樹状脊椎研究のためのシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBEM)
October 2nd, 2021
シリアルブロックフェイススキャン電子顕微鏡(SBEM)は、マウス海馬の樹状脊椎を画像化し、分析するために適用されます。
脳内の各ニューロンは、約7,000シナプスによって他の神経細胞と接続されています。哺乳類の脳内のシナプスは、主に樹状棘と呼ばれる膜の小さな突起に位置することを除いて。シナプスや樹状棘等の可塑性は、学習や記憶過程などの重要な脳機能を果たします。
電子顕微鏡だけが樹状脊椎にポストナプティック入力があるかどうかを完全に洞察する必要があることに注意することが重要です。樹状脊椎イメージングに関する様々な技術が利用可能です。しかし、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡は、高解像度で大量の組織を画像化するユニークな可能性を与えます。
シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡技術では、重金属との強い対比を伴う特殊なサンプル調製プロトコルが必要です。灌流中の私の主な固定は、私たちが軽くした電子顕微鏡のために同じ脳を使用することができました。マウスを屠殺し、軽度の一次固定剤を浸透させた。
脳は半分に切断され、1つの半球は免疫蛍光専用の固定剤、凍結保護剤で固定され、クライオスタットを使用してスライスされ、免疫蛍光試験のために処理された。他の半球が電子顕微鏡固定で後方固定された場所で、ビブラートメでスライスし、電子顕微鏡試験のために調製した。シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡研究のための脳スライスは対照的で、樹脂に平らに埋め込まれ、次に海馬のCA1領域をピンに取り付け、シリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡で画像化した。
黄色いボックスで強調表示されたプロトコルの一部は、ビデオで紹介されました。固定された組織を取り、100個のマイクロバイオティクススライスに切断し、それぞれ3分間冷たいリン酸緩衝液で5回洗浄します。4%オスミウム四酸化水素と3%カリウムフェロシアン化物の1対1の混合物を調製します。
最終製品は茶色になります。この混合物にサンプルを浸します。その後、氷の上にサンプルを置きます。
そして、この段階から、光からそれらを保護することが重要です。1時間穏やかな揺れでそれらをインキュベートします。その間、TCH溶液を準備する。
10ミリリットルの二重蒸留水と0.1グラムのTCHを混ぜます。60°Cに設定したオーブンに1時間置きます。時々解決策を取り上げるためには重要です。
準備ができたら、室温まで冷まします。次に、サンプルを2重蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、ろ過されたTCH溶液に浸します。スライスが黒く変わります。
室温で20分間インキュベートします。サンプルを2倍蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、2%オスミウム四酸化2%を室温で30分間インキュベートします。再度、サンプルを2重蒸留水でそれぞれ3分間5回洗浄し、ろ過した1%またはアセテートアセテートアミルに入れます。
一晩で摂氏4度でインキュベートします。翌日、D-アスパラギンスの準備から始めます。硝酸鉛をアスパラギン酸溶液と混合し、摂氏60度にあらかじめ温めます。
摂氏60度に設定された水浴に混合物を置き、1つの水酸化ナトリウムモルでpHを5.5に調整します。鉛アスパルテでバイアルを閉じ、摂氏60度で30分間放置します。解決策は明確であるべきです。
曇った場合は破棄する必要があり、新しいものを準備する必要があります。その間、ガス二重蒸留水でサンプルをそれぞれ3分間5回洗浄し、オーブンで摂氏60度で30分間保管します。サンプルを作りたての鉛アスパラギンス溶液に浸し、摂氏60度に設定したオーブンで20分間インキュベートします。
エポキシ樹脂を準備します。材料の重量を量り、加速器DMP 30を追加する前に、少なくとも30分間樹脂をよく混ぜます。エタノールの段階的希釈でウイルスを準備します。
その後、オーブンからサンプルを取り出し、それぞれ3分間5回二重蒸留水で再び洗います。その間、1対1の割合で100%エタノールと樹脂を混合し、50%の樹脂を得る。よく混ぜます。
これに続いて、エタノールの各希釈でサンプルを5分間脱水する。サンプルは完全に乾燥してはならないことを覚えておいてください。サンプルを最初に50%樹脂に30分間浸潤し、次に100%樹脂で1時間浸潤し、次に再び100%のフレッシュで一晩浸潤する。
翌日、サンプルを1時間新鮮な100%樹脂に入れ、フッ素樹脂埋め込みシートの間に埋め込みます。エタノールで脱脂した埋め込みシートを用意し、支持として使用されるガラススライドを脇に置きます。ガラススライドに埋め込みシートを置き、その上に樹脂を一滴置き、木製のスティックを使用して慎重にサンプルを転送します。
2枚目で覆います。気泡を避けるようにしてください。組織は非常に壊れやすいので、穏やかにしてください。
慎重に埋め込みシートピースの上に別のガラススライドを置き、少なくとも48時間摂氏70度でオーブンでサンプルを治します。層を分離し、カミソリの刃で埋め込まれたサンプルの一部をカットします。パラフィンに移します。
これにより、静電気によるサンプルの損失の危険性を最小限に抑えます。エタノールで脱脂したアルミニウムピンを取ります。導電性エポキシをよく混ぜて、少量を使ってサンプルをピンに取り付けます。
導電性エポキシを摂氏70度で10分間硬化させます。サンプルブロックの両側をダイヤモンドナイフでトリミングし、組織が露出するまでブロックの面を磨きます。導電性塗料を使用してピンにサンプルを接地し、それを治します。
充電を最小限に抑えるために、サンプルは、金または金のパラジウムの薄い層でコーティングされた斑点を付ける必要があります。サンプルを用いたピンをシリアルブロックベースの走査型電子顕微鏡のチャンバーに入れます。サンプルをナイフに合わせて、チャンバーを閉じてパラメータを設定します。
画像のスタックを収集します。記載した方法を用いて、マウス脳組織の画像が得られた。海馬1領域の大きな画像を撮影し、画像は地層放射体の中心に設定された。
画像のスタックが取得され、樹状脊椎やシナプスなどの対象物がセグメント化されました。良質の組織形態は、はっきりと見える膜とシナプス小胞およびよく保存されたミトコンドリアで得られた。PSD 95抗体の免疫蛍光試験は、4%PFAを有する軽度の一次固定および伝統的な固定が同等の結果を与えるのを確認した。
提示されたプロトコルは、シリアルブロックベースの走査電子顕微鏡、高品質の組織形態、および12の可視膜を使用して脳組織画像を取得し、10の正しいセグメンテーションと再構成を容易にします。私の主な固定化により、PSD 95免疫蛍光と電子顕微鏡イメージング樹状脊椎の解析に同じ脳を使用することが可能になりました。ここでは、PSE 9、500の芽を使用しています。
ただし、もう一方も同様に使用できます。
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概要
この研究では、シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡法（SBEM）を用いて、学習と記憶に関連するシナプス可塑性を理解するために重要な、マウスの海馬における樹状突起棘を画像化し分析しています。この方法により、大規模な組織容積の高解像度イメージングが可能となり、神経ネットワークの接続性と機能的側面に関する洞察が得られます。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 電子顕微鏡
- 神経可塑性
背景
- 樹状突起棘はシナプス接続を持つ小さな突起です。
- 樹状突起棘におけるシナプス可塑性は重要な脳機能の基盤となっています。
- 従来のイメージング技術では、これらの構造に包括的な洞察を提供できない可能性があります。
- SBEMは高解像度で樹状突起棘を視覚化する独自のアプローチを提供します。
研究目的
- マウスの海馬における樹状突起棘の構造的特徴を調査すること。
- SBEMを用いた詳細なイメージング方法を確立すること。
- 神経ネットワークにおけるシナプスの組織と機能の理解を深めること。
使用した方法
- イメージングの主要プラットフォームとしてシリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡法を使用しました。
- 光学顕微鏡と電子顕微鏡の両方で処理されたマウスの海馬サンプルを研究しました。
- 詳細なサンプル準備プロトコルには、重金属によるコントラスト処理と静電管理が含まれていました。
- 海馬CA1領域を準備してイメージングし、高解像度の出力を得ました。
主要な結果
- 樹状突起棘の高解像度イメージが得られ、その空間的組織が示されました。
- イメージング結果から、 postsynaptic 入力の存在に関する洞察が得られました。
- 処理ステップにより、繊細な神経構造の保存とイメージング品質が確保されました。
- プロトコルの検証により、シナプス機能を理解するために必要な信頼性の高い視覚化が可能となりました。
結論
- この研究は、樹状突起棘の構造的複雑さを解明する上でSBEMの有効性を示しています。
- 神経接続が学習と記憶をどのように促進するかをよりよく理解することを可能にします。
- この方法は、シナプスメカニズムと可塑性をさらに探求する可能性を秘めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) enables high-resolution 3D imaging of dendritic spines, providing critical structural insights into synaptic architecture relevant to neuropsychiatric target validation. By combining SBEM with immunofluorescence on the same tissue, the method supports mechanistic de-risking in early discovery by correlating molecular markers with ultrastructural features. This dual-modality approach enhances predictive confidence in target engagement studies while reducing animal use through efficient sample utilization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic spine morphology and postsynaptic density presence to validate synaptic targets involved in plasticity.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming structural correlates of target engagement in neuronal models.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking ultrastructural changes to functional outcomes in learning and memory pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 3D morphological data (spine volume, PSD size) for assay standardization in synaptic target screening.
- Operational Value: Delivers reproducible, nanoscale-resolution outputs suitable for high-content analysis platforms.
- Scalability: Enables large-volume tissue imaging, supporting screening readiness across multiple experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant structural phenotyping of hippocampal circuits, aligning with translational biomarker strategies.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation through correlative light and electron microscopy.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement by confirming target-mediated structural changes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
SBEM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for CNS targets modulating synaptic plasticity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing synaptic organelles and postsynaptic densities.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative morphological readouts with high reproducibility for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables segmentation and reconstruction of dendritic spines and synapses, providing statistical outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via correlated immunofluorescence and EM validation of PSD-95 and other synaptic markers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for structural neuropharmacology across multiple target classes and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in synaptic target validation through direct ultrastructural observation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging workflows, enhancing reproducibility across sites and studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural evidence of target engagement, reducing late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of compounds based on confirmed effects on dendritic spine density and morphology.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy sample preparation, heavy metal contrasting, and resin embedding techniques.
- Depends on access to SBEM instrumentation, conductive epoxy mounting, and charging mitigation via gold/palladium coating.
- Necessitates cross-team standardization between histology, imaging, and image analysis groups for correlated light and EM workflows.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to non-hippocampal brain regions or disease models with altered tissue integrity.
- Includes practical limitations such as prolonged processing times (48+ hour resin curing) and vulnerability to electrostatic loss during sample handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:56
Sample Contrasting
5:29
Dehydration and Resin Embedding
8:02
Trimming and Mounting
9:12
Serial Block‐Face Scanning Electron Microscopy Imaging
9:47
Representative Results: Dendritic Spine Analysis Using Serial Block‐Face Scanning Electron Microscopy
10:35
Conclusion
