Name: 神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ神経堤細胞の機械的信号研究法。O9-1細胞とポリアクリルアミドヒドロゲルを用い、細胞培養と免疫蛍光染色で力学的・化学的信号相互作用を解析。神経堤細胞の発生機構と疾患関連分子メカニズムの解明に貢献します。

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テキサス大学ヘルスサイエンスセンターの原子間力顕微鏡-UTコア施設の運営者であるアナ・マリア・ザスケ博士は、このプロジェクトでAFMに貢献した専門知識を持ってくれたことに感謝します。また、国立衛生研究所(K01DE026561、R03DE025873、R01DE029014、R56HL142704、R01HL142704)からJ.Wangへの資金源に感謝します。

1. ヒドロゲル調製物
注:すべてのステップは、無菌を維持するために使用する前にエタノールと紫外線(UV)滅菌で消毒された細胞培養フードで行う必要があります。ピンセットやピペットなどの工具にはエタノールを散布する必要があります。緩衝液はまた無菌濾過されなければならない。
<ol><li>アミノシランコーティングガラスカバーリップの調製<ol>
<li>所望の数のガラスカバーリップを実験室のワイプの上に置きます。 注:3~4カバーリップを追加準備して、バックアップ用品が壊れやすいように十分なバックアップを確保してください。ガラスカバーリップの異なる材料は、細胞の播種と取り付けの異なる互換性をもたらすでしょう。実験を開始する前に、どのタイプが実験に最も適しているかを判断することをお 勧めします(材料表を参照)。</li>
		<li>アルコールバーナーまたはブンゼンバーナーを使用して、各カバースリップを炎を通して行ったり来たりして滅菌します(タンパク質アッセイ実験では30s)。各ガラスカバースリップを実験室のワイプに置いて冷まします。</li>
		<li>ガラスカバーリップが冷却されたら、滑りを防ぐためにパラフィルムが並ぶペトリ皿に移します。 注: カバーリップが十分に冷え込んでいない場合、残熱はパラフィルムをスリップに溶かし、使用できなくなります。</li>
		<li>カバーリップを約200 μL、800 μLの0.1 M NaOHをそれぞれ12 mmと25mmのカバースリップで覆い、5分間座らせます。その後、0.1 M NaOHを吸引し、カバーリップをさらに5分間空気乾燥させて均一なフィルムを形成します。</li>
		<li>カバーリップを乾燥させた後、ピペットは3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTS)の約80 μLと150 μLをそれぞれ12mmおよび25mmのカバーリップに対して行います。パラフィルムに溶液をこぼさないように注意してください。ソリューションを5分間座ります。</li>
		<li>できるだけ過剰なAPTSを吸引し、残留APTSを5分間乾燥させます。カバーリップを滅菌、脱イオン化(DI)H2 Oに3回、毎回5分間に沈めることで十分にリンスします。 注:ガラスカバーリップがうまくすすい込まない場合、残留APTSはグルタルアルデヒドとの望ましくない反応を引き起こし、白い沈殿物を形成し、使用できないカバーリップを生じさせる。</li>
		<li>反応性の側面を上に向けた新しいペトリ皿にカバーリップを移動します。ペトリ皿に0.5%のグルタルアルデヒドを加えてカバーリップを完全に覆い、カバーリップを30分間座させます。</li>
		<li>0.5%グルタルアルデヒドを吸引し、3分間DI H2Oで再度カバーリップをすすいします。使用する前に、実験室のワイプまたはきれいなペトリ皿にカバーリップ反応性の側面を完全に空気乾燥するように設定します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。カバーリップは、使用するまで生殖不能DI H2Oに配置する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>シリコン化カバーリップの調製<ol>
<li>パラフィルムが並ぶペトリ皿に、アミノシランコーティングされたカバーリップ(ステップ1.1.1)と同じ数のカバーリップを入れます。</li>
		<li>ピペット40 μLまたは150 μLは、それぞれ12mmおよび25mmのカバーリップをカバースリップの片側にジクロロメチルシラン(DCMS)し、溶液を5分間座らせる。</li>
		<li>残りの溶液をカバースリップから吸引し、滅菌DI H2Oで1分間洗浄し、反応性カバーリップを実験室のワイプの上に置いて完全に空気乾燥してから次のステップに進みます。</li>
	</ol></li>
	<li>ヒドロゲルの準備<ol><li>アクリルアミド、ビスアクリルアミド、およびDIH2Oを1.5 mL遠心分離チューブに混合し、様々な剛性を有する500μLの溶液を調製する( 表1参照)。30 sの溶液を完全に混合するボルテックス。</li>
		<li>迅速に作業し、10%過硫酸アンモニウム溶液(APS)とテトラメチルエチレンアミン(TEMED)をチューブに加え、溶液を再び渦液に添加して溶液を混合します。 注:新鮮な10%APSを準備し、氷の上に残すか、その敏感な凍結/解凍サイクルのために単独使用のアリコートに凍結します。</li>
		<li>ピペットは、乾燥した12mmまたは25mmのアミノシランコーティングカバーリップ(セクション1.1)に溶液の約33μLまたは100 μLをそれぞれ塗布した。</li>
		<li>湾曲したピンセットを使用して、処理側がゲル溶液に触れるゲル溶液の上にDCMS処理カバースリップを直ちに置き、DCMS処理カバースリップとアミノシランコーティングカバースリップの間にゲル溶液を挟みます。</li>
		<li>ゲル溶液を5~15分間重合させ、チューブ内の残った溶液のゲル重合を積極的にモニタリングします。</li>
		<li>ゲルを重合したら、曲面ピンセットまたはカミソリの刃でDCMS処理カバースリップを分離し、ゲルを元のアミノシランコーティングカバースリップに取り付けたままにします。</li>
		<li>500 μL と 2 mL の無菌 PBS または DI H2O で覆われた所定の 4 ウェル/24 ウェルプレートと 6 ウェル プレートに、取り付けられたヒドロゲルを付けたカバースリップを 12 mm および 25 mm のカバーリップに対して、それぞれ 12 mm および 25 mm のカバーリップでカバースリップし、ゲルが乾燥するのを防ぎます。</li>
		<li>すべてのカバーリップについて、手順 1.3.4 ~ 1.3.7 を繰り返します。</li>
		<li>ヒドロゲルを30分間無菌PBSまたはDIH2Oに沈水し、過剰なアクリルアミド溶液を除去する。ヒドロゲルを滅菌PBSまたはDI H2Oで4°Cで保管し、ここで手続き停止を行います。</li>
		<li>暗い部屋で、スルフォスハチニミジル6-(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルフォ-SANPAH)混合物を50mM 2-[4-2の2.5 mL混合して準備する (2-ヒドロキイェチン-1-イル)エタンスルホン酸(HEPES)(pH=8.5)の25 μLを円錐形チューブに50 μg/mLスルフォ-SANPAH、 光から保護するためにアルミ箔で包みます。使用する前に、溶液をよく混ぜるためにピペットを使用してください。 注:スルフォ-SANPAH溶液の容積は約25の12のmmヒドロゲルか5つの25のmmヒドロゲルのために十分である。</li>
		<li>ウェルプレートからPBSまたはDIH2Oを吸引する。スルフォ-SANPAH溶液(ステップ1.3.10)のカバーリップを12mmと25mmに約100μLまたは500 μLずつ加え、ゲルを覆います。溶液がゲル全体を覆っていることを確認してください。 注: 吸引力が強くてヒドロゲルを引き裂いたり、邪魔したりしないように真空吸引強度を調整します。</li>
		<li>15 W、365 nmのUV光の下にゲルを10分間、スルフォ-SANPAHと反応するUV光の干渉を最小限に抑えるように覆い隠します。</li>
		<li>余分なスルホ-SANPAHを、できるだけ多くの溶液を集めるためにプレートを傾けて吸引する。ゲルを50 mM HEPESで2~3回洗浄します。</li>
		<li>500 μL と 2 mL を 12 mm と 25 mm のゲルにそれぞれ加え、50 mg/mL のコラーゲン I を 0.2% 酢酸で希釈し、ヒドロゲルを含む各ウェルにします。ゲルを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。 注:50 mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸でコラーゲンIを希釈し、均質な分布とコラーゲンIの付着を促進します。</li>
		<li>コラーゲンIを吸引し、滅菌PBSでゲルを3回洗浄し、1回5分間余分なコラーゲンIを除去する。ヒドロゲルを10%馬血清でPBSにインキュベートし、37°Cで2時間5%FBS、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。 注:10%馬の血清を添加すると、前の出版物で行われたFBSのみを使用するのと比較して、より高い増殖を促進します。</li>
		<li>培地を吸引する。10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシン(P/S)を備えた無菌フィルターのDulbeccoの修正イーグルミディアム(DMEM)を500 mLずつ加えます。ゲルを37°C、5%CO2インキュベーターに保存し、細胞培養の準備が整うまで保管します。</li>
		<li>準備ができたら、約1.5×104 O9-1細胞/cm2を培養皿の基底培地に入れる。37°C、5%CO2でインキュベーターに2日間細胞をインキュベートする。細胞が合流していることを確認し、細胞がゲルに十分に結合していること、および細胞の数が分析のために収集される前に十分であることを確認します。 注: O9-1 セル20の回復、通過、および収集の手順については、以前に公開されたプロトコルを参照してください。</li>
		<li>ヒドロゲルのさらなる分析のためにセクション2、3、または4に進みます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. AFMによる剛性の定量的分析
<ol><li>AFM システム コンピュータを起動し、AFM コントローラを起動します ( 資料一覧を参照)。</li>
	<li>AFMプローブホルダーにAFMカンチレバーを取り付けます。カンチレバーの端部に0.5 μmのシリカビーズを取り付けた球形の片持ち体(球形ビーズ付き片持ちレバー)を使用してください。 注: 10 kPa、20 kPa、40 kPa などの硬質ヒドロゲルの場合、スプリング定数 0.24 N/m の硬いプローブが使用されました。より柔らかいプローブは、0.5 kPaや1 kPaなどの柔らかいヒドロゲルに使用され、ばね定数は0.059 N/mでした。</li>
	<li>AFM ソフトウェアを 接触モードで設定します。</li>
	<li>シリコンウェーハをAFMサンプルステージに取り付け、カンチレバーがシリコン基板に触れる 際にEngage をクリックして力曲線を収集し、力曲線を生成します。</li>
	<li>キャリブレーションには上記の力曲線(2.4)を使用し、制御ソフトウェアで [較正] をクリックして、熱調整条件下でカンチレバーの平均ばね定数を取得し、校正された値を制御ソフトウェアに保存します。</li>
	<li>60 mm ペトリ皿に取り付けたヒドロゲルを含むカバースリップを AFM スキャンステージに取り付けて、サンプルを取り付けます。測定を行う前にPBSを3 mL加えて、ゲルが乾燥するのを防ぎます。</li>
	<li>AFMを 接触モード (流体)で動作するように設定して、測定を開始します。球形のビーズを引き付けて、ゲルサンプルに連続的に触れて持ち上げます。</li>
	<li>片持ちのしきい値が 10 nm に保たるように設定します。プローブのランプサイズを10μmに保ちます。次に、ステップ 2.4 のように力のカーブを記録します。</li>
	<li>ヒドロゲルの表面を横切る少なくとも3〜10の異なるスポットから少なくとも20の力曲線を獲得する。</li>
	<li>AFMイメージングおよび解析ソフトウェアを使用して、各スポットの平均ヤング率〜20フォース曲線を計算します。拡張ランプフォースカーブと線形化モデル(球面)を使用します。各サンプルのすべてのスポットの平均を計算して、最終的な剛性を得る。 注: ヤング率と関連データ(標準偏差 )は、自動的にスプレッドシートとして保存されます。</li>
	<li>すべてのサンプルについて、手順 2.6 ~ 2.10 を繰り返します。</li>
</ol>免疫蛍光染色による剛性の分子解析
<ol><li>ピンセットを使用してカバースリップを新しいプレートに輸送し、プレート上で直接成長した細胞からの偽信号を最小限に抑えます。500 μLの無菌PBSで細胞を3回洗浄し、死んだ細胞および残った培養培地を除去します。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)の500 μLを室温で10分間、邪魔されずに500 μLで固定します。次いで、500μLのPBS/ウェルをそれぞれ2分間使用して細胞を3回再洗浄します。 注意:手続き停止のために4°Cで保管してください。</li>
	<li>500 μLのトリトン X-100 を室温で 15 分間処理します。その後、500μLのPBS/ウェルで細胞を3回洗浄します。</li>
	<li>250 μLのロバ血清(PBSで希釈し、Tween 20)を1ウェルあたり30分間、室温で30分間ブロックします。</li>
	<li>250 μLの一次抗体を室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 その後、500 μLのPBS/ウェルで細胞を5分間3回洗浄します。 注:抗ビンクリン(Vcl)(1:250)および抗AP2アルファ(1:250)は、この実験で使用され、10%ロバ血清に希釈されました。</li>
	<li>20%ロバ血清10%の10%の10%のmlの150 μLの1:400の希釈でFアクチン染色に使用される対応する二次抗体および/またはファロインと共に細胞を室温で30分間インキュベートする。次いで、細胞をPBSで3回、それぞれ5分間洗浄する。 注:568 nmファロイジンは、488 nmまたは647 nmの二次抗体またはそれ自身で共インキュベートすることができます。</li>
	<li>PBSの250 μLで4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI、1:1000希釈)で細胞を10分間インキュベートし、最後にPBSを2分間洗浄します。</li>
	<li>取り付け媒体を3~4滴ずつ取り付けます。サンプルを4°Cに保存して、イメージングの前に少なくとも2時間セットし、取り付け媒体が正しく設定されていることを確認します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡でヒドロゲルサンプルあたり少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャし、個々のチャネルと結合されたチャネルを生成します。</li>
</ol>4. 定量リアルタイム PCR (RT-qPCR)
<ol><li>RNA採取用の付着細胞を含むヒドロゲルを新しいプレートに移し、細胞プレートに結合した細胞からの不要なRNAを最小限に抑えます。細胞をPBSで3回洗浄し、死細胞や培養培地を除去します。</li>
	<li>RNA抽出キットを使用して合計mRNAを抽出します。メーカーの指示に従って逆転写スーパーミックスを使用してRNAからcDNAへの逆転写を行います。</li>
	<li>選択した剛性マーカーとして Vcl のプライマーでRT-qPCRを行い、2-ΔΔCT 法を用いて分析します。 注:Vclのプライマーシーケンス:フォワード5' GCTTCAGTCAGACCCATCG 3';逆 5' AGGTAAGCAGTCAATGT 3' .</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

現在の研究の目的は、NCCにおける機械的信号の影響をよりよく理解するための効果的かつ効率的な インビトロ システムを提供することです。上記のステップバイステップのプロトコルに従うだけでなく、研究者はO9-1 NCCの細胞培養がヒドロゲルの調製に使用されるガラスカバーリップの種類によって影響を受けることを覚えておいてください。例えば、特定のタイプのガラスカバースリップに播種された細胞( 材料表を参照)は生き残り、増殖が良好であり、他のタイプのガラスカバーリップに播種された培養細胞はより多くの細胞死を示した。さらに、O9-1 NCC38の正しい細胞培養条件に厳密に従うことが重要です。細胞培養の品質は、ヒドロゲルをできるだけ早く使用する場合、または滅菌37°Cインキュベーターに最大2日間保存する場合に最適です。
プロトコルの各コンポーネントの感度により、弾性率は実験によって異なる可能性があります。10% APS に関するプロトコル(ステップ 1.3.2)に記載されている点に加えて、考慮すべ...

神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物胚発生時の幹細胞群であり、様々な臓器や組織の発達に寄与する著しい能力を有する。NCCは、NCC1,2の軸方向起点の位置や局所的環境誘導に応じて、感覚ニューロン、軟骨、骨、メラノサイト、平滑筋細胞を含む異なる細胞タイプに分化することができる。広範囲の細胞型に分化する能力を持つ、神経堤(NC)の発達の任意の段階で調節不全を引き起こす遺伝的異常は、多数の先天性疾患に至る可能性がある2。例えば、NCCの形成、移動、および発達中の摂動は、神経経皮症1,3として総称して知られる発達障害につながる。これらの疾患は、NCC形成における障害による頭蓋顔面欠損(トレチャー・コリンズ症候群など)から、黒色腫3、4、5、6に見られるようにNCC転移性回遊能力に起因する様々な癌の発症まで多岐にわたる。過去数十年にわたり、研究者は開発および疾患におけるNCCの役割とメカニズムについて顕著な発見を行い、その大半は化学信号7,8に焦点を当てています。最近では、機械的信号は、NCC開発9、10において重要だが十分に理解されていない役割を果たしていることが示されている。
NCCの環境的な手掛かりは、NCC分化を様々な細胞タイプに規制するなど、開発中に重要な役割を果たします。環境の手掛かり、例えば、物理的な手がかりは、機能多様化などの極めて重要な行動および細胞応答に影響を与える。メカノトランスダクションは、細胞が様々な生物学的プロセスを維持するためにそれらの手がかりを感知し、応答することを可能にする2.NCCは、隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)のような異なる基質に囲まれており、恒常性を維持し、運命決定、増殖、およびアポトーシス11を通じて変化に適応するために機械的刺激を生じさせることができる。メカノトランスダクションは、機械的細胞外刺激の感覚成分が生じる形質膜から始まり、細胞12の細胞内調節をもたらす。インテグリン、焦点接着、および、剪断力、応力、および周囲の基質の剛性などの機械的信号を、細胞応答12を生成する化学信号に、プラズマ膜リレーの接合部。細胞膜から最終的な細胞調節への化学信号の中継は、分化などの生物の重要なプロセスを確定するために異なるシグナル伝達経路を介して行われます。
いくつかの研究は、基質剛性からの機械的シグナル伝達が細胞分化13、14に役割を果たしていることを示唆している。例えば、これまでの研究では、脳組織と同様の硬直性を有する軟質基質上で成長した間葉系幹細胞(MCC)(0.1〜1.0kPa)が神経細胞分化15,16を生じることが示されている。しかし、筋肉の剛性を模倣した8-17 kPa基質上で増殖するとより多くのMSCが筋細胞様細胞に分化し、一方、MSCを硬質基質上で培養した際に骨芽細胞様分化が観察された(25-40kPa)15,16。メカノトランスダクションの意義は、癌、心血管疾患、骨粗鬆症17、18、19を含む重篤な発達上の欠陥および疾患につながる可能性のある機械的シグナル伝達経路の不規則性および異常によって強調される。癌では、正常な乳房組織は軟らかく、乳房癌のリスクは、硬く、密な乳房組織、乳房腫瘍15に似た環境において増加する。この知見により、生体信号がNCC開発に及ぼす影響を、in vitroシステムを通じて基質剛性を簡単に操作することで研究することができ、NC関連疾患の進行と病因の基礎を理解する上でさらなる利点と可能性を提供します。
NCCにおける機械的信号の影響を調べ、従来公表された方法の最適化と異なる機械的信号20,21に対するNCCの応答評価に基づくNCCの効率的なインビトロシステムを確立した。ヒドロゲルの剛性の調製とNCCにおける機械的シグナリングの影響の評価を行うための詳細なプロトコルが提供されました。これを達成するために、O9-1 NCCは、硬い対ソフトヒドロゲルに応答して効果と変化を研究するためにNCモデルとして利用されています。O9-1 NCCは、8.5日目にマウス胚(E)から分離された安定したNC細胞株です。O9-1 NCC は、定義された分化メディア22の各種 NC 由来細胞タイプに分化できるため、インビボで NCC を模倣しています。NCCの機械的シグナル伝達を研究するために、マトリックス基質を、所望の剛性を達成するために、所望の剛性を達成するために、アクリルアミドおよびビスアクリルアミド溶液の様々な濃度から調整可能な弾性で作製した、生物学的基質剛性20、21、23と相関する。NCC用マトリックス基板の条件を最適化するために、具体的にはO9-1細胞は、以前に公開されたプロトコル20から改変を行った。このプロトコルで行われた1つの変更は、コラーゲンIのヒドロゲルをインキュベートし、50mM HEPESの代わりに0.2%の酢酸に希釈し、一晩で37°Cで行った。酢酸の低pHは均質な分布と高いコラーゲンIの組み込みをもたらし、したがってECMタンパク質24のより均一な付着を可能にする。また、ウシ胎児血清(FBS)との組み合わせは、インキュベーターにヒドロゲルを貯蔵する前に、それぞれリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)で10%および5%の濃度で使用した。10%25の濃度で細胞増殖および分化を促進する能力のために、FBSへの追加サプリメントとして馬血清を使用した。
この方法により、生物環境をECMタンパク質コーティング(例えば、コラーゲンI)によって模倣し、NCCが成長し、20,21を生き残るための正確なインビトロ環境を作り出した。調製されたヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を介して定量的に分析した、弾性率26を描写するよく知られた技術である。NCCに対する異なる剛性レベルの影響を研究するために、野生型O9-1細胞を培養し、フィラメントアクチン(F-アクチン)に対する免疫蛍光(IF)染色用のヒドロゲルに調製し、基質剛性の変化に応じて細胞接着および形態の違いを示した。このインビトロシステムを利用して、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と他の化学信号との相互作用を研究し、NCCと機械的シグナル伝達の関係を深く理解することができます。

<table><tbody><tr><td>12 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-012</td><td></td></tr><tr><td>2% ビスアクリルアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662165</td><td></td></tr><tr><td>25 mm #1 Corning 0211 Glass Coverslip</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1763-025</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>4 ウェル細胞培養プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>J61899-AP</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>50% グルタルアルデヒド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7651</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>AFMカンチレバー(球状ビーズ)</td><td>Novascan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFMソフトウェア</td><td>Catalyst NanoScope</td><td></td><td>モデル:8.15 SR3R1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>248614</td><td>Powder</td></tr><tr><td>anti-AP-2&alpha;抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-12726</td><td></td></tr><tr><td>抗ビンキュリン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab129002</td><td></td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡(AFM) Bioscope Catalyst</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I (100mg)</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメチルシラン(DCMS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>440272</td><td></td></tr><tr><td>ロバ血清</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9663</td><td></td></tr>ダル<tr><td>ベッコ改変イーグルミディアム(DMEM)</td><td>コーニング</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>コーニング</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td>ライ<td>カ</td><td></td><td>モデルDMi8</td></tr><tr><td>フルオロマウント-Gマウントミディアム</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-35</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>パウダー</td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Corning</td><td>35-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>iScript 逆転写 Supermix</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン 抗生物質</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy マイクロキット</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>滅菌 1x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>滅菌脱イオン水</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>U284</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472908</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたo9-1/ヒドロゲルシステム

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

神経堤細胞(NCC)は、さまざまな臓器や組織を生み出す幅広い細胞型に移行し、分化することができる脊椎動物胚多能細胞です。組織の剛性は、機械的な力、NCC分化に重要な役割を果たす物理的な手がかりを生成します。しかし、メカニズムは不明のままです。ここで説明する方法は、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルの最適化された生成、そのような剛性の正確な測定、 および生体NCCを 模倣するNCCラインであるO9-1細胞における機械的信号の影響の評価に関する詳細な情報を提供する。
ヒドロゲルの剛性を原子間力顕微鏡(AFM)を用いて測定し、それに応じて異なる剛性レベルを示した。様々な剛性のヒドロゲルに培養されたO9-1 NCCは、ストレス線維の異なる細胞形態および遺伝子発現を示し、機械的シグナル変化によって引き起こされる生物学的効果が異なっている。さらに、ヒドロゲル剛性を変化させることで、ゲル剛性を変化させ、NCCの分子および遺伝的調節を分析することによって機械的シグナル伝達を操作する効率的な インビトロ システムをもたらしたことが確立 された。したがって、この in vitro システムは、NCCにおける機械的シグナル伝達の役割と化学シグナルとの相互作用を研究するための強力なツールであり、研究者は神経堤の発達と疾患の分子および遺伝的メカニズムをよりよく理解するのに役立ちます。

AFMとヘルツモデルによるヒドロゲル調製と剛性評価 ここでは、アクリルアミドとビスアクリルアミドの比率を調節することによって、様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを生成するための詳細なプロトコルが提供される。しかし、ポリアクリルアミドヒドロゲルは、ECMタンパク質の不足のために細胞の接着の準備ができていません。このように、スルホ-SANPAHは、リンカーとして作用し、ECMタンパク質の一次アミンと共有結合し、ECMタンパク質の一次アミンと反応して、ECMタンパク質の接着を可能にし、UV活性化後のスルフォ-SANPAHの N-ヒドロキシシムチイドエステルを介してヒドロゲルの表面に接着することを可能にする。コラーゲンタイプは、O9-1細胞の付着を効果的に促進するために選択したECMタンパク質として使用された。異なるヒドロゲルの正確な剛性値を確保するために、弾性率を描写する既知の技術であるAFMを使用して剛性評価を行った。
ポリアクリルアミドヒドロゲルをガラスカバースリップにうまく形成し、付着すると、ゲルは表面が均一で最小限の...

多能O9-1神経堤細胞と様々な剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを使用して 、インビトロで 機械的信号を研究するための詳細なステップバイステッププロトコルについて説明します。

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

この方法は、神経堤細胞の機械的シグナル伝達と化学シグナルとの相互作用の研究に役立つ。また、疾患における神経堤の発達の分子および遺伝的メカニズムを助けることができる。ガラスカバースリップを転送することは最も困難であるため、それらを壊して落とさないようにゆっくりと注意深く転送します。この手順を実証することは、私と私の研究室の博士研究員であるシェリー・ジャオ博士です。まず、所望の数のガラスカバースリップを実験室のワイプの上に置くことから始めます。その後、アルコールバーナーの炎を通して前後に通過させることによって、各カバースリップを殺菌します。カバーが冷めると、約200マイクロリットル、25ミリメートルカバースリップでカバースリップをカバーし、800マイクロリットルの0.1モル水酸化ナトリウムをカバーします。5分後、水酸化ナトリウムを吸引し、カバースリップを5分間空気乾燥させて均一なフィルムを形成する。カバースリップが乾燥したら、12ミリメートルカバースリップに約18マイクロリットルのアミノプロピルトリエトキシシランまたはAPTSを加え、25ミリメートルカバースリップにAPTSを150マイクロリットル加えます。吸気アクセスAPTSは、残留APTSが5分間乾燥することを可能にする。その後、滅菌脱イオン水にそれぞれ5分間浸して、カバーを3回すすいでください。洗ったカバースリップを新鮮なペトリ皿に移し、反応性側を上に向けます。そして、カバースリップを30分間十分な0.5%グルタルアルデヒドに浸して治療します。グルタルアルデヒドを吸引した後、カバースリップを脱イオン水で3分間一度すすいで、反応性側を上げてカバースリップを空気乾燥させます。シリコン化カバースリップを準備するには、パラフィルムが並ぶペトリ皿にアミノシランコーティングカバースリップと同数のカバースリップを配置します。その後、12ミリメートルのカバースリップを40マイクロリットルで、25ミリメートルのカバースリップを150マイクロリットルのジクロロメタンシランまたはDCMSで5分間処理します。反応性カバースリップを実験室の拭き取りに上に置く前に、滅菌脱イオン水でカバースリップを1分間1回洗います。ヒドロゲルを調製するために、ピペットは乾燥したアミノシラン被覆伝票上に作りたてのアクリルアミドゲル溶液を作製した。湾曲したピンセットを使用して、処理された側がゲル溶液に触れ、2つのカバースリップ間でゲル溶液を挟み込んで、直ちにDCMS処理カバースリップをゲル溶液の上に移す。ゲルが重合されたら、DCMS処理カバースリップを湾曲したピンセットで分離し、ゲルをアミノシランコーティングカバースリップに取り付けたままにします。次に、12ミリメートルのカバースリップを、500マイクロリットルの無菌PBSまたは脱イオン水で覆われた所定の4ウェルまたは24ウェルプレートに付いたヒドロゲルと共に、2ミリリットルの無菌PBSまたは脱イオン水で覆われた6ウェルプレートに30分間沈殿します。過剰なアクリルアミド溶液を除去した後、ヒドロゲルを滅菌PBSまたは脱イオン水で室温で30分間保存します。その後、ゲルを完全に覆うためにスルフォ・スクシニマイジルまたはスルフォ-SUNPAH溶液を添加する前に、PBSまたはウェルプレートから脱イオン水を吸引した。そして、15ワット、365ナノメートルの紫外線の下に溶液とゲルを10分間覆います。プレートを傾けることによって溶液ごとのSulfo-SANPAHのできるだけ多くを集める。そして、ゲルを15ミリモルHEPESで2〜3回洗浄します。1ミリリットル当たり15ミリグラムを加えるコラーゲン1を0.2%酢酸で希釈し、ヒドロゲルを含む各ウェルに。そして、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩ゲルをインキュベートします。翌日、37°Cおよび5%の二酸化炭素で10%馬血清および5%FBSを含むPBSでヒドロゲルをインキュベートする前に、原稿に記載されているとおりに洗浄を行う。2時間のインキュベーションの後、10%FBSと1%ペニシリンストレプトマイシンを用いた無菌濾過DMEMの500マイクロリットルを各ウェルに加え、ゲルを摂氏37度と5%の二酸化炭素で保存します。細胞培養が整うまで、約10〜4番目の09〜1細胞をバゼル培地で2乗にしてプレートします。ピンセットを使用してカバースリップを新しいプレートに輸送し、プレート上で直接成長した細胞からの偽信号を最小限に抑えます。次いで、500マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを10分間使用して細胞を固定してから、室温で500マイクロリットルの0.1%トリトンX-100で細胞を処理します。15分後、10%ロバ血清の250マイクロリットルで細胞を歩きます。フェロジピンでF-アクチンの細胞を10%ロバ血清の250マイクロリットルで1〜400の希釈で染色し、続いてDAPIを10分間インキュベートする。各ウェルに3〜4滴の取り付け培地を加える前に、PBSで細胞を2分間洗います。蛍光顕微鏡では、個々のチャネルと結合チャネルを生成するヒドロゲルサンプルあたり少なくとも3つのランダムフレームの画像をキャプチャします。原子間力顕微鏡またはAFMによるヒドロゲルの剛性評価では、AFMプローブからの必要な力が少なかったため、力曲線の傾きは軟質ヒドロゲルにとって緩やかであった。しかし、硬いヒドロゲルでは、生成された斜面ははるかに急でした。AFM測定は、ヤングの弾性率からキロパスカルでのヒドロゲルの平均剛性を計算するために使用されました。P19および09-1細胞の増殖特性は、制御および改変ゲル系の1キロパスカルおよび40キロパスカルヒドロゲルで観察された。元のゲル系で増殖した09-1細胞は、死んだ細胞の数が多くなった。対照的に、改変ゲル系で増殖した09-1細胞は、最小限の丸い細胞で示される小さな細胞甲板を有するヒドロゲル基板への健全な細胞増殖および十分な付着を示した。両方のヒドロゲル系にメッキされたP19細胞は、過剰な丸い浮遊細胞と細胞基板のアタッチメントの欠如を示した。修飾されたヒドロゲル系との神経堤細胞またはNCCの相溶性を、AP−2に対する免疫蛍光染色法によって評価した。修飾されたヒドロゲル系上でめっきされた09-1細胞におけるAP−2発現の有意な増加が観察された。さらに、09-1細胞は、ストレス繊維の様々な量を通じて低剛性ヒドロゲルまたは高剛性ヒドロゲルに基づいて異なる形態を示した。40キロパスカルヒドロゲルで増殖した09-1細胞における抗ビンクリン発現は、軟質基質上で増殖した細胞が硬質基質よりも最小限の焦点付加複合体を形成することを反映して、1キロパスカルヒドロゲルで増殖したものよりも高かった。アクリルアミドが細胞に有毒であるため、ヒドロゲルの重合には適切な待ち時間が重要です。より良い結果を確実にするために、少なくとも30分間、水をPBSまたは脱イオン水に浸します。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討

学ぶ神経堤細胞の機械的信号研究法。O9-1細胞とポリアクリルアミドヒドロゲルを用い、細胞培養と免疫蛍光染色で力学的・化学的信号相互作用を解析。神経堤細胞の発生機構と疾患関連分子メカニズムの解明に貢献します。

神経堤細胞の機械的信号を研究するための最適化されたO9-1/ヒドロゲルシステム

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