリンティングの後、バイオプリント足場の完全性が推定され、生体材料内に閉じ込められた細胞で明確に定義された構造の形成が観察された。
バイオプリンティングと架橋プロセスの後、ほとんどの細胞は、構築物がアストロサイト培地でインキュベートされたときに丸い形態を提示した。バイオプリントされた足場は、7日間のインキュベーションの後に完全性を維持し、いくつかの丸い細胞が観察されたが、多くのアストロサイトが構造全体に広がり、天文学的形態および相互接続を提示した。細胞の生存率は、バイオプリンティング直後に評価され、結果的に、より低速で、生存可能な細胞は、全細胞の74%まで表され、より高速でバイオプリントされた細胞よりも有意に高いことを示した。
バイオプリントアストロサイトの生存率は2D培養アストロサイトに正規化され、その結果、7日目にバイオプリントアストロサイトが有意に生存率を増加させたことが示された。バイオプリンティングの直後、アストロサイトは丸い形態と生死んだアッセイを示した。1週間後、アストロサイトは構築物全体に広がり、2D培養と同一の細胞の明確な形態を提示した。
3Dバイオプリントアストロサイトは、免疫蛍光によって特徴付けられていた。バイオプリント構築物における7日間のインキュベーションの後、星状形態を有する非常に高密度のアストロサイトが観察された。バイオプリントアストロサイト細胞は、7日間のバイオプリンティング後の星状表現型の保持を示す特定のアストロサイトマーカーグリア線維酸性タンパク質を示し、これらの結果は、バイオインク組成物がアストロサイトの接着、広がりおよび成長を促進するために生体適合性微小環境を提供したことを示している。
バイオプリントアストロサイトによる特異的遺伝子および細胞マーカー発現の評価は、特定の刺激に続くアストロサイトル反応性などの神経組織様機能の証拠を提供するであろう。このプロトコルは、生体分子内の異なるタイプの細胞で構成されるより複雑な神経様構造のバイオファブリケーションへの道を開き、特定の神経原性ニッチの模倣を可能にする。
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概要
この記事では、マウスの皮質アストロサイトを3Dバイオプリンティングして神経様の組織を作成する方法を紹介します。このアプローチは、中枢神経系におけるアストロサイトの機能と神経学的疾患におけるその役割の研究に役立ちます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 組織工学
- 細胞生物学
背景
- 3Dバイオプリンティングは神経組織工学を進歩させます。
- in vitroモデルは神経学的疾患のメカニズムを理解するのに役立ちます。
- バイオファブリケーションは生化学的および機械的組織特性を模倣します。
- プロトコルは他の軟組織にも適用可能です。
研究目的
- アストロサイトを使用して神経様の組織をバイオファブリケートすること。
- 健康と疾患におけるアストロサイトの機能を探索すること。
- 神経学的状態におけるグリア細胞のメカニズムを調査すること。
使用された方法
- 安楽死したマウスから皮質組織を分離すること。
- 処理のために組織を小さな断片に切ること。
- HBSS溶液で組織を洗浄すること。
- バイオプリンティングの準備のためにトリプシンでインキュベートすること。
主な結果
- アストロサイトベースの組織の成功的なバイオファブリケーション。
- 神経学的文脈における細胞ダイナミクスの理解の改善。
- 様々な神経学的疾患の研究における潜在的な応用。
- 組織工学における3Dバイオプリンティングの利点のデモンストレーション。
結論
- 3Dバイオプリンティングは神経組織工学にとって貴重なツールです。
- バイオファブリケートされたモデルはアストロサイトの研究を強化できます。
- この方法は神経学的治療法のより良い洞察につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables the creation of physiologically relevant in vitro models of astrocytes, supporting mechanistic de-risking in early-stage neuroscience target validation. By providing a reproducible 3D microenvironment that maintains astrocytic phenotype and function, it enhances predictive confidence in preclinical studies of neurological disorders. The approach addresses a key discovery-stage challenge: the lack of translatable cellular models that recapitulate glial-neuronal interactions in health and disease.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of astrocyte-mediated pathways in neuroinflammation and neurodegeneration.
- Operational Value: Provides a standardized system for assessing target engagement in glial cells.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening by maintaining GFAP expression and astrocytic morphology over time.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers a biomaterial platform compatible with live/dead viability and immunofluorescence readouts.
- Quantitative Output: Enables measurement of astrocyte viability (74.08% post-print, increasing to 83.54% at 7 days) as a biomarker of microenvironment suitability.
- Scalability: Uses extrusion-based bioprinting adaptable to multi-well formats for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models astrocytic reactivity, a key feature in neurological injury and disease progression.
- Translational Continuity: Maintains stellate morphology and GFAP expression, supporting extrapolation to in vivo glial responses.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of candidate compounds on astrocyte adhesion, spread, and network formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for CNS targets where glial modulation is relevant.
- Discovery Biology: Supports functional validation of astrocyte-specific targets in a 3D context.
- Screening: Enables standardized, reproducible plating of bioactive constructs for dose-response assays.
- Analytics: Provides confocal-compatible readouts for morphological and marker-based analysis (e.g., GFAP+ cell density).
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by preserving astrocyte phenotype.
- Enterprise Reuse: The bioink formulation (gelatin/GelMA/fibrinogen/laminin) is adaptable to other neural or soft tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation through phenotype-stable, long-term culture.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized cell sourcing (passage ≤3) and bioink mixing ratios.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of off-target glial effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CNS drug candidates with glial modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and sterile 3D bioprinting techniques.
- Depends on extrusion bioprinter, UV crosslinking system, and confocal microscopy for validation.
- Necessitates standardization of bioink preparation across batches to ensure consistent mechanical and biochemical properties.
- Adaptation to human iPSC-derived astrocytes may require optimization of enzymatic dissociation and culture conditions.
- Limited by murine cell source; species translation should be validated for human-relevant applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:49
Astrocyte Isolation and Culture
2:06
Astrocytes-laden Gelatin/GelMA/Fibrinogen Bioink Preparation
4:01
Bioprinting Syringe Preparation and Bioprinting
4:58
Bioprinted Construct and Culture Crosslinking
5:40
Astrocytes Viability Assessment
6:22
Results: 3D Bioprinted Astrocyte Cell Viability and Morphology Assessment
8:15
Conclusion
