pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)
2021年7月29日
このプロトコルは細胞のエキソサイトーシスおよびendocytosis周期の間に脂質の膜の交通を監視するのにpH敏感な脂質のfluorohoresのクラスを使用する蛍光性イメージ投射方法を示す。
このプロトコルは研究者が生きているセルのexoそしてendocytosisを監視することを可能にする細胞膜のために特定新しいpH敏感な蛍光脂質の調査の性格描写そして適用を記述する。pH感受性緑色蛍光タンパク質に基づく膜タンパク質に関する以前のほとんどのレポーターは、間接的です。脂質模倣物として、ND6は細胞膜に組み込まれるため、脂質膜の輸送を忠実に報告します。
ND6プローブは、生体膜環境に埋め込まれた場合にのみ蛍光を発します。そのプローブの蛍光強度は、ピペラジンヘッド基のプロトン化および脱プロトン化と相関しています。したがって、より低いpHではるかに強い蛍光を発します。
エキソサイトーシスとエンドサイトーシスは、多くのシグナル伝達分子の分泌と取り込みの根底にある普遍的なプロセスです。したがって、ND6は、細胞生物学および生物医科学におけるいくつかの基本的な問題を研究するために使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の学生であるヘイリー、オリバー、ジョナサンです。
まず、生細胞蛍光イメージング用の温度制御と溶液入力出力を可能にするイメージングチャンバーを準備します。プログラム可能なデバイスをセットアップして、灌流溶液を切り替え、イメージング中に定義された時点で電気刺激を送達します。ND6を適量ります。
ジメチルスルホキシドに溶解し、室温で可溶化させます。次に、溶液を短時間超音波処理します。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して粗原液をろ過し、大きな色素凝集体を除去します。
従来型またはマイクロボリューム分光光度計を使用して、405ナノメートルでの色素濃度を測定します。塗布する前に、浴液を使用して原液を1ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈します。原液は室温で暗所に保管してください。
ND6ストック溶液を最終濃度1マイクログラム/マイクロリットルで培地に添加し、インキュベートしてエンドソームなどのエンドサイトーシスされた膜コンパートメントを遍在的に標識します。シナプス小胞の標識の程度を減少させるには、自発的なニューロン活動を薬理学的に抑制します。原稿に記載されているようにシナプス小胞を選択的に標識した後、細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付けます。
温度センサー、灌流入力、および真空チップをイメージングチャンバーに接続します。灌流速度を毎秒約0.2ミリリットルに調整し、NBQXとDAP5を含む予熱した通常のチロード溶液の灌流を開始して、培養中の過剰なND6を除去します。焦点を調整し、接続された神経突起を持つ健康でよく広がるニューロンを含む適切な視野を見つけます。
未解決の二コロイドを含む領域の回避。ND6をロードした細胞を異なる露光時間でイメージングしてみて、最適なイメージング設定を特定してください。刺激と灌流のプロトコル、フレーム間隔、および合計持続時間を、テキスト原稿の情報を使用して設定します。
同期刺激と灌流を伴う画像取得を開始します。イメージング中の刺激と溶液交換を監視します。イメージングが終了したら、灌流を停止します。
カバースリップを取り外し、次の試験のためにイメージングチャンバーを清掃します。すべての画像ファイルをバックアップして電子コピーを作成します。データ抽出用の分析プログラムを選択して開きます。
画像スタックを開くか、解析プログラムにインポートします。バイナリマスクを生成した後、適切な領域サイズと真円度で粒子解析関数を使用して、細胞膜、エンドソーム、リソソーム、またはシナプスブートンに対応する関心領域(ROI)を求めます。視野内の無細胞領域にある 4 つの背景 ROI を選択します。
次に、選択したすべての ROI を保存します。ND6タイムラプス画像スタック内のすべてのフレームを揃えます。最初の画像を基準として設定し、XYドリフトによるアーティファクトを軽減する剛体レジストレーションを使用して残りをそれに位置合わせします。
次に、位置合わせされたイメージ スタックを保存します。保存した ROI をアライメントされた ND6 画像スタックに適用します。画像スタックのすべてのフレームのすべてのROIについて、ND6蛍光の平均ピクセル強度を測定します。
次に、統計分析のために結果をエクスポートします。バックグラウンド ROI の平均強度を計算して、選択したすべての ROI から減算されるベースライン ノイズを取得します。pH 5.5 チロイド溶液の適用中に、選択したすべての ROI について最も高い 3 つの平均強度を平均して、100% として定義される最大蛍光強度(正規化)を取得します。
50 ミリモルの塩化アンモニウムの適用中に、選択したすべての ROI について、3 つの最も低い平均強度を平均し、正規化のために 0% として定義される最小蛍光強度を設定します。各ROIの相対的な蛍光変化を、それ自身の0%および100%の強度に基づいて計算します。個々のROIデータから、平均蛍光の変化、変化速度論、その他の値またはプロットを導出します。
神経細胞にND6を負荷した後、神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点が見られました。ND6とFM464の蛍光強度の間には強い相関関係があり、ND6によるシナプス小胞の染色も示唆された。電気刺激と高カリウム刺激の両方に応答してND6蛍光の減少が観察され、ND6がシナプス小胞膜に存在し、シナプス小胞内腔が放出中に中和されることが示唆された。
徹底的な電気刺激下で、MベータCD治療は、NDイメージングによって測定されたシナプス小胞の放出と回収を有意に減少させ、膜コレステロールがシナプス小胞のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを促進することを示唆しています。Baf A1は、回収されたシナプス小胞の再酸性化を急性にブロックすることにより、刺激後のND6蛍光回復を妨げました。蛍光顕微鏡法の基礎知識は必須です。
生細胞イメージングをサポートするための生理学的条件の慎重な計画は非常に重要です。NDストック溶液の濃度を正確に測定することが重要です。可能であれば、使用する前に毎回原液濃度を再測定してください。
光退色やプローブの分解を防ぐため、直射日光を避けて保管してください。
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概要
本プロトコルでは、細胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスにおける脂質膜の輸送をモニタリングするための、pH感受性脂質プローブを用いた蛍光イメージング法について説明します。ND6脂質模倣体は細胞膜に組み込まれ、生細胞におけるこれらの動的なプロセスのリアルタイムな知見を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 蛍光顕微鏡法
- 細胞生物学
- 神経科学
背景
- ND6プローブはpH感受性を持ち、特に細胞膜用に設計されています。
- 緑色蛍光タンパク質を用いた従来の手法は間接的でしたが、ND6は直接的な測定を可能にします。
- 蛍光強度は、そのヘッドグループのプロトン化および脱プロトン化と相関しています。
- エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスの調査は、細胞シグナリングを理解する上で極めて重要です。
研究目的
- 生細胞における脂質膜ダイナミクスを直接観察する手法を開発すること。
- 細胞生物学における基本的プロセスの研究を促進すること。
- 神経活動中の小胞輸送および膜相互作用のメカニズムに関する知見を提供すること。
使用した手法
- 本研究では、培養ニューロン細胞においてND6を用いた蛍光変化をモニタリングするため、ライブセルイメージングを採用しています。
- 主な手順には、イメージングチャンバーの調製、ND6の可溶化、および制御された灌流が含まれます。
- 画像取得は、電気刺激および灌流プロトコルと同期して行われます。
- 統計解析では、相対的な蛍光変化の算出および関心領域のバイナリマスクの作成が行われます。
主な結果
- ND6プンクタからの強い蛍光は、シナプス小胞の標識が成功したことを示している。
- ND6蛍光の変化は、刺激中のシナプス小胞のダイナミクスと相関している。
- 実験により、コレステロールとシナプス小胞輸送の間の相互作用が明らかになった。
- Baf A1処理はND6蛍光の回復に影響を及ぼし、小胞の再酸性化におけるpHの役割を浮き彫りにした。
結論
- このプロトコルにより、生存ニューロンにおける脂質膜輸送の詳細な調査が可能になります。
- 本手法から得られる知見は、エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスの根底にある細胞メカニズムの理解向上に寄与します。
- これらの知見は、細胞シグナリングおよび神経生物学において重要な意味を持ちます。
よくある質問
業界における重要性
膜脂質のターンオーバーを測定することで、細胞シグナリングと小胞輸送の中心的なプロセスであるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスの物理的根拠について直接的な知見を得ることができます。pH感受性蛍光脂質アナログであるND6を用いることで、細胞膜と細胞内コンパートメント間の脂質リサイクルをリアルタイムかつ定量的に追跡でき、ターゲットバリデーションやアッセイ開発におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、脂質ダイナミクスを分泌および取り込み経路の機能的結果に結びつけることで、前臨床モデルにおける予測信頼性を高めます。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 分泌関連経路における治療仮説として、脂質膜輸送の解析を可能にする。
- 運用的価値： 脂質代謝回転のダイレクトな読み出しを提供し、間接的なタンパク質ベースのレポーターへの依存を低減する。
- 予測的価値： 脂質ダイナミクスを小胞の放出および回収と相関させることで、機能的なターゲット検証を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 刺激中の脂質膜ダイナミクスに比例した定量的な蛍光リードアウトを生成します。
- 運用の価値： 生細胞におけるエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスのキネティクスの標準化された再現可能な測定を可能にします。
- アッセイの準備状況： 化合物スクリーニングおよび経路調節研究のための、検証済み生物学的システムの調製を容易にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 翻訳の連続性：脂質代謝の測定を、神経分泌やインスリン放出などの疾患関連システムへと結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：小胞輸送における膜コレステロールとpHの役割を明確にし、標的の安全性と有効性に関する知見を提供します。
- 予測の信頼性：脂質ダイナミクスを機能的な分泌出力に関連付けることで、リスク調整後の推進決定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、脂質膜ダイナミクスの直接的かつ定量的な読み取りを提供し、メカニズムの理解と機能スクリーニングに有用な情報をもたらすことで、ターゲットバリデーションからリード化合物同定、そして前臨床バリデーションに至る創薬の連続的なプロセスに適合します。
- 探索生物学： エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス経路における脂質介在メカニズムの仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 脂質代謝に対する化合物の影響を評価するための、再現性のある定量的な蛍光出力を提供します。
- 解析： 条件間の比較分析に向けた、平均蛍光変化、キネティクス、および正規化指標の算出を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 神経細胞および内分泌細胞における脂質ダイナミクスと分泌機能を結びつけ、前臨床段階の連続性を支援します。
- エンタープライズ再利用： さまざまな細胞型や刺激パラダイムにわたる脂質膜トラフィッキングをモニタリングするための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 脂質膜のターンオーバーを直接的かつ定量的に測定することが可能となり、分泌経路におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： pHベースの正規化とROI解析により、脂質輸送アッセイの標準化と再現性を実現する。
- 戦略的価値： 脂質のダイナミクスを機能的な小胞の放出および回収に関連付けることで、go/no-go判断の精度を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 膜輸送および分泌プロセスに関与するターゲットについて、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の注意点
- 蛍光顕微鏡法、ライブセルイメージング、およびpH感受性プローブの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- イメージング中の制御された灌流、温度調節、および同期刺激のための装置が必要です。
- 再現性のある結果を得るために、プローブ濃度、希釈、およびイメージング設定のチーム間での標準化が求められます。
- 異なる細胞型、膜組成、および刺激プロトコルへの適応に関する検討が含まれます。
- 光退色のリスク、遮光保存の必要性、ならびに露光時間とpH溶液の最適化などの実用的な制限事項が含まれます。
