Name: pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶpH感受性蛍光脂質プローブND6を用いた細胞膜脂質動態の可視化法。生細胞でのエンドサイトーシスとエキソサイトーシスをリアルタイムに観察し、神経細胞におけるシナプス小胞の動態解析に応用できます。

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この研究は、フロリダアトランティック大学学部研究調査局助成金(M.J.S.)、フロリダ州保健省のEd and Ethel Mooreパイロット助成金20A17(Q.Z.)、アルツハイマー病協会の助成金AARG-NTF-19-618710(Q.Z.)、およびNIA R21助成金AG061656-01A1(Q.Z.)の支援を受けました。

以下のプロトコルには、(1)確立されたプロトコル22に基づいてマウス海馬および皮質培養を確立するための簡略化された手順、(2)生きたニューロン用の落射蛍光顕微鏡のセットアップの簡単な紹介、(3)マウスニューロンにおけるND6のロードとイメージングの詳細な説明、(4)ND6シグナルによる膜輸送の定量化に関する議論が含まれます。すべての手順は、フロリダアトランティック大学のバイオセーフティとIACUCのガイドラインに従います。ND6の合成は、以前に20に記載されている。
1. マウス海馬および皮質培養の調製
注意: 特に指定がない限り、すべてのステップはバイオセーフティレベル2の層流フードで実行する必要があります。すべてのツールと材料を滅菌します。
<ol><li>サイズ5の鉗子を使用して、ガラスカバーガラスをマルチウェル培養プレートに入れます。 注:たとえば、24ウェルプレートは12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> のカバーガラスに最適です。</li>
	<li>細胞培養表面をコーティングするために、適切な量の細胞外マトリックスを添加します(例:カバーガラス12 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> あたり75 μLの基底膜マトリックス溶液、 材料表を参照)</li>
	<li>調製したプレートを組織培養インキュベーター(5%CO2、湿度100%、37°C)に1〜4時間入れて、基底膜マトリックスの架橋を可能にします。</li>
	<li>動物を生贄に捧げ、頭蓋骨を開き、20%のウシ胎児血清(H + 20)を含む3mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む35mmのシャーレに脳全体を移します。正中線に沿って脳を切断し、層流解剖フードで皮質と海馬を分離して汚染を減らします。</li>
	<li>マイクロハサミを使用して、組織を小片(~1 mm3)に切ります。これらの組織を、5 mLのH+20を含む15 mLのコニカルチューブに移します。</li>
	<li>組織を5 mLのH+20で3回、5 mLのHBSSで3回洗浄します。</li>
	<li>1.5 mLの1%トリプシンとエチレンジアミン四酢酸を加え、37°Cで10分間インキュベートして酵素消化します。</li>
	<li>手順1.6を繰り返し、最後に真空を使用してHBSSを吸引します。</li>
	<li>2.95 g/L MgSO4•7H2Oを含む1 mLのHBSS中で、ファイヤーポリッシュガラスピペットを使用して組織を機械的に解離します。</li>
	<li>細胞懸濁液を400 × g、4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を適切な量の培地に再懸濁して、~10,000,000細胞/mlの濃度を得ます。</li>
	<li>細胞を~1,000,000細胞/cm2 で播種し、培養液をインキュベーター(5%CO2、湿度100%、37°C)に1〜4時間入れて、細胞をガラスカバーガラスに付着させやすくします。</li>
	<li>適切な量の培地を添加します(例:24ウェルプレートの場合はウェルあたり1 mL)。1週間後に同量の培地を添加します。2週間後、毎週既存の培地の半分を新鮮な培地に交換します。</li>
</ol>2. 生細胞蛍光イメージングのための顕微鏡セットアップ
注:例示的なイメージングセットアップ(図5)は、少なくとも倒立蛍光顕微鏡( 材料表を参照)、自動シャッター付き蛍光光源、蛍光フィルターセット(例えば、ND6のイメージングには、励起に405/10BP、ダイクロイックに495LP、および発光に510/20BPを使用)、および高感度カメラ(材料表)を含み、これらはすべて画像取得ソフトウェア(材料表)によって制御される。
<ol><li>生細胞蛍光イメージングのための温度制御と溶液の入出力が可能なイメージングチャンバーを準備します。 注:例えば、このプロトコルでは、加熱プラットフォームに固定された改造されたオープンバスイメージングチャンバーを使用しました(図6)。</li>
	<li>プログラム可能なデバイスをセットアップして、灌流溶液を切り替え、イメージング中に定義された時点で電気刺激を送達します。 メモ:定量分析には、ハードウェアとソフトウェアの同期が必要です(図7)。例えば、このプロトコルでは、イメージングカメラからのトリガ出力を使用して、マルチチャンネル灌流システムおよび矩形パルス刺激器を制御する自動スイッチデバイスを制御するコンピュータプログラムを起動した。</li>
	<li>2つ以上の蛍光レポーターを共イメージングするには、フィルターセットを順次切り替えるか、異なる蛍光発光を同時に分割して同じカメラに投影することにより、マルチチャンネル蛍光イメージングを実行します。</li>
</ol>3. 神経細胞培養におけるND6のローディングとイメージング
<ol><li>適量のND6を秤量し、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解し、室温で可溶化させます。短時間(例:3分)超音波処理する。0.22 μmフィルターを使用して粗原液をろ過し、大きな色素凝集体を除去します。濾過後、ε = 10,700 M-1 cm-1 を使用した従来のまたは微量分光光度計を使用して、405 nm の吸収分光法により色素濃度を決定します。</li>
	<li>塗布する前に、浴液を使用して原液を1μMの濃度に希釈します。原液は室温で暗所に保管してください。</li>
	<li>エンドソームおよびシナプス小胞の標識<ol><li>エンドソームなどのエンドサイトーシスされたメンブレンコンパートメントをユビキタスに標識するには、ND6ストック溶液(例:DMSO中の1 mM)を最終濃度1 μMの培地に添加し、5%CO2、100%湿度、37°Cで30分間インキュベートします。SV標識の程度を小さくするには、薬理学的に自発的なニューロン活動を抑制します。例えば、活動電位を遮断するためにテトロドトキシンを使用したり、興奮性伝達を阻害するために2,3-ジオキソ-6-ニトロ-1,2,3,4-テトラヒドロベンゾ[f]キノキサリン-7-スルホンアミド(NBQX)およびD-(-)-2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸(D-AP5)を使用したりします23。</li>
		<li>SVを選択的に標識するには、短時間だが強い刺激を用いて、シナプス前部のエキソ/エンドサイトーシスを誘発する。まず、培養カバーガラスを、室温で2 mLの通常のTyrode溶液を含む35 mm <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62717/62717eq01v2.jpg"> シャーレに移します。次に、ND6 ストック溶液を high-K+ Tyrode 溶液(90 mM KCl)で最終濃度 1 μM に希釈します。第三に、ペトリ皿内の通常のTyrode溶液をND6含有high-K+ Tyrode溶液と交換し、室温で2分間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>ND6標識細胞培養液を、10 μM NBQXおよび10 μM D-AP5を含む予熱した通常のTyrode溶液で満たされたイメージングチャンバーに移します。</li>
	<li>灌流速度を~0.2 mL/s(すなわち、1秒間に1滴)に調整し、NBQXとD-AP5を含む予熱した通常のチロード溶液の灌流を開始して、培養中の過剰なND6を除去します。</li>
	<li>焦点を調整し、接続された神経突起を持つ健康でよく広がるニューロンを含む適切な視野を見つけます。未解決の染料コロイドを含む領域は避けてください。</li>
	<li>ND6負荷細胞を異なる露光時間でイメージングしてみて、最適なイメージング設定を特定してください。 注:最適な露光時間を得るには、結果として得られる画像の最高ピクセル蛍光強度はビット範囲の約半分であり(たとえば、16ビット画像の場合、ビット範囲は0〜65,535です)、酸性浴溶液を塗布すると蛍光がさらに増加します。選択した露光時間は、すべてのND6イメージングに使用する必要があります。</li>
	<li>刺激と灌流のプロトコル、フレーム間隔、および合計時間を設定します。例えば、以下のプロトコルでは、30 秒のベースライン、10 秒の 30 Hz 電界刺激、50 秒の回復、120 秒の 90 mM K+、60 秒の回復、60 秒の NH4Cl による 60 秒のチロード溶液、pH 5.5 での 60 秒のチロード溶液、フレーム間隔 3 秒を使用します。</li>
	<li>同期した刺激と灌流を伴う画像取得を開始します。イメージング中のシミュレーションと溶液交換を監視します。</li>
	<li>イメージング終了後に灌流を停止し、カバーガラスを取り外し、次の試行のためにイメージングチャンバーを清掃します。</li>
</ol>4. ND6蛍光の変化による膜輸送の定量化
<ol><li>すべての画像ファイルをバックアップまたは電子コピーします。</li>
	<li>データ抽出用の解析プログラム(ImageJ24 や FIJI25 などのオープンソースの画像解析ソフトウェアなど)を選択します。</li>
	<li>画像スタックを開くか、解析プログラムにインポートします。</li>
	<li>最初の画像を基準として設定し、 Rigid Registration26などの関数/プラグインを使用して残りをそれに揃えると、xyドリフトによるアーティファクトが軽減されます。画像の例については、 図 8 を参照してください。</li>
	<li>30秒のベースライン前で取得したすべての画像を平均して、参照画像を生成します。後で参照できるように、この画像のコピーを保存します。</li>
	<li>強度のしきい値を設定して、ベースライン平均化されたイメージからバイナリ イメージを生成します。</li>
	<li>ImageJ の Watershed または別のプログラムの同様の関数を使用して、接続している神経突起または細胞を分離します。</li>
	<li>適切な領域サイズと真円度で 粒子分析 機能を使用して、細胞膜、エンドソーム、リソソーム、またはシナプスブートンに対応する関心領域(ROI)を求めます。選択したすべての ROI を保存します。</li>
	<li>視野内の無細胞領域にある 4 つの背景 ROI を選択します。</li>
	<li>画像スタックの各フレームで各 ROI の平均ピクセル強度を測定し、統計分析のために結果をエクスポートします。</li>
	<li>バックグラウンド ROI の平均強度をベースライン ノイズとして計算し、各 ROI の平均ピクセル強度から差し引きます。</li>
	<li>pH 5.5 Tyrodeの溶液を塗布した際に、選択した各ROIの3つの最も高い平均強度を平均して、正規化のために100%と定義される最大蛍光強度を求めます。</li>
	<li>50 mM NH4Cl の適用中に、選択したすべての ROI について最も低い 3 つの平均強度を平均し、最小蛍光強度(正規化では 0% と定義)を設定します。</li>
	<li>各ROIの相対的な蛍光変化を、それ自身の0%および100%の強度に基づいて計算します。個々のROIデータから、平均蛍光変化、変化速度論、その他の値/プロットを導き出します。</li>
</ol>

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<li>Duke, R. M., Veale, E. B., Pfeffer, F. M., Kruger, P. E., Gunnlaugsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+and+fluorescent+anion+sensors%3A+An+overview+of+recent+developments+in+the+use+of+1%2C8-naphthalimide-based+chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Colorimetric and fluorescent anion sensors: An overview of recent developments in the use of 1,8-naphthalimide-based chemosensors.</a> Chemical Society Reviews. 39 (10), 3936-3953 (2010).</li>
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<li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200(1992).</li>
<li>Afuwape, O. A., Kavalali, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+vesicle+exocytosis-endocytosis+with+pH-sensitive+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic vesicle exocytosis-endocytosis with pH-sensitive fluorescent proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1474, 187-200 (2016).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益がないことを宣言します。

1,1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3′-テトラメチルインドカルボシアニン(DiI)や3,3′-ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DiO)などの脂質系色素は、細胞形態の解明や、ニューロンの軸索突起などの細胞プロセスの追跡に長い間使用されてきました。FM1-43などのスチリル色素は、エキソサイトーシスの研究のために発明され、成功裏に使用されている34。膜親和性が低いため、エンドサイトーシスされた小胞を選択的に標識し、細胞膜に残っている色素を一定の灌流によって洗い流しながら、エンドサイトーシス小胞を捕捉します。そのため、スチリル染料は小胞リサイクルの連続モニタリングには適していません。
pH感受性GFP(すなわち、pHluorin)の最近の発明により、VAMPIIやSynaptophysin35などの小胞膜タンパク質にタグ付けされた場合、小胞のリサイクルを繰り返し可視化することが可能になりました。同じ原理に従って、pH感受性蛍光色素を脂質分子にタグ付けすることで、エキソサイト...

脂質二重層は、最も一般的な生体分子集合体の1つであり、すべての細胞に不可欠です。細胞の外では、細胞とその環境を接する原形質膜を形成します。細胞内では、指定された機能に特化したさまざまな細胞小器官を区画化します。脂質膜は、静止しているというよりはむしろ動的であり、常に融合と分裂を経験し、生体材料の輸送、オルガネラの改革、形態の変化、および細胞間コミュニケーションを媒介します。脂質膜は、ほとんどすべての細胞プロセスの物理的基盤であり、その機能不全は、がん1からアルツハイマー病2に至るまでのさまざまな疾患において重要な役割を果たしています。脂質分子はタンパク質に比べて多様性がはるかに低いですが、これまでの膜研究は主にタンパク質中心でした。例えば、エキソサイトーシスにおける脂質よりもタンパク質機構について多くのことが知られている3,4,5。さらに、表面および細胞内膜における脂質の組織化、分布、動態、および恒常性は、膜タンパク質と比較してほとんど未解明のままです6。
突然変異誘発などの最新の分子生物学技術は、脂質ではなくタンパク質を研究するための方法論的利点を提供するため、これは驚くべきことではありません。例えば、pH感受性緑色蛍光タンパク質(別名pHluorin)を小胞タンパク質にトランスジェニックタグ付けすると、エキソ/エンドサイトーシス中の小胞タンパク質の代謝回転量と速度の定量的測定が容易になります7,8,9。しかし、生体内で膜脂質を遺伝子改変することはほとんど不可能です。さらに、タンパク質の量と分布の定性的および定量的操作は、脂質の操作よりもはるかに実行可能です10。それにもかかわらず、天然および合成の蛍光脂質が単離され、in vitroおよびin vivoで内因性膜脂質をシミュレートするために開発されています11。広く使用されている蛍光脂質の1つのグループは、膜増強蛍光を示し、ニューロンにおけるシナプス小胞(SV)放出を研究するための強力なツールであるFM1-43などのスチリル色素です12。近年、環境感受性脂質色素が発明され、膜電位11、相順序13、分泌14など、さまざまな細胞膜特性を研究するための新しいクラスのレポーターとして広く使用されています。
蛍光がpH感受性(例:pHluorin)と膜感受性(例:FM1-43)の両方を持つ新しいクラスの脂質模倣物が開発され、細胞膜およびエンドソーム/リソソーム内の脂質分布と、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質交通を直接測定しました。この目的のために、分子内電荷移動によるプッシュプル特性を示すよく知られたソルバトクロミック蛍光色素を選択しました。既存のソルバトクロミック蛍光色素の中で、1,8-ナフタルイミド(ND)スキャフォールドは比較的簡単に改変でき、タグ付けに汎用性があり、光物理学ではユニークであり15、したがってDNAインターカレーター、有機発光ダイオード、および生体分子センサー16,17,18に使用されています。
ND足場のC4位に電子供与基を付着させると、プッシュプル構造が生成され、励起状態での電子密度が再分配されることで双極子モーメントが増加する19,20。このような分子内電荷移動は、大きな量子収率とストークスシフトを生成し、明るく安定した蛍光をもたらす21。このグループは最近、ND足場に基づく一連のソルバトクロミック脂質類似体を開発し、良好な合成収率でそれらを得ました20。
分光特性評価により、これらの生成物の中でND6は最高の蛍光特性を有することが示されています(図1)20。まず、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、GFPなどの一般的な蛍光色素と比較して、励起ピークと発光ピークが十分に分離されているため( 図2A、Bではそれぞれ~400 nmと~520 nm)、スペクトル的に分離できるため、マルチカラーイメージングに有用です。第二に、ND6蛍光はミセル存在下で8倍以上の蛍光を示し(図2C)、強い膜依存性を示唆しています。異なる種類の細胞を用いた以前の生細胞蛍光イメージング研究では、ND620による優れた膜染色が示されました。第3に、溶液のpHを7.5(細胞外または細胞質環境で一般的に見られる)から5.5(エンドソームおよびリソソームで一般的に見られる)に下げると、ND6の蛍光が約2倍に増加し(図2D)、pH感受性を示します。さらに、分子動力学シミュレーションでは、ND6は脂質二重層に容易に組み込まれ、ND足場は膜の外側を向いており、ピペラジン残基はリン脂質ヘッド基と強い相互作用を示しています(図3)。これらの特徴により、ND6は、エキソ/エンドサイトーシス中の膜脂質代謝回転を可視化および測定するための理想的な蛍光脂質類似体となっています。
この論文では、培養マウス海馬ニューロンを用いてSV脂質の代謝回転速度と動態を研究する方法を紹介します。高K+ チロード溶液でニューロンを刺激することにより、SVと原形質膜にND6をロードしました(図4A、B)。続いて、ニューロンを異なる刺激で再刺激し、NH4Cl含有とpH 5.5のTyrode溶液で再刺激しました(図4D)。このプロトコルは、さまざまな状況下で組み立てられたエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシス率の定量的測定を容易にします(図4C)。

<table><tbody><tr><td>Digidata 1440A データ取得システム</td><td>分子デバイス</td><td>Digidata 1440A</td><td>同期刺激・溶液交換用</td></tr><tr><td>デュアルチャンネル温度調節器</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-344B</td><td>生細胞イメージング用</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>オメガサイエンティフィック</td><td>FB-01</td><td>解剖・組織培養用H+20溶液製造用</td></tr><tr><td>浜松 Flash4.0 sCOMSカメラ</td><td>浜松製作所</td><td>C13440-20CU</td><td>高感度カメラ</td></tr><tr><td>ハンクスバランスソルトソリューション</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td>解剖および組織培養に使用されるH+20溶液の作製用</td></tr><tr><td>加熱プラットフォーム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PH-1</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>354234</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>Micro-G 除振テーブル</td><td>TMC</td><td>63-564</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>Micro-manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>NA</td><td>画像取得制御用</td></tr><tr><td>マルチラインインラインソリューションヒーター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>SHM-6</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>ニューロベースプラス 培地</td><td>THermoFisher サイエンティフィック</td><td>A3582901</td><td>組織培養用</td></tr><tr><td>ニコン Ti-E 倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Ti-E/B</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 デジタルCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>C1340-20CU</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>灌流チャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26G</td><td>生細胞イメージング用</td></tr><tr><td>6チャンネルバルブ制御 灌流システム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>VC-6</td><td>溶液交換用</td></tr><tr><td>スクエアパルス刺激装置</td><td>グラスインスツルメント</td><td>SD9</td><td>電界刺激用</td></tr></tbody></table>

ph 感受性蛍光脂質アナログ nd6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

Measuring Membrane Lipid Turnover with the pH-sensitive Fluorescent Lipid Analog ND6

エキソ/エンドサイトーシスは、細胞とその環境間、および異なる細胞間での生体分子の交換を媒介する一般的なプロセスです。特殊な細胞は、このプロセスを使用して、β細胞からのインスリン分泌や化学シナプスからの神経伝達物質の放出などの重要な身体機能を実行します。その生理学的重要性から、エキソ/エンドサイトーシスは細胞生物学において最も研究されているトピックの1つです。このプロセスを遺伝子およびタンパク質レベルで研究するために多くのツールが開発されているため、このプロセスに関与するタンパク質機構について多くのことが知られています。しかし、エキソ/エンドサイトーシスの物理的基盤である膜脂質代謝回転を測定する方法はほとんど開発されていません。
この論文では、pH依存性蛍光を示す新しい蛍光脂質類似体を紹介し、原形質膜と分泌小胞の間の脂質リサイクルを追跡するためのそれらの使用を実証します。これらの類似体は、単純なpH操作により、表面および細胞内膜コンパートメント全体の脂質分布の定量化や、エキソ/エンドサイトーシス中の脂質代謝回転率の測定も可能にします。これらの新しい脂質レポーターは、細胞生物学や神経科学などのさまざまな生物学研究分野にとって大きな関心事です。

SVは、誘発されたエキソ/エンドサイトーシスを介した神経伝達物質の放出に特化しています27。SVは内腔が酸性度が高く(pH 5.5)、ND6に最適です。ND6がSVにアクセスできるようにするために、SVエキソ/エンドサイトーシスを誘発するために高K+ 刺激を使用しました。予想通り、負荷後には神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点状が現れた(図9A)。 図4B に示すラインプロファイルは、ND6(緑の曲線)とFM4-64の点状(赤色の曲線)の間に強い重なりがあることを示しました。ND6とFM4-64の蛍光強度の間には強い相関関係があることから、ND6のSV染色も示唆されています(図9B)。
電気刺激と高K+ 刺激を用いて、それぞれ容易に放出可能なプール(RRP、すなわち、放出確率の高いSV)および予備プールSV(すなわち、放出確率の低いSV)の放...

このプロトコルは細胞のエキソサイトーシスおよびendocytosis周期の間に脂質の膜の交通を監視するのにpH敏感な脂質のfluorohoresのクラスを使用する蛍光性イメージ投射方法を示す。

pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

Exo-/endocytosis is a common process mediating the exchange of biomolecules between cells and their environment and among different cells. Specialized ...

このプロトコルは研究者が生きているセルのexoそしてendocytosisを監視することを可能にする細胞膜のために特定新しいpH敏感な蛍光脂質の調査の性格描写そして適用を記述する。pH感受性緑色蛍光タンパク質に基づく膜タンパク質に関する以前のほとんどのレポーターは、間接的です。脂質模倣物として、ND6は細胞膜に組み込まれるため、脂質膜の輸送を忠実に報告します。ND6プローブは、生体膜環境に埋め込まれた場合にのみ蛍光を発します。そのプローブの蛍光強度は、ピペラジンヘッド基のプロトン化および脱プロトン化と相関しています。したがって、より低いpHではるかに強い蛍光を発します。エキソサイトーシスとエンドサイトーシスは、多くのシグナル伝達分子の分泌と取り込みの根底にある普遍的なプロセスです。したがって、ND6は、細胞生物学および生物医科学におけるいくつかの基本的な問題を研究するために使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の学生であるヘイリー、オリバー、ジョナサンです。まず、生細胞蛍光イメージング用の温度制御と溶液入力出力を可能にするイメージングチャンバーを準備します。プログラム可能なデバイスをセットアップして、灌流溶液を切り替え、イメージング中に定義された時点で電気刺激を送達します。ND6を適量ります。ジメチルスルホキシドに溶解し、室温で可溶化させます。次に、溶液を短時間超音波処理します。0.22マイクロメートルのフィルターを使用して粗原液をろ過し、大きな色素凝集体を除去します。従来型またはマイクロボリューム分光光度計を使用して、405ナノメートルでの色素濃度を測定します。塗布する前に、浴液を使用して原液を1ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈します。原液は室温で暗所に保管してください。ND6ストック溶液を最終濃度1マイクログラム/マイクロリットルで培地に添加し、インキュベートしてエンドソームなどのエンドサイトーシスされた膜コンパートメントを遍在的に標識します。シナプス小胞の標識の程度を減少させるには、自発的なニューロン活動を薬理学的に抑制します。原稿に記載されているようにシナプス小胞を選択的に標識した後、細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付けます。温度センサー、灌流入力、および真空チップをイメージングチャンバーに接続します。灌流速度を毎秒約0.2ミリリットルに調整し、NBQXとDAP5を含む予熱した通常のチロード溶液の灌流を開始して、培養中の過剰なND6を除去します。焦点を調整し、接続された神経突起を持つ健康でよく広がるニューロンを含む適切な視野を見つけます。未解決の二コロイドを含む領域の回避。ND6をロードした細胞を異なる露光時間でイメージングしてみて、最適なイメージング設定を特定してください。刺激と灌流のプロトコル、フレーム間隔、および合計持続時間を、テキスト原稿の情報を使用して設定します。同期刺激と灌流を伴う画像取得を開始します。イメージング中の刺激と溶液交換を監視します。イメージングが終了したら、灌流を停止します。カバースリップを取り外し、次の試験のためにイメージングチャンバーを清掃します。すべての画像ファイルをバックアップして電子コピーを作成します。データ抽出用の分析プログラムを選択して開きます。画像スタックを開くか、解析プログラムにインポートします。バイナリマスクを生成した後、適切な領域サイズと真円度で粒子解析関数を使用して、細胞膜、エンドソーム、リソソーム、またはシナプスブートンに対応する関心領域(ROI)を求めます。視野内の無細胞領域にある 4 つの背景 ROI を選択します。次に、選択したすべての ROI を保存します。ND6タイムラプス画像スタック内のすべてのフレームを揃えます。最初の画像を基準として設定し、XYドリフトによるアーティファクトを軽減する剛体レジストレーションを使用して残りをそれに位置合わせします。次に、位置合わせされたイメージ スタックを保存します。保存した ROI をアライメントされた ND6 画像スタックに適用します。画像スタックのすべてのフレームのすべてのROIについて、ND6蛍光の平均ピクセル強度を測定します。次に、統計分析のために結果をエクスポートします。バックグラウンド ROI の平均強度を計算して、選択したすべての ROI から減算されるベースライン ノイズを取得します。pH 5.5 チロイド溶液の適用中に、選択したすべての ROI について最も高い 3 つの平均強度を平均して、100% として定義される最大蛍光強度(正規化)を取得します。50 ミリモルの塩化アンモニウムの適用中に、選択したすべての ROI について、3 つの最も低い平均強度を平均し、正規化のために 0% として定義される最小蛍光強度を設定します。各ROIの相対的な蛍光変化を、それ自身の0%および100%の強度に基づいて計算します。個々のROIデータから、平均蛍光の変化、変化速度論、その他の値またはプロットを導出します。神経細胞にND6を負荷した後、神経突起に沿った明るい緑色の蛍光点が見られました。ND6とFM464の蛍光強度の間には強い相関関係があり、ND6によるシナプス小胞の染色も示唆された。電気刺激と高カリウム刺激の両方に応答してND6蛍光の減少が観察され、ND6がシナプス小胞膜に存在し、シナプス小胞内腔が放出中に中和されることが示唆された。徹底的な電気刺激下で、MベータCD治療は、NDイメージングによって測定されたシナプス小胞の放出と回収を有意に減少させ、膜コレステロールがシナプス小胞のエキソサイトーシスとエンドサイトーシスを促進することを示唆しています。Baf A1は、回収されたシナプス小胞の再酸性化を急性にブロックすることにより、刺激後のND6蛍光回復を妨げました。蛍光顕微鏡法の基礎知識は必須です。生細胞イメージングをサポートするための生理学的条件の慎重な計画は非常に重要です。NDストック溶液の濃度を正確に測定することが重要です。可能であれば、使用する前に毎回原液濃度を再測定してください。光退色やプローブの分解を防ぐため、直射日光を避けて保管してください。

measuring-membrane-lipid-turnover-with-ph-sensitive-fluorescent-lipid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、グラミシジンチャネル活性の尺度としての蛍光消光の速度を監視し、高速蛍光ベースのアッセイをご紹介。グラミシジンのチャンネルは、タンパク質にまたがる二重層により検知されたとして、脂質二重層の特性の変化を監視するための分子力変換器として使用されています。...

グラミシジンベースの蛍光アッセイ、脂質二重層のプロパティの変更の可能性小分子を決定するための

in vivoイメージングのための蛍光色素の使用は、オプソニン化、迅速なクリアランス、低い検出感度、および宿主に対する細胞毒性の影響によって大幅に制限される可能性があります。フィルムの水和と押出しによって蛍光色素をリポソームにカプセル化すると、蛍光の消光と保護が可能になり、高い検出感度でin...

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液滴単層を平らな単層に融合させることにより、流体-流体界面における表面活性種の横方向の拡散を測定する新しい技術を提示します。...

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蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。...

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pH 感受性蛍光脂質アナログ ND6 による膜脂質代謝回転の測定(英語)

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