Name: スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぼう 線維芽細胞を用いた工学的結合組織の作製法。定義された機械的条件で異方性組織を構築し、最大48条件の並列比較が可能です。線維化疾患のメカニズム解明や創薬スクリーニングに応用できます。

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この研究は、ドイツ心臓協会(GLSのためのDGK研究フェローシップ)とドイツ研究財団(GLSおよびADのためのプロジェクトIRTG 1816を通じてDFG)によって支えられました。MT の DFG 417880571および DFG TI 956/1-1;MT および WHZ のための SFB 1002 TP C04;WHZ のための SFB 1002 TP S01;および EXC 2067/1-390729940J WHZ 用)。WHZは、ドイツ連邦科学教育省(プロジェクトIndiHEARTを通じてBMBF)とフォンダシオン・ルデュック(20CVD04)によってサポートされています。MT、WHZ、SLはドイツ心臓血管研究センター(DZHK)によってサポートされています。

GLSとSLは原稿を起草した。すべての著者は、プロトコルの開発に貢献し、原稿を編集しました。TM、MT、およびWHZは無数のGmbHの科学的アドバイザーであり、WHZは無数のGmbHの創設者であり株主です。

提示されたプロトコルは、細胞外マトリックス環境に対するこれらの細胞の機械的影響を研究することを可能にする、一次ヒトCFからのECTの生成を記述し、その逆もまた同様である。
線維芽細胞は、計画されたECT実験(0.75 x 106 細胞/ECT)に十分な細胞を得るために拡張する必要があります。最良の再現性のために、ECT生成で使用する前に、各通路内で80%の合流度まで標準化された持続時間のために2D単層培養中の凍結または組織由来の線維芽細胞を培養する前に勧める(プロトコルステップ3)。特にヒト一次CF-モノレイヤーおよび誘導ECTを培養する場合、CFに適した市販の媒体およびサプリメントを使用することをお勧 めします(資料表を参照)。血清による培地補充は、標準的な2D培養におけるCFの拡大を確実にするために重要である。ECT生成およびさらなる培養を含む3D培養物において無血清または低血清条件を用いて、選択した線維芽細胞の種類に応じて考えることができる。しかし、ECT生成のためにCFを使用する場合、適切な初期組織圧縮のために少なくと...

線維性疾患の研究における大きな障害は、線維芽細胞とその病理学的誘導体の挙動に関する洞察を提供する代表的なヒト3D組織モデルの欠如である。繊維プロセスを研究するために、標準的な2D培養システムは、非準拠の2D基質上で培養した場合、分離繊維芽細胞がα平滑筋アクチン(SMA)に急速にトランス分化されるため、最適ではない。したがって、標準2D培養における線維芽細胞は、規則的な「健康な」組織表現型3、4、5、6を反映していない。柔軟な基質上の培養物は、非繊維性(10kPa)および繊維(35kPa)組織環境をシミュレートするために導入されているが、これらは、病態生理学に関して非常に重要である第3の次元を欠いている。組織工学は、定義された実験的に調整可能な細胞外マトリックス(ECM)コンテキストにおいて線維芽細胞培養を可能にすることによって、この限界を克服する機会を提供する。例えば、細胞性、ECM組成、およびECM濃度の変化によって、そのすべてが組織バイオメカニクスを決定することができる。
線維芽細胞を用いて様々な3Dモデルが生成されている。フローティングディスクとマイクロスフィアは、最初の一つであったし、コラーゲンが再モデリングされ、時間に依存して圧縮されていることを実証しました。線維芽細胞は、コラーゲン線維に対して牽引力を発揮し、成長因子-β1(TGF-β1)を変換するなどのプロ線維化剤の添加によって促進できるプロセスである。8,9,10,11,12,13,14,15,16.しかし、自由に浮動するカルチャでは、制御された外部ローディングが許可されないため、モデルの縮小や圧縮が連続的に行われます。シート状の工学的組織は、ユニ、バイ、多軸、または周期株試験を通じて、組織の生体力学的特性のホメオ静電気調節を研究する可能性を開いた17,18,19,20.これらのモデルは、例えば、細胞数が組織の剛性に及ぼす影響を実証するために使用されており、細胞骨格の完全性およびアトミオシン細胞骨格収縮と正の相関性を有することが判明した。18,19.ただし、力変換器とアンカーポイントのクランプポイントの周囲の不均一な組織変形によって、力と歪みへの変換が複雑であることに注意することが重要です。この固有の制限は、犬の骨やリング状の組織によってバイパスすることができ、アンカーポイントでいくつかの組織執行を提供します21,22,23.リング状の組織は、細胞コラーゲンヒドロゲルをリング型の金型に分散させることで作製できます。ヒドロゲルがコンパクト化するにつれて、組織は型の非圧縮性の内側の棒の周りに形成され、さらなる組織収縮のための抵抗性を提供する24,25,26,27.最初および典型的な最大圧縮の後、組織はまた、定義された組織の長さで円形ECTをさらに抑制するために調節可能なスペーサーに移すことができる3,24,25,26,27,28,29,30.生物物理学的特性は、単方向または動的歪みの下で適切なロードセルを備えた標準的な水平または垂直歪みストレスデバイスで評価することができます3.組織は大部分が均一な円形構造を持ち、バー/フック(アンカレッジポイントおよび/または力トランスデューサ)に保持することができるので、これらはまだローディングバーの周りの圧縮領域を囲むかもしれませんが、この形式はクランプと比較してより均一な歪みの変化を可能にします3.さらに、アンカー組織は双極細胞形状を惹起し、異方性牽引を促進する力線に沿った伸びによって細胞が組織力に適応する31,32,33,34,35,36.我々は以前、機能的ストレス株実験で単一の硬い極の周りにラットおよびヒト心臓線維芽細胞(CF)からリング状のECTを適用し、ウイルスに感染した線維芽細胞を使用して機能の利益と喪失の研究を行った24,25,26 および薬理学的研究37.さらに、ECTモデルにおけるCF媒介性線維症の性差を特定できる27.
商業ベンダーから凍結保存CFとして得られたヒトの一次CF( 資料表を参照)で得られたヒトECTの生成のための次のプロトコルは、リング状の組織の利点と、並列高コンテンツテスト用に設計された48ウェルプラットフォーム用の巨視組織を簡単かつ迅速に製造する方法を組み合わせたものです。
重要なことに、ECTモデルは、特定の線維芽細胞型に限定されず、他の線維芽細胞の調査における文書化された使用、例えば、皮膚線維芽細胞38,39である。さらに、患者の生検からの線維芽細胞も同様にうまく機能し、線維芽細胞の選択は最終的に取り組む科学的な質問に依存する。
このプロトコルに記載されたECTの生成に使用されるプラットフォームは、市販の48ウェル3D細胞/組織培養プレートである(図1A)。48ウェルプレートの助けを借りて、定義された幾何学と機械的負荷の下でECTの形成と機能を調製、培養、およびモニタリングするための方法が記載されています。形成されたECTは統合された適用可能な極によって握られ、機械負荷は異なった硬度の極(Shore A値36-89)を使用して、曲げ剛性に影響を与えることによって最終的な目的に従って微調整することができる。海岸の電柱 値は 46 です。プロトコルは、さらに、ECTが単一の堅いrod37の周りに保持される、以前に説明されたカスタム円形の金型と互換性がある。この金型の寸法は 図1Bに示されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62700/62700fig01.jpg"> 図1:鋳造金型の概略図 (A) 2つの柔軟なポールを持つ鋳造金型の技術図面と寸法。金型は、金型本体に二重保持極を保持する短い壁で区切られた内周を含みます。柔軟な極は互いに自由な水平距離を有し、基盤で接続されている。金型は180 μLの鋳造体積を可能にします。各金型のウェルは、少なくとも600 μLの培養培地の体積容量を可能にします。異なる材料組成物は、特定の剛性を有する極(例えば、TM5MED-TM9MED)を製造するために使用することができる。(B)技術的な図面と単一の硬いロッドを持つリング状の金型の寸法。これは、ECT鋳造プロトコル37で使用できる、明確な幾何学と機械環境を備えた代替金型です。リング状の金型組立方法は、公開された大きなフォーマット28,41から適応した。簡単に言えば、この方法は、(1)ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)成形スペーサー(8mm径)をガラス皿に注いだポリジメチルシロキサン(PDMS、シリコーン)(直径60mm)、および(2)PDMSポールホルダー(直径1.5mm)を固定して、形成された中空空洞の内側に同心円状に固定し、(3)直径(3)を固定する。中空空間により、180 μLの鋳造体積が可能になります。各ガラス皿は、複数のインプリント型(例えば5つの金型で示される)をコンポートすることができ、培養培地の最大5 mLの容量を有する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62700/62700fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>細胞培養試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase Solution</td><td>Merk Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation reagent &ndash;TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)粉末、高グルコース</td><td>Gibco</td><td>12100061</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、pH 7.2、-Ca2+、-Mg2+</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 線維芽細胞増殖培地-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3132</td><td></td></tr><tr><td>FBM&nbsp;線維芽細胞増殖基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3131</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 線維芽細胞増殖培地-2 単品引用&nbsp;サプリメントと成長因子</td><td>ロンザ</td><td>CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞増殖培地 3 KIT</td><td>PromoCell</td><td>C-23130</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞基礎培地 3</td><td>PromoCell</td><td>C-23230</td><td></td></tr><tr><td>Growth Medium 3 SupplementPack</td><td>PromoCell</td><td>C-39350</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン (10000 U/mL)/ストレプトマイシン (10000 &mu;L / mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム溶液(NaOH)1.0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770-100ML</td><td></td></tr><tr><td>細胞源:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>心室からの正常なヒト心臓線維芽細胞(NHCF-V)</td><td>ロンザ</td><td>CC-2904</td><td></td></tr><tr><td>ヒト心臓線維芽細胞(HCF-c)</td><td>プロモセル</td><td>C-12375</td><td></td></tr><tr><td>ヒト心臓線維芽細胞(HCF-p)</td><td>PromoCell</td><td>C-12377</td><td></td></tr><tr><td>初代ヒト包皮線維芽細胞-1 (HFF-1)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンサワーズ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 M HCl</td><td>LLC コラーゲン溶液</td><td>FS22024</td><td>6-7 mg/mL</td></tr><tr><td>コラーゲン タイプ I (ラット尾) 0.02 M HCl</td><td>コーニング コーニング</td><td>カウ354236</td><td>~4 mg/mL</td></tr><tr><td>薬剤:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin-A (Lat-A)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T119-0100</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製品:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プラスチック製品</td><td>Sarstedt and Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mesh cell strainer (ナイロン、細孔サイズ 40 &mu;m)</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>myrPlate-uniform</td><td>myriamed GmbH</td><td>TM5 med</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes wide openings, sterile (10 mL)</td><td>Corning</td><td>07-200-619</td><td></td></tr><tr><td>Specific instruments:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/2&Prime用バイテレセントリックCOREレンズ 検出器</td><td>OptoEngineering</td><td>TCCR12096</td><td></td></tr><tr><td>エリアスキャンカメラ Basler aceacA4024</td><td>Basler</td><td>107404</td><td></td></tr></tbody></table>

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

線維芽細胞は、生化学的および生体力学的刺激に応答して、すぐに筋線維芽細胞にトランスファ分化する、典型的に非常に動的な細胞である。心臓線維症を含む線維化プロセスの現在の理解は貧弱なままであり、新しい抗線維化療法の開発を妨げている。制御可能で信頼性の高いヒトモデルシステムは、線維症病理をよりよく理解するために重要です。これは、3次元(3D)環境における線維芽細胞および線維組織の病態生理学の研究を容易にするために、48ウェル鋳造板で設計された結合組織(ECT)を生成する高度に再現性と拡張性の高いプロトコルです。ECTは、調整可能な剛性を有する極の周りに生成され、定義された生体力学的負荷の下での研究を可能にする。定義された荷重条件の下で、細胞とマトリックスの相互作用によって制御される表述法の適応を検討することができる。並列テストは、負荷に対する組織圧縮や収縮などの複数のパラメータのタイムコース分析の機会を持つ48ウェル形式で実現可能です。これらのパラメータから、組織の剛性や弾力性などの生体力学的特性を検討することができる。

ECTは、最初の24時間内の最初の細胞コラーゲンヒドロゲル体積と比較して約95%の圧縮に達する。組織の圧縮と収縮は、制御条件下およびFCSの存在下で、鋳造後数時間を経て、5日目まで顕著に増加する(図5A)。極偏向は、次の15日間(20日間がテストされた最長時間)の間にさらに増加する可能性があります。極偏向の大きさは、細胞の種類、細胞の状態、細胞および組織培養条件に依存します。通常、バイオメカニカルプロパティは培養5日目で測定されますが、任意の時点を選択することができます。ECTモデルの適用性の一例として、このプロトコルが組織機能に対するアクチン細胞骨格完全性の影響を研究するのにどのように役立つかについて示されている。ECTを48ウェル鋳造板で調製し、アクチン重合阻害剤ラトランクリンA(Lat-A,7 ng/mL)で処理した。この治療は、コントロールと比較してCSAで1.7倍の有意な増加によって示されるようにECT圧縮を減少させた(図8A、B)。さらに、組織の収縮は培養5日間で評価した。...

ここで提示されるプロトコルは、機械研究、疾患モデリング、およびスクリーニング用途に適した、二重極を有するマルチウェルプレートで48組織の平行培養のための設計された結合組織を生成するプロトコルである。プロトコルは、異なる臓器や種からの線維芽細胞と互換性があり、ヒトの原発性心臓線維芽細胞とここで例示される。

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

このプロトコルは、繊維芽細胞の構築を可能にし、定義された機械的条件下で、独自の環境を整理します。これらの結果は、細胞の自然環境に匹敵する剛性およびマトリックス組成物を有する異方性組織をもたらす。この方法では、最大 48 の条件を並列で比較できます。使用される細胞型および培養条件に関しては柔軟である。いくつかの明確なコンポーネントを使用することで、実験室間で再現できます。プロ線維化因子または抗線維化薬を適用することにより、このプロトコルは、あらゆる種類の線維性疾患の基礎となるプロセスおよび治療法を研究するために使用することができる。この手順を実証することは、私たちの研究室の博士課程の学生であるアリサ・デグレイブと私です。まず、バイアルが少量の氷で放置されるまで、摂氏37度の水浴でクライオ保存心臓線維芽細胞を解凍します。次に、2ミリリットル血清ピペットを用いて細胞懸濁液を、10ミリリットルの線維芽細胞増殖培地を含む適切な無菌遠心分離管に転写する。最適な細胞検索のために、FGMの1ミリリットルでクライオバイアルをすすいで遠心分離管に移します。細胞を穏やかに再懸濁し、細胞培養フラスコに移す。FGMを5日間、または細胞が80%の合流度に達するまで、1日おきに補充してください。培養細胞から培地を吸引した後、PBSを6ミリリットルで洗浄し、細胞に6ミリリットルの細胞解離試薬を加え、細胞剥離が見えるまでインキュベートする。細胞会合試薬中の外れた細胞に6〜12ミリリットルのFGMを加えることによって酵素活性を中和する。10ミリリットル血清学的ピペットを使用して4〜8回上下に穏やかにピペットを使用して単細胞懸濁液を確保し、新鮮な50ミリリットルの採取チューブに細胞を移します。メーカーの指示に従って、自動セルカウンターの助けを借りて収量を確認し、細胞をペレットダウンさせます。遠心分離後、上清を吸引し、チューブをフリックしてペレットを取り出し、FGM内の細胞を再懸濁させる。次に、40マイクロメートルのメッシュセルストレーナーを介して細胞懸濁液を歪め、次に自動化されたセルカウンターを使用して、電気電流排除による細胞数と生存率を評価し、設計された結合組織またはECT調製を進める前に信頼性の高い細胞番号を確保します。ECTに備えて、FGMを加えて20~25°Cで1ミリリットル当たり890万個の細胞に細胞懸濁液を調整し、細胞を氷の上に置きます。ECTヒドロゲル混合物の個々の成分を含む他のすべてのチューブを氷の上に移し、空の50ミリリットル遠心管を事前に冷やして混合物を調製する。ECTヒドロゲル混合物の調製を開始し、空気泡形成を回避する前チルド50ミリリットル遠心管にテキストに記載された成分を添加することによって。まず、酸溶性コラーゲンI型ヒドロゲルを広いボアチップを有する血清学的ピペットにピペットする。適切な混合のためにチューブをそっと旋回しながらDMEMを加えて、コラーゲン溶液の塩分を調整します。pHを中和するには、チューブを旋回しながら0.2モル水酸化ナトリウムを加え、フェノール赤色インジケーターの赤色を観察して中和を確認します。次に、チューブをそっと旋回しながら、セルサスペンションをドロップワイズに加えます。泡の形成を避け、せん断応力を最小限に抑えるために、広いボアチップを持つセロロジカルピペットを使用して一度だけ上下に静かに配管することによって、懸濁液を混ぜます。チューブを10回軽く旋回して完全に混合します。ECTヒドロゲル混合物を含む遠心チューブを氷上に保管し、鋳造プロセスを通して保管します。ECTヒドロゲル混合物に1ミリリットルのピペットチップを湿らせ、48ウェル鋳造プレートの各金型に180マイクロリットルのヒドロゲル混合物を均等に分配し、コラーゲンマトリックスアセンブリの完全性に影響を与える可能性のある過度の剪断力を避け、プレート全体が15〜20分で終了することを保証します。ECT混合物の不連続分布として金型内に完全なループが形成されることを確認して、完全なECTリング形成を防ぎます。均質で機能的な組織形成のための均一なECTヒドロゲル鋳造を確実にするために、内部ウェルにピペットを入れ、ピペットング中に気泡を形成することを避けてください。細胞培養インキュベーターの中に48ウェルの鋳造プレートを慎重に入れ、ECTヒドロゲル混合物を15〜30分間再構成する。インキュベーション後、ゲル状で不透明に見えます。ECTが底部から剥離するのを避けるために、壁に沿って穏やかに沿って井戸ごとに摂氏37度の摂氏37度の暖かいFGMの600マイクロリットルを追加します。分析まで、毎日500マイクロリットルのFGMで培地を交換してください。所望の時点で、ステレオ顕微鏡を使用して、ECTの上部および側面図の顕微鏡画像を記録します。ライン スキャン解析を実行するには、画像処理プログラムを使用します。スケールを設定し、直線ツールを使用して、各イメージングプレーンのアームあたり最低 6 つの位置で ECT 直径をトレースおよび測定します。高解像モノクロ画像センサーと近紫外線光源を搭載した固定距離に設置された集積領域スキャンカメラを備えた記録装置の下にある48ウェルキャスティングプレートを画像化します。蛍光色素を含む極の先端を自動検出してコントラストを最大限に引き出します。ソフトウェア上で記録された画像を実行して、暗い背景や画像処理プログラムで高コントラストの明るいピクセルを検出することで、自動分析を使用して、毎日のレコードからの極間の距離を測定します。電柱を保持する ECT を取り外し、転送フックと ECT ループを挿入します。次に、ECTを、静止したアームと、PBSで満たされた37度摂氏気性のオルガンバスを備えた延長動的機械式リオメーターのトランスデューサアームにクランプされた2つのフックに移します。1秒あたりのフック間の初期距離の約1%にリオメーターを設定することにより、一定の直線速度で単軸張力を適用します。一定の延伸速度は、一般的な ECT 寸法で使用できます。トランスデューサの力を引き裂き、ストレッチを開始します。断面面積によって測定された力を正常化した後、ECT破裂のポイントまで記録し続け、異なる生体力学パラメータを決定する応力-ひずみ曲線をプロットします。組織がマイクロ破砕を開始する直前に、弾性領域の上限は降伏点に対応し、その株は組織の弾力性の尺度である。プラスチック領域は降伏点と故障点の間にあります。故障点は組織の破裂によるストレスの急激な低下に対応し、組織の拡張性の尺度である究極の株を定義する。3番目の測定点は、組織がストレッチ中に壊れることなく耐えることができる最高のストレスによって定義される最大強度に対応します。曲線下の領域によって与えられる弾力性と靭性は、それぞれ降伏点および故障点までの組織によって吸収されるエネルギーに対応する。取得した曲線ごとに、弾性領域の線形部分の傾きはヤング率(弾性率とも呼ばれる)に対応します。組織の剛性を測定する機械的性質である。このプロトコルを使用して、制御条件下で、FCSの存在下でECT圧縮と収縮は、鋳造の数時間後に続き、特に5日目まで増加した。ECTをアクチン重合阻害剤ラトルンクリンAで処理した場合、ECT圧縮は対照と比較して有意に高い断面面積によって示されるように減少した。組織の収縮は、培養の5日間で評価された。ラトランクリンAがない場合、収縮は5日目まで徐々に増加し、約40%の収縮に達した。しかし、ラトランクリンA存在は、組織収縮に影響を与えた結果、約20%の最大収縮をもたらした。アクチン重合阻害は、対照上の組織剛性の約50%の有意な減少につながった。これらの結果は、作用イン細胞骨格完全性がECT圧縮、収縮、および硬化に不可欠であることを示す。信頼性の高い高品質のコラーゲン溶液を選択し、高い生存率を持つ単細胞懸濁液を使用して、設計された結合組織を再構成することが重要です。

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Research

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

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内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

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組織工学のためのナノフィブリルパターンコラーゲンの作製

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スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

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