ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価
2021年7月9日
ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。
以下のプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からのヒト腸および結腸オルガノイドの生成を説明する。この技術により、ユーザーは腸のパターン化に関与する経路を調べることができます。この技術により、ユーザーは同種遺伝子である領域特異的なオルガノイドを生成できます。このプロトコルは、腸のパターンの確立と維持を調節する要因についての洞察を提供する可能性があります。
[ナレーター]まず、細胞外マトリックスまたはECMでコーティングされた24ウェルプレートをバイオセーフティキャビネット内に30分間置き、室温に到達させます。mTeSR1完全培地細胞剥離溶液とアドバンスドDMEMを摂氏37度のビーズバスに入れ、30分間温めます。13ミリリットルのmTeSR1と13マイクロリットルの10ミリモルY-27632Rho関連プロテインキナーゼまたはROCK阻害剤を添加して、50ミリリットルのコニカルチューブにプレーティング培地を調製します。6ウェルプレートから細胞を採取するには、3〜4ウェルから培地を吸引し、ウェルあたり2ミリリットルの高度なDMEMで1回洗浄します。高度なDMEMを吸引し、1ミリリットルの細胞解離溶液を各ウェルに分注します。プレートを5%二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーター内で5〜7分間インキュベートします。5ミリリットルのピペットを使用して上下に4〜5回ピペッティングして細胞懸濁液を調製することにより、細胞の塊を解離します。各ウェルに2ミリリットルの高度なDMEMを追加します。4〜5回ゆっくりとピペットを上下にピペットし、15ミリリットルの円錐形チューブに移します。細胞を室温で300Gで3分間スピンダウンします。細胞ペレットを吸引せずにチューブから培地を吸引します。そして、調製したmTeSR1とROCK阻害剤の培地を6ミリリットル加えます。3〜4回上下にピペッティングして、細胞を穏やかに再懸濁します。次に、懸濁液を50ミリリットルチューブ内の残りのmTeSR1およびROCK阻害剤培地に移します。4〜5回激しく再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞をプレーティングする直前に、24ウェルプレートからECMを吸引します。2〜3回上下にピペッティングして細胞を再度再懸濁し、各ウェルに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を分注します。プレートを時計回りに3回、反時計回りに3回、前後に3回、左右に3回静かに揺らして、細胞を均一に分散させます。プレートを摂氏37度、2酸化炭素5%のインキュベーターに移し、24時間インキュベートします。24時間後、使用済み培地を吸引します。mTeSR1のウェルあたり0.5ミリリットルを加え、同じ条件下で24時間再度インキュベートします。100マイクログラム/ミリリットルのアクチビンAストック溶液と100マイクログラム/ミリリットルのBMP4をコニカルチューブ内のアクチビン1日目培地に希釈することにより、アクチビン1日目完全培地を調製します。摂氏37度のビーズ浴で培地を温めます。24ウェルプレートからmTeSR1培地を吸引し、ウェルあたり0.5ミリリットルのアクチビンデイワン培地を加えます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに入れ、24時間インキュベートします。24時間後に細胞をチェックします。100マイクログラム/ミリリットルのアクチビンAストック溶液を円錐形のチューブ内のアクチビン2日目培地に希釈して、アクチビン2日目完全培地を調製し、チューブを摂氏37度のビーズバスに入れます。24ウェル分化プレートを二酸化炭素インキュベーターから取り外し、使用済み培地を取り除きます。ウェルあたり0.5ミリリットルの予熱したアクチビン2日目培地を分注し、プレートを二酸化炭素インキュベーター内に24時間戻します。100マイクログラム/ミリリットルのアクチビンAストック溶液を円錐形のチューブ内のアクチビン3日目培地に希釈してアクチビン3日目完全培地を調製し、チューブを摂氏37度のビーズバスに入れます。使用済み培地を取り出し、ウェルあたり0.5ミリリットルのアクチビン3日目培地を分注します。最終的な内胚葉を後腸中部スフェロイドに分化することから始めるには、50ミリリットルの円錐形チューブにFGF4を含む25ミリリットルの中後腸誘導培地を加え、摂氏37度のビーズバスに30分間置きます。完全な中後腸誘導培地を調製するには、培地が温まった後、7.5マイクロリットルのCHIR99021を加えます。使用済み培地を取り出し、ウェルあたり0.5ミリリットルの中後腸誘導培地を分注し、摂氏37度、2%二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。翌日、単層内の細胞の凝縮が起こった後、使用済み培地を新鮮な中後腸誘導培地と交換し、プレートを24時間インキュベートするために戻します。培地の交換中に浮遊スフェロイドを廃棄しないように、古い培地を15ミリリットルのチューブに移し、300 Gで1分間遠心分離します。スフェロイドを12.5ミリリットルの新鮮な後腸中部誘導培地に再懸濁し、ウェルあたり0.5ミリリットルを同じ24ウェルプレートに加え、インキュベーターで24時間インキュベートします。後腸導入の4日目に、培地を15ミリリットルのチューブに集めてプレートウェルから浮遊スフェロイドを収穫し、続いて300 Gで1分間遠心分離します。決定的な内胚葉誘導の効率は、FOXA2 および SOX17 の免疫蛍光染色を実行することによって評価されました。前方HOX因子HOXD3のmRNAの発現は、Nogginで処理されたヒト腸オルガノイドまたはHIOで最も高く、上皮増殖因子またはEGFで処理されたHIOで少なく、BMPで処理されたヒト結腸オルガノイドまたはHCOで最も低いことが判明しました。逆に、HOXA13およびHOXD13 mRNAの発現は、HIOsでは低く、HCOsでは高いことがわかりました。HCO上皮が適切にパターン化されているかどうかを判断するために、SATB2、CDX2、およびCDH1に対して免疫蛍光染色を実施しました。
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概要
この記事では、ヒト多能性幹細胞由来の小腸および結腸オルガノイドを生成、維持、および特徴付けるための詳細な方法について説明しています。これらの方法は、オルガノイドの取り扱いの再現性、拡張性、効率性を向上させることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 幹細胞生物学
- オルガノイド技術
- 消化器系研究
背景
- ヒトの多能性幹細胞は様々な細胞タイプに分化できます。
- オルガノイドは臓器の機能を模倣する3D構造です。
- オルガノイド培養技術の改善は研究にとって重要です。
- 再現性と拡張性はオルガノイド研究における一般的な課題です。
研究目的
- オルガノイド生成のための包括的なプロトコルを提供すること。
- オルガノイド維持のプロセスを効率化すること。
- オルガノイドの特徴付け方法を向上させること。
使用方法
- 多能性幹細胞からの小腸および結腸オルガノイドの生成。
- オルガノイド培養の維持技術。
- オルガノイドの品質を評価するための特徴付け方法。
- 拡張性と取り扱い時間を改善するための戦略。
主な結果
- 高い再現性を持つオルガノイドの成功的な生成。
- オルガノイド培養の拡張性の向上。
- オルガノイドの播種と伝代に必要な時間の短縮。
- 品質評価に役立つ特徴付け技術の向上。
結論
- 説明された方法はオルガノイド研究を大幅に改善します。
- これらのプロトコルは消化器系オルガノイドを含む様々な研究に適用できます。
- 将来の研究はこれらの方法の再現性と効率性から恩恵を受けることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Human pluripotent stem cell-derived intestinal and colonic organoids provide a scalable, reproducible system for modeling gastrointestinal development and disease. These models enable mechanistic de-risking of therapeutic targets by recapitulating region-specific epithelial and mesenchymal interactions. The protocol supports predictive confidence in preclinical target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of BMP-dependent regional specification mechanisms in human gut development.
- Operational Value: Provides a defined, inducible system to generate SATB2-expressing colonic organoids for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in intestinal patterning and epithelial-mesenchymal crosstalk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates organoids containing all major human colonic epithelial cell types for physiologically relevant compound screening.
- Operational Value: Establishes a standardized, three-day BMP induction protocol for scalable production of colonic organoids.
- Assay Readiness: Enables co-development of epithelial and mesenchymal compartments, supporting complex tissue-level readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human developing colon morphology and molecular signature for translational biomarker alignment.
- Operational Value: Supports continuity from pluripotent stem cells to differentiated intestinal lineages for preclinical disease modeling.
- Risk Mitigation: Reduces biological ambiguity in target selection through region-specific organoid fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a reproducible source of regionally specified intestinal organoids for downstream applications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of developmental pathways like BMP in human gut patterning.
- Screening: Delivers standardized, scalable organoid cultures suitable for high-content compound evaluation.
- Analytics: Supports quantitative assessment of epithelial composition, SATB2 expression, and morphogenetic outcomes.
- Translational Research: Models human colonic development to bridge discovery and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Defines a modular differentiation protocol adaptable across gastrointestinal target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in modeling human intestinal regional specification and target engagement.
- Operational Value: Standardized, three-day BMP induction enables scalable, reproducible organoid generation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic uncertainty in gastrointestinal target biology.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant organoid systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and directed differentiation.
- Dependent on precise timing of BMP pathway modulation during mid/hindgut patterning.
- Necessitates standardized reagents including BMP4 and NOGGIN for intestinal vs. colonic fate specification.
- Requires validation of SATB2 expression and epithelial-mesenchymal co-development as quality metrics.
- Adaptation to other gastrointestinal regions may require modulation of additional developmental pathways.
