Name: 樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶシリアルブロック顔走査電子顕微鏡（SBEM）を用いたマウス海馬の樹状突起棘の高解像度イメージング法。この手法はシナプス可塑性と学習・記憶の神経回路理解に貢献します。

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SBEMイメージング、光顕微鏡イメージング、電子顕微鏡サンプル調製は、Nencki実験生物学研究所のイメージングコア施設として機能するイメージング組織機能研究所の機器を使用して行われました。
図1の調製には、マウス(Souris_02)の画像、及び https://smart.servier.com/ からのバイアルを用いた。
この研究は、KRに授与された国立科学センター(ポーランド)グラントオープス(UMO-2018/31/B/NZ4/01603)によって支援されました。

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+ultrastructural+analysis+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The importance of ultrastructural analysis of memory.</a> Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).</li>
<li>Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+microtome-based+serial+block-face+scanning+electron+microscopy+in+neuroscience%3A+challenges+of+SBEM+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).</li>
<li>Śliwińska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+Memory+Upscales+Volume+of+Postsynaptic+Densities+in+the+Process+that+Requires+Autophosphorylation+of+%CE%B1CaMKII%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII.</a> Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).</li>
<li>Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+affects+correlation+between+the+size+of+dendritic+spine+and+its+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1693(2019).</li>
<li>Leighton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEM+images+of+block+faces%2C+cut+by+a+miniature+microtome+within+the+SEM+-+a+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note.</a> Scanning Electron Microscopy. , Pt 2 73-76 (1981).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Block-Face+Scanning+Electron+Microscopy+to+Reconstruct+Three-Dimensional+Tissue+Nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Smith, D., Starborg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+in+cell+biology%3A+Applications+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology.</a> Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%3A+Volume+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeerinck%2C+TJ+%22NCMIR+methods+for+3D+EM%3A+A+new+protocol+for+preparation+of+biological+specimens+for+serial+block+face+scanning+electron+microscopy%22">NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy</a>. , 6-8 (2010).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Acad. Press. San Diego, Calif. (2004).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Mercer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+scheme+for+section+staining+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">a scheme for section staining in electron microscopy.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+Image+Browser%3A+A+Platform+for+Segmentation+and+Analysis+of+Multidimensional+Datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Fiala, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct%3A+a+free+editor+for+serial+section+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Reconstruct: a free editor for serial section microscopy.</a> Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Roels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interactive+ImageJ+plugin+for+semi-automated+image+denoising+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 771(2020).</li>
<li>Radwanska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+long-term+memory+formation+when+synaptic+strengthening+is+impaired%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).</li>
<li>Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+scanning+electron+microscopy+and+the+reconstruction+of+plant+cell+membrane+systems%3A+SBFSEM+Methods+for+Plant+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells.</a> Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).</li>
<li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+Cell+Death+Controlled+by+ANAC033%2FSOMBRERO+Determines+Root+Cap+Organ+Size+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis.</a> Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).</li>
<li>Russell, M. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+correlative+light+and+electron+microscopy+of+cultured+cells+using+serial+blockface+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).</li>
<li>Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block+face+SEM+visualization+of+unusual+plant+nuclear+tubular+extensions+in+a+carnivorous+plant+%28Utricularia%2C+Lentibulariaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae).</a> Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).</li>
<li>Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Homogeneous+En+Bloc+Staining+of+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).</li>
<li>Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+sheet-to-tubule+transformation+is+a+general+mechanism+for+endoplasmic+reticulum+partitioning+in+dividing+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).</li>
<li>Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+and+three-dimensional+electron+microscopy+methods+for+the+study+of+Trypanosoma+brucei+and+Leishmania+mexicana+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella.</a> Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).</li>
<li>Starborg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transmission+electron+microscopy+and+3View+to+determine+collagen+fibril+size+and+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).</li>
<li>Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+organelle+ontogeny+through+a+cell+cycle+revealed+by+whole-cell+reconstructions+using+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy.</a> Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).</li>
<li>Bojko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Autophagic+Flux+in+Escapers+from+Doxorubicin-Induced+Senescence%2FPolyploidy+of+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084(2020).</li>
<li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. Princeton. (2014).</li>
<li>Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Synapse+Formation+in+the+Adult+Somatosensory+Cortex+of+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Heterozygote+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice.</a> Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

2010年10年にディアリンクによって記述された主要なNCMIR法の多くのバリエーションがあります。基本的な原理は変わりませんが、研究する材料の種類によっては、わずかな変更が実施されます。SBEM用の試料を埋め込むために異なる樹脂を使用することができること、例えば植物の場合、スパーは細胞壁22,23を通じてより良い浸潤を可能にする低粘度のために選択した樹脂であることが以前に説明された。さらに、様々な緩衝液は、固定(例えば、カコジレート緩衝液、HEPES、またはリン酸緩衝液ならびにグルタルアルデヒド(2-3%)およびパラホルムアルデヒド(2-4%)の異なる濃度、24、25、26、27、28)<sup ...

中枢神経系の興奮シナプスのほとんどは樹状脊椎に位置しています - 神経膜の小さな突起。これらの突起は、細胞内シグナル伝達を制御する限定された生化学的コンパートメントを形成する。樹状脊椎およびシナプスの構造的可塑性は、学習および記憶1、2のような重要なプロセスの根源となるシナプス有効性の機能的変化と密接に関連している。電子顕微鏡(EM)は、樹状脊椎にシナプス前入力があるかどうかを判断できる唯一の技術であることに注意することが重要です。EM解像度は、シナプス後の部分(PSD)、シナプス後の部分、樹状脊椎の寸法、軸索の大きさと形状などの超構造的な詳細を研究するためにも必要です。さらに、EMを使用すると、シナプスとその周辺を視覚化することが可能です。
イメージングおよびコンピューティング技術の進歩により、神経回路全体を再構築することが可能です。体積電子顕微鏡法は、例えば、シリアルセクション透過電子顕微鏡(ssTEM)、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBEM)、および集光イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)などの神経回路再構成に一般的に用いられている。
我々の研究では、SBEM法は、マウス海馬および組織性脳スライス4,5のサンプルにおける樹状脊椎およびPSDの構造的可塑性を調査するためにうまく採用されている。SBEMは、走査型電子顕微鏡室6、7、8、9の中にミニチュアの超ミクロトームを設置することに基づいています。サンプルブロックの上部が画像化され、その後、サンプルがウルトラミクロトームによって指定された深さで切断され、新しいブロック面が明らかになります。その結果、切断されたスライスが破片として失われている間、ブロック面の画像のみが残されます。SBEMが破壊的な技術と呼ばれる理由は、同じ場所を再びイメージすることはできません。しかし、破壊的なオンブロック法の利点は、データ品質とデータ分析3に大きな影響を与える可能性のある歪み問題やセクション損失に苦しんでいないということです。さらに、SBEMは、比較的大きな視野(&gt;0.5mm×0.5mm)を高解像度3で画像化する可能性を与える。
SBEMを採用するには、画像の取得に使用される反射電子検出器により、サンプルを専用の非常にコントラストの高いプロトコルに従って調製する必要があります。ここでは、1980年代8,11年に開発された還元オスミウムチオカルボヒドラジド(rOTO)染色を用いて、Deerinck10(国立顕微鏡・イメージング研究センター(NCMIR)法)が開発した手順に基づいて、プロトコルに従ってサンプル調製を行う方法を示す。また、軽顕微鏡とSBEMによる免疫蛍光研究に同じ脳を用いることができる軽度の固定灌流を用いて、2段階固定法を導入する。
プロトコルでは、マウスの脳は主に軽度の固定剤で固定され、次いで半分に切断され、一方の半球は後固定され、免疫蛍光(IF)のために準備され、もう1つはEM研究のために(図1)である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62712/62712fig01.jpg"> 図 1.SBEM を使用した解析のための樹状脊椎の準備のためのワークフローの概略表現。 マウスを屠殺し、軽度の一次固定剤を浸透させた。脳は半分に切断され、1つの半球は免疫蛍光(IF)専用の固定剤(IF)専用の固定剤で後固定され、凍結保護され、凍結スタットを使用してスライスされ、IF研究のために処理され、他の半球はEM固定剤で後付けされ、ビブラートでスライスされ、EM研究のために準備された。SBEM研究のための脳スライスは対照的であり、樹脂に平らに埋め込まれ、次いで海馬のCA1領域をピンに取り付け、SBEMで画像化した(図1)。黄色いボックスで強調表示されたプロトコルの一部は、ビデオで紹介されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62712/62712fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;強い&gt;麻酔薬:強い&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン混合物(ケタミナ/セダジン)</td><td>バイオウェットプラウィ、プラウィ、ポーランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム(モービタル)</td><td>バイオウェットプラウィ、プラウィ、ポーランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;強&gt;固定剤:強い&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド(GA)</td><td>シグマアルドリッチ、セント米国ミシガン州ルイ</td><td>G5882</td><td>グレード I、25% H2O 中、電子顕微鏡固定剤として使用するために特別に精製</td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td><td>POCH、グリヴィツェ、ポーランド</td><td>575283115</td><td>pure p.a.</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>441244</td><td>prilled, 95%</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>P4417-50TAB</td><td>tablets</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S5881</td><td>試薬グレード, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%, ペレット (無水)</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン</td>州、米国<td>S3264</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性(NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン</td>州<td>、米国S3139</td><td></td></tr><tr><td>Perflutes:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Large blunt/blunt curvedはさみ (~14.5 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14519-14</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ (ダブル 2" フラットエンド、1 つは丸みを帯び、もう 1 つは 1/8 インチにテーパー付き)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>針先、15 GA、鈍器 (灌流針)</td><td>KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany</td><td>KD-FINE 900413</td><td>1.80 x 40 mm</td></tr><tr><td>細い (Graefe) ピンセット</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>リード液</td><td>BQ80S</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックバイアル</td><td>Profilab, ワルシャワ, ポーランド</td><td>534.02</td><td>プラスチックバイアル、組織保存用ブルーキャップ付き、20 ml、31 x 48 mm</td></tr><tr><td>ストレートアイリスハサミ (~9 cm)</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Brain slices preparation for EM:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>NEST, Rahway, NJ, USA</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリル接着剤</td><td>Fenedur, Montevideo, Uruguay</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA</td><td>72632</td><td>20 ml シンチレーションバイアル, a pack of 100</td></tr><tr><td>Pasteur pipette</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-4545</td><td>LDPE, disposable, 7.5 ml</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ウィルキンソンソード、ロンドン、英国</td><td></td><td>クラシックな両刃安全カミソリ刃</td></tr><tr><td>メス刃</td><td>スワン・モートン、シェフィールド、英国</td><td>No. 20</td><td></td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ マイクロシステムズ、ウィーン、オーストリア</td><td>ライカ VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Brain スライスの準備 IF:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>NEST、ローウェイ、ニュージャージー州、米国</td><td>701101</td><td></td></tr><tr><td>Criostat</td><td>Leica Microsystems, Vienna, Austria</td><td>Leica CM 1950</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>Bioshop, Burlington, Canada</td><td>ETH001</td><td></td></tr><tr><td>Low-profile disposable blade 819</td><td>Leica Biosystems Inc., USA</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Swann-Morton, Sheffield, UK</td><td>No. 20</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>POCH, Gliwice, Poland</td><td>792770426</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>POCH, Gliwice, Poland</td><td>772090110</td><td></td></tr><tr><td>Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound</td><td>Leica Biosystems, Switzerland</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Immunostaining:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>NEST, Rahway, NJ, USA</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody</td><td>Merck-Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>MAB1598</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss, Göttingen、ドイツ</td><td></td><td>ツァイススピニングディスク顕微鏡(63 ×石油対物レンズ、NA 1.4、ピクセルサイズ0.13 µm ×0.13 マイクロ;m)</td></tr><tr><td>カバースライド</td><td>Menzel Glaser, Braunschweig, Germany</td><td>B-1231</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorpbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, USA</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AGAA00008</td><td>SuperFrost</td></tr><tr><td>Normal donkey serum(NDS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>JWElectronic, Warsaw, Poland</td><td>KL-942</td><td></td></tr><tr><td>TritonT X-100 Reagent Grade</td><td>Bioshop, Burlington, Canada</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>&lt;ストロング&gt;電子マイクロソクピーサンプル調製ストロング&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘキサシアノフェレートカリウム(II)三水和物</td><td>POCH、グリヴィツェ、ポーランド</td><td>746980113</td><td></td></tr><tr><td>Aclar 33Cフィルム</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルベニア</td>州<td>、米国 50425</td><td>フッ素樹脂フィルム包埋シート</td></tr><tr><td>DMP-30、2,4,6-トリス(ジメチルアミノメチル)フェノール</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>T58203</td><td>エポキシ包埋中加速器</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 単一成分A、M</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>44611</td><td>Durcupan ACM 単一成分 A、M エポキシ樹脂</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 単一成分 B</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>44612</td><td>Durcupan ACM 単一成分 B、硬化剤 964</td></tr><tr><td>Durcupan ACM 単一成分 D</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>44614</td><td>Durcupan ACM 単一成分 D 、可塑剤</td></tr><tr><td>エチルアルコール絶対</td><td>POCH、グリヴィツェ、ポーランド</td><td>64-17-5</td><td>エチルアルコール絶対 99.8% 純度 P.A.-BASIC</td></tr><tr><td>Genlab ラボラトリー オーブン</td><td>Wolflabs、ヨーク、イギリス</td><td>Mino/18/SS</td><td>オーブン Genlab MINO/18/SS 18l 容量、ファン循環なし、デジタル ディスプレイなし、標準温度勾配、標準回復率、タイマーなし、250°C;C最高温度、240V電源</td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>A-9256</td><td>試薬グレード、<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%(HPLC)</td></tr><tr><td>硝酸鉛(II)</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>467790</td><td><img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">99.95%微量金属基礎</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>75632</td><td>電子顕微鏡用, 4% in H2O</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Elmetron, Zabrze, Poland</td><td>CP-5-5</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>BioSan, Józefów, Poland</td><td>Multi Bio RS-24</td><td>rotator Multi Bio RS-24</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>S5881</td><td>試薬グレード, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">98%, pellets (anhydrous)</td></tr><tr><td>Sunflower mini shaker</td><td>Grant bio, Shepreth,UK</td><td>PD-3D</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Millipore, Burlington, MA, USA</td><td>SLGP033NB</td><td>0,22 µm 細孔サイズ</td></tr><tr><td>チオカルボヒドラジド</td><td>Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA</td><td>88535</td><td>purum p.a., for electron microscopy, <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png">99.0% (N)</td></tr><tr><td>Uranyl</td><td>acetate Serva, Heidelberg, Germany</td><td>77870</td><td>Uranyl acetate·2H2O、研究グレード</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>WSL、Swietochlowice、ポーランド</td><td>LWT</td><td></td></tr><tr><td>SBEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well culture plate</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>734-2782</td><td>96ウェルプレート、丸底、未処理</td></tr><tr><td>AM Gatan 3View スタブ取り扱いピンセット</td><td>Micro to Nano, Haarlem, Netherlands オランダ</td><td>50-001521</td><td></td></tr><tr><td>双眼鏡</td><td>OPTA-TECH、ワルシャワ、ポーランド</td><td>X2000</td><td></td></tr><tr><td>導電性接着剤</td><td>Chemtronics、ジョージア州、米国</td><td>CW2400</td><td>導電性 eopxy</td></tr><tr><td>Gatan 3View サンプル ピン スタブ</td><td>Micro to Nano、ハールレム、オランダ オランダ</td><td>10-006003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミシガン州、米国</td><td>P7793</td><td>ロールサイズ 20 で。×50°Cft</td></tr><tr><td>Pelco導電性銀塗料</td><td>テッドペラ、レディング、カリフォルニア州、米国</td><td>16062-15</td><td>PELCO® 導電性シルバーペイント、15g</td></tr><tr><td>カミソリブレードダブルエッジ</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア州、米国</td><td>72000</td><td>ステンレス鋼「PTFE」コーティング。PERSONNAブランド.004インチの厚さ、個別に包まれた、箱に250枚のブレード。</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>ツァイス、オーバーコッヘン、ドイツ</td><td></td><td>Sigma VP、Gatan 3View2チャンバー、加速電圧 2.5 kV、可変圧力 5 Pa、開口 20 &amp; マイクロ;m、滞留時間6 µs、スライス厚さ60 nm、倍率15 000 x、画像解像度2048 x 2048ピクセル、ピクセルサイズ7.3 nm</td></tr><tr><td>トリム90° ダイヤモンドナイフ</td><td>Diatome Ltd.、ニダウ、スイス</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems、ウィーン、オーストリア</td><td>Leica ultracutR</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアの</td><td>ウェブページ</td><td></td>チュートリアル<td></td></tr><tr><td>FijiJ</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡画像ブラウザ</td><td>http://mib.helsinki.fi/</td><td></td> <td>http://mib.helsinki.fi/tutorials.html</td></tr><tr><td>再構築</td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0</td><td></td><td>https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)</td></tr><tr><td>動物</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>成虫 3ヶ月齢  20±1 生後1ヶ月 女性 Thy1-GFP(M)マウス(Thy1-GFP +/-)(Feng et al.,2000)は、グルタミン酸作動性ニューロンのまばらに分布した集団でGFPを発現します。動物は、Nencki Institute of Experimental BiologyのアニマルハウスでC57BL/6Jの背景を持つヘテロ接合体として飼育されました。</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(sbem)

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

3次元電子顕微鏡(3D EM)は、ナノスケールの分解能で樹状脊椎の形態学的パラメータを解析する可能性を与えます。また、脊椎の体積やシナプス後密度(PSD)(シナプス後のシナプス部分を表す)、シナプス前末端の存在、PSDの滑らかな内径レチラムまたは非定型形態(例えば、多innervat脊椎)の一部の特徴は、3D EMでのみ観察することができる。シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBEM)を採用することにより、従来のシリアル切り離しを行う場合よりも簡単かつ再現性の高い方法で3D EMデータを取得することが可能です。ここでは、SBEM分析のためにマウス海馬サンプルを調製する方法と、このプロトコルを樹状脊椎の免疫蛍光研究と組み合わせる方法を示す。軽度の固定灌流は、脳の半分に光顕微鏡による免疫蛍光試験を行い、残りの半分はSBEMのために準備された。このアプローチは、研究に使用される動物の数を減らします。

上述の高コントラスト法を用いて、マウス脳組織の良好な解像度画像が得られる。SBEM技術によって提供される大きな視野は関心領域の精密な選択を促進する。海馬のCA1領域の大きな画像を撮影し、ラジタム(SR)の長さを測定し、画像を中央に正確に設定した(図2B)。次に、画像のスタックを取得し、対象とするオブジェクト、例えば樹状突起、樹状棘、シナプスの後ナプティクス密度をセグメント化した(図2C、D)。
SBEM技術の使用は、比較的大量の組織を分析し、多inner-innervat型樹状脊柱(図2E)などのまれな事象を認識する可能性を与える- 同じポストナプティック脊椎21に接触するいくつかのシナプス前末端によって特徴付けられる特定のタイプのシナプス。</p...

シリアルブロックフェイススキャン電子顕微鏡(SBEM)は、マウス海馬の樹状脊椎を画像化し、分析するために適用されます。

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

脳内の各ニューロンは、約7,000シナプスによって他の神経細胞と接続されています。哺乳類の脳内のシナプスは、主に樹状棘と呼ばれる膜の小さな突起に位置することを除いて。シナプスや樹状棘等の可塑性は、学習や記憶過程などの重要な脳機能を果たします。電子顕微鏡だけが樹状脊椎にポストナプティック入力があるかどうかを完全に洞察する必要があることに注意することが重要です。樹状脊椎イメージングに関する様々な技術が利用可能です。しかし、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡は、高解像度で大量の組織を画像化するユニークな可能性を与えます。シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡技術では、重金属との強い対比を伴う特殊なサンプル調製プロトコルが必要です。灌流中の私の主な固定は、私たちが軽くした電子顕微鏡のために同じ脳を使用することができました。マウスを屠殺し、軽度の一次固定剤を浸透させた。脳は半分に切断され、1つの半球は免疫蛍光専用の固定剤、凍結保護剤で固定され、クライオスタットを使用してスライスされ、免疫蛍光試験のために処理された。他の半球が電子顕微鏡固定で後方固定された場所で、ビブラートメでスライスし、電子顕微鏡試験のために調製した。シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡研究のための脳スライスは対照的で、樹脂に平らに埋め込まれ、次に海馬のCA1領域をピンに取り付け、シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡で画像化した。黄色いボックスで強調表示されたプロトコルの一部は、ビデオで紹介されました。固定された組織を取り、100個のマイクロバイオティクススライスに切断し、それぞれ3分間冷たいリン酸緩衝液で5回洗浄します。4%オスミウム四酸化水素と3%カリウムフェロシアン化物の1対1の混合物を調製します。最終製品は茶色になります。この混合物にサンプルを浸します。その後、氷の上にサンプルを置きます。そして、この段階から、光からそれらを保護することが重要です。1時間穏やかな揺れでそれらをインキュベートします。その間、TCH溶液を準備する。10ミリリットルの二重蒸留水と0.1グラムのTCHを混ぜます。60°Cに設定したオーブンに1時間置きます。時々解決策を取り上げるためには重要です。準備ができたら、室温まで冷まします。次に、サンプルを2重蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、ろ過されたTCH溶液に浸します。スライスが黒く変わります。室温で20分間インキュベートします。サンプルを2倍蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、2%オスミウム四酸化2%を室温で30分間インキュベートします。再度、サンプルを2重蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、ろ過した1%またはアセテートアセテートアミルに入れます。一晩で摂氏4度でインキュベートします。翌日、D-アスパラギンスの準備から始めます。硝酸鉛をアスパラギン酸溶液と混合し、摂氏60度にあらかじめ温めます。摂氏60度に設定された水浴に混合物を置き、1つの水酸化ナトリウムモルでpHを5.5に調整します。鉛アスパルテでバイアルを閉じ、摂氏60度で30分間放置します。解決策は明確であるべきです。曇った場合は破棄する必要があり、新しいものを準備する必要があります。その間、ガス二重蒸留水でサンプルをそれぞれ3分間5回洗浄し、オーブンで摂氏60度で30分間保管します。サンプルを作りたての鉛アスパラギンス溶液に浸し、摂氏60度に設定したオーブンで20分間インキュベートします。エポキシ樹脂を準備します。材料の重量を量り、加速器DMP 30を追加する前に、少なくとも30分間樹脂をよく混ぜます。エタノールの段階的希釈でウイルスを準備します。その後、オーブンからサンプルを取り出し、それぞれ3分間5回二重蒸留水で再び洗います。その間、1対1の割合で100%エタノールと樹脂を混合し、50%の樹脂を得る。よく混ぜます。これに続いて、エタノールの各希釈でサンプルを5分間脱水する。サンプルは完全に乾燥してはならないことを覚えておいてください。サンプルを最初に50%樹脂に30分間浸潤し、次に100%樹脂で1時間浸潤し、次に再び100%のフレッシュで一晩浸潤する。翌日、サンプルを1時間新鮮な100%樹脂に入れ、フッ素樹脂埋め込みシートの間に埋め込みます。エタノールで脱脂した埋め込みシートを用意し、支持として使用されるガラススライドを脇に置きます。ガラススライドに埋め込みシートを置き、その上に樹脂を一滴置き、木製のスティックを使用して慎重にサンプルを転送します。2枚目で覆います。気泡を避けるようにしてください。組織は非常に壊れやすいので、穏やかにしてください。慎重に埋め込みシートピースの上に別のガラススライドを置き、少なくとも48時間摂氏70度でオーブンでサンプルを治します。層を分離し、カミソリの刃で埋め込まれたサンプルの一部をカットします。パラフィンに移します。これにより、静電気によるサンプルの損失の危険性を最小限に抑えます。エタノールで脱脂したアルミニウムピンを取ります。導電性エポキシをよく混ぜて、少量を使ってサンプルをピンに取り付けます。導電性エポキシを摂氏70度で10分間硬化させます。サンプルブロックの両側をダイヤモンドナイフでトリミングし、組織が露出するまでブロックの面を磨きます。導電性塗料を使用してピンにサンプルを接地し、それを治します。充電を最小限に抑えるために、サンプルは、金または金のパラジウムの薄い層でコーティングされた斑点を付ける必要があります。サンプルを用いたピンをシリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡のチャンバーに入れます。サンプルをナイフに合わせて、チャンバーを閉じてパラメータを設定します。画像のスタックを収集します。記載した方法を用いて、マウス脳組織の画像が得られた。海馬1領域の大きな画像を撮影し、画像は地層放射体の中心に設定された。画像のスタックが取得され、樹状脊椎やシナプスなどの対象物がセグメント化されました。良質の組織形態は、はっきりと見える膜とシナプス小胞およびよく保存されたミトコンドリアで得られた。PSD 95抗体の免疫蛍光試験は、4%PFAを有する軽度の一次固定および伝統的な固定が同等の結果を与えるのを確認した。提示されたプロトコルは、シリアルブロックベースの走査電子顕微鏡、高品質の組織形態、および12の可視膜を使用して脳組織画像を取得し、10の正しいセグメンテーションと再構成を容易にします。私の主な固定化により、PSD 95免疫蛍光と電子顕微鏡イメージング樹状脊椎の解析に同じ脳を使用することが可能になりました。ここでは、PSE 9、500の芽を使用しています。ただし、もう一方も同様に使用できます。

serial-block-face-scanning-electron-microscopy-sbem-for-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ニューロンの軸索と樹状突起を示すマウスの皮質脳組織の固定切片を取ります。樹状突起には、樹状突起棘と呼ばれる突起があり、軸索とシナプスを形成します。脂質に結合するオスミウム-フェロシアン化物と組織をインキュベートし、続いてイメージングのための構造コントラストを強化する別のオスミウムアプリケーションを使用します。高分子に結合してコントラストを高める重金属化合物で染色します。樹脂の埋め込みのためにアルコール濃度を上げて脱水します。ティッシュを樹脂に埋め込んでホルダーにマウントし、金でコーティングすることでイメージング品質を最適化します。集束イオンビーム走査型電子顕微鏡を使用して、3次元イメージングを行います。イオンビームを使用して、樹脂に埋め込まれた組織の薄層を除去し、イメージング面を露出させます。露出した表面に電子ビームを集束させ、反射電子を検出して画像を生成します。 連続スライスとイメージングを行い、3次元画像を再構築して、シナプス的にリンクされた皮質ニューロンネットワークを明らかにします。...

集束イオンビーム走査型電子顕微鏡によるシナプス結合ニューロンの3D再構成

出典:Pekarek, B. T., et.al., CLARITY Tissue Clearingによる無傷のニューロン樹状突起のイメージングと定量化。J. Vis. Exp.

透明化マウス脳における無傷の樹状突起アーバーとスパイン形態の共焦点顕微鏡イメージング

出典:Mukherjee, K., et.al. シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡を用いた脳ミトコンドリアの解析 J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、その準備を示しています。...

シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡による神経細胞ミトコンドリアのイメージング

この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。...

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

大規模2次元電子顕微鏡法(EM)、またはナノトミーは、ナノスケール分解能のEMの組織全体への応用です。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生の脳を健康に、および非侵襲的な脳損傷時に調査するために適用されるナノトミーの普遍的な方法について説明します。...

健康と負傷ゼブラフィッシュ脳の大規模な走査型透過電子顕微鏡（Nanotomy）

哺乳類の脳組織からのミトコンドリアの可視化と分析は困難な作業です。ここでは、シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBFSEM)による3次元(3D)再構成解析を使用して、この重要なエネルギー生成オルガネラの形態学的および体積的解析に関する洞察を得る方法について説明します。...

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

ここでは、シリアルブロック面と集積イオンビーム走査電子顕微鏡を効率的に組み合わせて対象領域を標的とするプロトコルを紹介する。これにより、3...

シリアルブロック面と集値イオンビームスキャン電子顕微鏡を用いた標的研究

このプロトコルは、強力な3Dイメージング技術であるシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)を使用するための日常的な方法を概説しています。SBF-SEMヒンジの適用に成功し、適切な固定および組織染色技術に加え、イメージング設定を慎重に検討します。このプロトコルには、このプロセス全体に対する実用的な考慮事項が含まれています。...

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。...

自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

提示されたプロトコルは、主にシナプス数と樹状突起棘の形態に焦点を当てて、マウスバレル皮質の概日変化を定量化するための透過型電子顕微鏡(TEM)の使用を説明しています。...

マウスバレル皮質における概日シナプス可塑性の解析のための可視化技術としての透過型電子顕微鏡

学ぶシリアルブロック顔走査電子顕微鏡（SBEM）を用いたマウス海馬の樹状突起棘の高解像度イメージング法。この手法はシナプス可塑性と学習・記憶の神経回路理解に貢献します。

樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)

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