スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織
August 20th, 2021
ここで提示されるプロトコルは、機械研究、疾患モデリング、およびスクリーニング用途に適した、二重極を有するマルチウェルプレートで48組織の平行培養のための設計された結合組織を生成するプロトコルである。プロトコルは、異なる臓器や種からの線維芽細胞と互換性があり、ヒトの原発性心臓線維芽細胞とここで例示される。
このプロトコルは、繊維芽細胞の構築を可能にし、定義された機械的条件下で、独自の環境を整理します。これらの結果は、細胞の自然環境に匹敵する剛性およびマトリックス組成物を有する異方性組織をもたらす。この方法では、最大 48 の条件を並列で比較できます。
使用される細胞型および培養条件に関しては柔軟である。いくつかの明確なコンポーネントを使用することで、実験室間で再現できます。プロ線維化因子または抗線維化薬を適用することにより、このプロトコルは、あらゆる種類の線維性疾患の基礎となるプロセスおよび治療法を研究するために使用することができる。
この手順を実証することは、私たちの研究室の博士課程の学生であるアリサ・デグレイブと私です。まず、バイアルが少量の氷で放置されるまで、摂氏37度の水浴でクライオ保存心臓線維芽細胞を解凍します。次に、2ミリリットル血清ピペットを用いて細胞懸濁液を、10ミリリットルの線維芽細胞増殖培地を含む適切な無菌遠心分離管に転写する。
最適な細胞検索のために、FGMの1ミリリットルでクライオバイアルをすすいで遠心分離管に移します。細胞を穏やかに再懸濁し、細胞培養フラスコに移す。FGMを5日間、または細胞が80%の合流度に達するまで、1日おきに補充してください。
培養細胞から培地を吸引した後、PBSを6ミリリットルで洗浄し、細胞に6ミリリットルの細胞解離試薬を加え、細胞剥離が見えるまでインキュベートする。細胞会合試薬中の外れた細胞に6〜12ミリリットルのFGMを加えることによって酵素活性を中和する。10ミリリットル血清学的ピペットを使用して4〜8回上下に穏やかにピペットを使用して単細胞懸濁液を確保し、新鮮な50ミリリットルの採取チューブに細胞を移します。
メーカーの指示に従って、自動セルカウンターの助けを借りて収量を確認し、細胞をペレットダウンさせます。遠心分離後、上清を吸引し、チューブをフリックしてペレットを取り出し、FGM内の細胞を再懸濁させる。次に、40マイクロメートルのメッシュセルストレーナーを介して細胞懸濁液を歪め、次に自動化されたセルカウンターを使用して、電気電流排除による細胞数と生存率を評価し、設計された結合組織またはECT調製を進める前に信頼性の高い細胞番号を確保します。
ECTに備えて、FGMを加えて20~25°Cで1ミリリットル当たり890万個の細胞に細胞懸濁液を調整し、細胞を氷の上に置きます。ECTヒドロゲル混合物の個々の成分を含む他のすべてのチューブを氷の上に移し、空の50ミリリットル遠心管を事前に冷やして混合物を調製する。ECTヒドロゲル混合物の調製を開始し、空気泡形成を回避する前チルド50ミリリットル遠心管にテキストに記載された成分を添加することによって。
まず、酸溶性コラーゲンI型ヒドロゲルを広いボアチップを有する血清学的ピペットにピペットする。適切な混合のためにチューブをそっと旋回しながらDMEMを加えて、コラーゲン溶液の塩分を調整します。pHを中和するには、チューブを旋回しながら0.2モル水酸化ナトリウムを加え、フェノール赤色インジケーターの赤色を観察して中和を確認します。
次に、チューブをそっと旋回しながら、セルサスペンションをドロップワイズに加えます。泡の形成を避け、せん断応力を最小限に抑えるために、広いボアチップを持つセロロジカルピペットを使用して一度だけ上下に静かに配管することによって、懸濁液を混ぜます。チューブを10回軽く旋回して完全に混合します。
ECTヒドロゲル混合物を含む遠心チューブを氷上に保管し、鋳造プロセスを通して保管します。ECTヒドロゲル混合物に1ミリリットルのピペットチップを湿らせ、48ウェル鋳造プレートの各金型に180マイクロリットルのヒドロゲル混合物を均等に分配し、コラーゲンマトリックスアセンブリの完全性に影響を与える可能性のある過度の剪断力を避け、プレート全体が15〜20分で終了することを保証します。ECT混合物の不連続分布として金型内に完全なループが形成されることを確認して、完全なECTリング形成を防ぎます。
均質で機能的な組織形成のための均一なECTヒドロゲル鋳造を確実にするために、内部ウェルにピペットを入れ、ピペットング中に気泡を形成することを避けてください。細胞培養インキュベーターの中に48ウェルの鋳造プレートを慎重に入れ、ECTヒドロゲル混合物を15〜30分間再構成する。インキュベーション後、ゲル状で不透明に見えます。
ECTが底部から剥離するのを避けるために、壁に沿って穏やかに沿って井戸ごとに摂氏37度の摂氏37度の暖かいFGMの600マイクロリットルを追加します。分析まで、毎日500マイクロリットルのFGMで培地を交換してください。所望の時点で、ステレオ顕微鏡を使用して、ECTの上部および側面図の顕微鏡画像を記録します。
ライン スキャン解析を実行するには、画像処理プログラムを使用します。スケールを設定し、直線ツールを使用して、各イメージングプレーンのアームあたり最低 6 つの位置で ECT 直径をトレースおよび測定します。高解像モノクロ画像センサーと近紫外線光源を搭載した固定距離に設置された集積領域スキャンカメラを備えた記録装置の下にある48ウェルキャスティングプレートを画像化します。
蛍光色素を含む極の先端を自動検出してコントラストを最大限に引き出します。ソフトウェア上で記録された画像を実行して、暗い背景や画像処理プログラムで高コントラストの明るいピクセルを検出することで、自動分析を使用して、毎日のレコードからの極間の距離を測定します。電柱を保持する ECT を取り外し、転送フックと ECT ループを挿入します。
次に、ECTを、静止したアームと、PBSで満たされた37度摂氏気性のオルガンバスを備えた延長動的機械式リオメーターのトランスデューサアームにクランプされた2つのフックに移します。1秒あたりのフック間の初期距離の約1%にリオメーターを設定することにより、一定の直線速度で単軸張力を適用します。一定の延伸速度は、一般的な ECT 寸法で使用できます。
トランスデューサの力を引き裂き、ストレッチを開始します。断面面積によって測定された力を正常化した後、ECT破裂のポイントまで記録し続け、異なる生体力学パラメータを決定する応力-ひずみ曲線をプロットします。組織がマイクロ破砕を開始する直前に、弾性領域の上限は降伏点に対応し、その株は組織の弾力性の尺度である。
プラスチック領域は降伏点と故障点の間にあります。故障点は組織の破裂によるストレスの急激な低下に対応し、組織の拡張性の尺度である究極の株を定義する。3番目の測定点は、組織がストレッチ中に壊れることなく耐えることができる最高のストレスによって定義される最大強度に対応します。
曲線下の領域によって与えられる弾力性と靭性は、それぞれ降伏点および故障点までの組織によって吸収されるエネルギーに対応する。取得した曲線ごとに、弾性領域の線形部分の傾きはヤング率(弾性率とも呼ばれる)に対応します。組織の剛性を測定する機械的性質である。
このプロトコルを使用して、制御条件下で、FCSの存在下でECT圧縮と収縮は、鋳造の数時間後に続き、特に5日目まで増加した。ECTをアクチン重合阻害剤ラトルンクリンAで処理した場合、ECT圧縮は対照と比較して有意に高い断面面積によって示されるように減少した。組織の収縮は、培養の5日間で評価された。
ラトランクリンAがない場合、収縮は5日目まで徐々に増加し、約40%の収縮に達した。しかし、ラトランクリンA存在は、組織収縮に影響を与えた結果、約20%の最大収縮をもたらした。アクチン重合阻害は、対照上の組織剛性の約50%の有意な減少につながった。
これらの結果は、作用イン細胞骨格完全性がECT圧縮、収縮、および硬化に不可欠であることを示す。信頼性の高い高品質のコラーゲン溶液を選択し、高い生存率を持つ単細胞懸濁液を使用して、設計された結合組織を再構成することが重要です。
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概要
このプロトコルにより、線維芽細胞は定義された機械的条件下で自身の環境を構築し、組織化することができ、自然環境を模倣した異方性組織が得られます。最大48条件を並行して比較することができ、さまざまな細胞種や培養条件に適応可能です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 結合組織工学
- 線維芽細胞生物学
- メカニズム研究
背景
- 線維芽細胞は組織の構造と機能に重要な役割を果たします。
- 工学的環境におけるそれらの挙動を理解することで、疾患モデリングに役立ちます。
- 線維化疾患は健康への影響が大きいため、重要な研究分野です。
- 現在の方法は再現性と柔軟性に欠けていることがよくあります。
研究の目的
- 工学的結合組織を生成するための再現可能なプロトコルを開発すること。
- 線維化疾患のメカニズム研究と薬物スクリーニングを促進すること。
- 複数の実験条件を同時に比較できるようにすること。
使用方法
- 組織培養のための二極多孔プレートの使用。
- 線維芽細胞への定義された機械的条件の適用。
- 線維化促進因子または抗線維化薬の組み込み。
- 組織の硬さとマトリックス組成の評価。
主な結果
- 工学的組織は自然環境に似た硬さとマトリックス組成を示しました。
- このプロトコルは異なる細胞種間での柔軟性を示しました。
- 複数の研究室間での再現性が確認されました。
- 薬物適用を通じて線維化疾患のメカニズムに関する洞察が得られました。
結論
- このプロトコルは線維化疾患の研究に貴重なツールを提供します。
- 制御された条件下で並行実験を行う能力を高めます。
- この方法の適応性により、さまざまな研究応用に適しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible generation of human-derived engineered connective tissues (ECT) in a 48-well format, providing a scalable 3D model for studying fibroblast behavior under defined biomechanical load. It supports mechanistic de-risking of antifibrotic targets by allowing parallel testing of pro-fibrotic factors and drug candidates, with quantitative readouts on tissue compaction, contraction, and stiffness. The system enhances predictive confidence in early discovery by modeling human-relevant tissue responses to pharmacological perturbations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation under controlled mechanical and biochemical conditions.
- Scientific Value: Supports functional validation of antifibrotic targets through dose-response analysis of compounds like Latrunculin A on tissue contraction and stiffness.
- Operational Value: Facilitates target de-risking by linking cytoskeletal mechanisms to tissue-level biomechanical outcomes in a human-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, high-throughput platform for screening compounds affecting tissue mechanics, with readouts on compaction, contraction, and elastic modulus.
- Operational Value: Enables parallel testing of up to 48 conditions per plate, supporting dose-response and time-course assays under consistent biomechanical loading.
- Operational Value: Uses defined, minimal components (collagen I, FGM, NaOH) to ensure reproducibility across laboratories and minimize batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human cardiac fibroblast responses in a 3D environment, improving translational relevance over 2D cultures for fibrosis mechanism studies.
- Scientific Value: Allows study of tissue-level phenotypes such as stiffness and extensibility, which correlate with pathological remodeling in fibrotic diseases.
- Operational Value: Supports longitudinal analysis of tissue dynamics over five days, enabling chronic compound exposure studies relevant to preclinical efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing a human-relevant 3D assay for mechanism-of-action confirmation and phenotypic screening in fibrosis programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of fibroblast-matrix interactions and pathway modulation under defined tensile load.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs (tissue diameter, contraction %, Young’s modulus) for hit validation and SAR progression.
- Analytics: Enables automated image-based analysis of tissue geometry and stress-strain profiling for objective, data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to pathophysiological relevance by measuring tissue stiffness and failure points analogous to fibrotic remodeling.
- Enterprise Reuse: The 48-well format and minimal reagent requirements allow integration into existing screening infrastructures with low adaptation cost.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating cell-matrix contributions to tissue stiffening and contractility.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized cell preparation, hydrogel mixing, and casting parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-predictive data on antifibrotic efficacy and target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on dose-dependent effects on tissue mechanics and actin integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary fibroblast culture, hydrogel handling, and sterile technique to ensure cell viability and matrix integrity.
- Dependent on access to a dynamic mechanical riometer with temperature-controlled bath and automated image analysis tools for biomechanical profiling.
- Necessitates standardization of cell seeding density (8.9 million cells/mL) and collagen neutralization across users to minimize variability in tissue formation.
- Adaptation to non-cardiac fibroblasts may require optimization of culture medium and loading conditions to reflect tissue-specific phenotypes.
- Limited to endpoints assessable via tissue geometry and tensile testing; molecular readouts require parallel sampling or fixation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Primary Cardiac Fibroblast Preparation
1:39
Enzymatic Dispersion of Human Cardiac Fibroblasts
2:52
Engineered Connective Tissue Preparation
5:28
Cross-Sectional Area Measurement to Assess ECT Compaction
5:55
Pole Deflection Analysis to Monitor ECT Contraction
6:32
Destructive Tensile Measurement and Stress-Strain Analysis to Assess ECT
8:20
Results: Effect of Actin Polymerization on ECT Compaction, Contraction, and Stiffness
9:22
Conclusion
