秋ミミミズ、スポドプテラ・フルギペルダにおける超活性ピギーバツトランスポザーゼ媒介性生殖細胞変容
2021年9月23日
秋のミズ、 スポドプテラ・フルギペルダでの生殖細胞系列変換に成功し、多動 性ピギーババトランス ポザーゼのmRNAを用いて達成した。
このプロトコルは、ピギーバクトベースの変換システムを用いたトランスジェニック秋ミミミズの生産を示す。私たちは、これらの方法が秋のミミズだけでなく、鱗翅目昆虫においても、変革の改善に利益をもたらすことを願っています。ここで説明する方法は、鱗翅目害虫の生殖系列の形質転換を効率的にする。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士研究員であるXien Chen博士です。まず、12匹のオスの子犬と12匹の雌の子犬を箱に入れることから始めます。大人に餌を与える箱の中に10%スクロース溶液を入れます。
箱をペーパータオルで覆います。2日目のポストエローションでは、一晩で大人を強烈な光にさらす。3日目のポストエローションでは、大人を暗い場所に移します。
位置を越えてから2時間以内に胚を収集します。紙タオルに水滴を加え、新鮮な卵を氷の上のペトリ皿に入れておきます。細かいブラシで卵をグラススライドにそっと移し、グラススライドの上に一つずつ揃えます。
マイクロインジェクションの前に氷の上に整列した卵でガラススライドを保ちます。プラスミドを発現するマイクロリットル当たり200ナノグラムのマイクロリットルピギーバベースのEGFP、マイクロリットル多動ピギーバツトランスポザーゼmRNAあたり200ナノグラム、および無菌蒸留水を自動マイクロインジェクターの補償圧力を使用して卵に注入する。注入した卵を27プラスマイナス1度、60プラスマイナス10%の相対湿度で孵化するまで保管します。
人工的な食事で孵化した幼虫を養い、早いカードと星の段階で各幼虫を1つの小さなカップに移します。子犬を収集し、ケージに約150の女性と150の男性の子犬を配置します。卵を集めるためにケージに30センチメートル×15センチメートルの大きさのペーパータオルを数枚掛けます。
毎日卵とペーパータオルを収集し、孵化するまで適切な状態で卵を保ちます。新生児の幼虫を5分間摂氏4度に保ち、氷の冷たいプレートに移します。蛍光ステレオ顕微鏡で固定化された新生児幼虫をスクリーニングします。
EGFP陽性の新生児を選択し、27プラスマイナス1度の摂氏で約2週間で、プパルステージに上げます。インビトロで合成した多活性ピギーババトランスポザーゼmRNAを1%アガロースゲルを用いて検出した。PDS注入胚はEGFPシグナルを示さなかったのに対し、EGFP発現プラスミドおよび多動性ピグバ菌トランスポザーゼmRNA注入胚はEGP蛍光を示し、ピギーバクの構築が成功したことを示した。
G0成人の自己交差から生じた卵から得られたG1幼虫は強いEGFPシグナルを示した。プロモーターとEGFPフラグメントを含む断片を、EGFP陽性幼虫から分離したゲノムDNAを鋳型としてうまく増幅した。しかし、ゲノムDNAが鋳型の野生型幼虫から単離された場合、同じ断片は検出されなかった。
マイクロインジェクション用の卵は可能な限り新鮮でなければならず、マイクロインジェクションの前に常に氷の上に保管して開発を遅らせる必要があります。この技術は、研究者が害虫の機能性ゲノミクスの質問に答え、この世界的な害虫の遺伝的制御方法を開発する道を開きます。
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概要
本研究では、piggyBacベースの形質転換システムを利用した、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）における生殖細胞系列形質転換を成功させるためのプロトコルを提示します。この手法は、鱗翅目害虫における形質転換効率の向上を可能にし、これらの生物における機能ゲノミクス研究を促進するものです。
研究の主要構成要素
研究分野
- 害虫の遺伝子工学
- 形質転換生物学の手法
- 機能ゲノミクスの応用
背景
- ツマジロクサヨトウは、農業上の重要な害虫である。
- piggyBacトランスポゾンシステムは、遺伝子導入における効率性の高さで知られている。
- 生殖細胞系列の形質転換を改善することは、害虫駆除戦略にとって極めて重要である。
使用された手法
- piggyBacプラスミドおよびmRNAの卵へのマイクロインジェクション
- 生物学的モデルとしてのSpodoptera frugiperda
- 形質転換幼虫のスクリーニングのための蛍光顕微鏡観察
主要な結果
- 形質転換幼虫におけるEGFPの発現成功により、piggyBacシステムの機能性が示された。
- ゲノムDNA増幅を通じてEGFPの発現を確認し、形質転換幼虫と野生型幼虫を区別した。
- この形質転換技術は、遺伝子組換え害虫を産出させる上で効率的であることが証明された。
結論
- 本研究は、Spodoptera frugiperdaにおける生殖細胞系列形質転換のための堅牢な手法を確立した。
- 得られた知見は、農業害虫に対する遺伝的防除策の推進に寄与する。
よくある質問
産業界における重要性
ツマジロクサヨトウのような農業害虫において効率的な生殖細胞系列形質転換を確立することは、害虫駆除パイプラインにおけるターゲットの検証やメカニズムのリスク低減に向けた機能ゲノミクスを可能にします。本プロトコルは、遺伝子機能を解析し、疾患に関連する昆虫モデルで表現型への影響を評価するためのスケーラブルなシステムを提供することで、初期段階の探索を支援します。形質転換の成功は、遺伝的な害虫管理戦略のための下流でのスクリーニングやバイオマーカーの探索を促進します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索とターゲットバリデーション
- 科学的価値：害虫遺伝子の機能解析を可能にし、遺伝的制御戦略のターゲットを検証できる。
- 運用的価値：一貫したターゲット評価を行うため、形質転換系統を作製するための再現可能なシステムを提供する。
- 予測的価値：害虫モデルにおける遺伝子破壊と表現型への影響を関連付けることで、メカニズムに基づくリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 遺伝的摂動の高スループットスクリーニングのための蛍光レポーター系統を構築できる。
- 運用的価値： 標準化されたPCRベースのジェノタイピングおよび挿入部位検証のためのTAIL-PCRを可能にする。
- アッセイへの適用性： 化合物スクリーニングや表現型解析に適した安定的なトランスジェニック系統を作出できる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： 発見段階の遺伝子バリデーションを、遺伝的制御メカニズムの前臨床評価へと結びつけます。
- リスク調整後の進展： 野外適用前の遺伝子の必須性と表現型への影響の評価を容易にします。
- バイオマーカーの整合： 感受性または耐性形質に関連する遺伝的マーカーの同定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、形質転換によるターゲット検証を可能にし、表現型スクリーニングによるリード化合物の同定を支援し、安定した遺伝子モデルを通じて前臨床段階の意思決定に寄与することで、初期創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学：ツマジロクサヨトウにおける遺伝子ノックアウトまたは過剰発現を可能にし、標的の関連性を評価することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：遺伝的または化学的モジュレーターの再現可能なスクリーニングに向けた、標準化された形質転換系統を構築します。
- 分析：定量PCRおよび蛍光リードアウトを提供し、導入遺伝子の組み込みおよび発現レベルを測定します。
- トランスレーショナルリサーチ：遺伝子機能の発見を、遺伝的な害虫駆除アプローチの前臨床評価へと結びつけます。
- 企業内での再利用：鱗翅目の害虫種全般に適用可能な再利用可能な形質転換プラットフォームを確立し、ポートフォリオ全体の標的検証に活用します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：害虫モデルにおける直接的な遺伝子操作を通じて、ターゲット検証の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：標準化されたマイクロインジェクションおよびスクリーニングプロトコルを備えた、拡張可能で再現性のある形質転換システムを提供する。
- 戦略的価値：ターゲットの必須性における生物学的な不確実性を低減し、go/no-go判定の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：害虫モデルを用いたin vivoでの表現型検証に基づき、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 昆虫胚発生学およびマイクロインジェクション技術における専門知識が必要です。
- 検証には、自動マイクロインジェクター、蛍光実体顕微鏡、およびPCR装置が必要です。
- チーム間での胚の採取、注入条件、および形質転換スクリーニングに関するプロトコルの標準化が求められます。
- 鱗翅目（れっしもく）の種によって、温度、湿度、および餌のプロトコルを適応させる必要があります。
- 胚の品質と鮮度に依存し、マイクロインジェクションの効率は発生タイミングの影響を受けます。
