Name: 呼吸性類鼻疽症中の肺機能を特徴付けるための簡略化された全身プレチスモグラフィ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ簡略化全身プレチスモグラフィ法を用いたマウスの呼吸機能モニタリング。非侵襲的に呼吸データを収集し、細菌性呼吸器疾患の進行と肺機能の関係を評価する手法を解説します。

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これらの研究は、国立衛生研究所COBRE助成金P20GM125504-01サブプロジェクト8246によってサポートされました。

ここに記載されている手順は、ルイビル大学施設バイオセーフティ委員会(プロトコル#14-038)および施設動物管理および使用委員会(プロトコル#19567)によってレビューおよび承認されました。
1. サンプリングチャンバーの組み立て
<ol><li>95 mmガスケットと気密蓋、ベイルおよびトリガークランプ蓋を備えた600 mLの正方形ガラス広口メイソン缶詰ジャーの平らな面に、ドリルプレスに3/4インチのダイヤモンドドリルビットを使用して2つの穴を開けます(図1)。 注:サンプリングチャンバーは市販されていないため、構築する必要があります。</li>
	<li>真ちゅう製のバルクヘッド(1/4インチNPTめねじ、3/4-16 UNFおねじ)をメイソンジャーの両方の穴に通し、バルクヘッドとガラスの両接触面にあるゴムワッシャー(内径3/4インチ、外径1インチ)を組み立てて気密シールを確保します。</li>
	<li>一方のバルクヘッドアセンブリを圧力センサーに使用し、もう一方のバルクヘッドをルアー接続シリンジで取り付けてキャリブレーションを行います。<ol><li>圧力センサーの場合は、高性能ゲージ圧力トランスデューサの1/4インチNPTスレッドをテフロンテープで包み、バルクヘッドにねじ込みます。はんだごてを使用して、市販の高品質データ収集デバイスとのインターフェースに関する製造元の配線手順を使用して、圧力センサーの配線を8ピンオスDINコネクタに接続します( 材料表を参照)。 メモ: これには、DIN コネクタ配線内に 150 K オーム 1/8 ワット 1% 金属皮膜抵抗器を使用する必要があります。</li>
		<li>キャリブレーションポートには、1/4インチのオスNPTから1/8インチのメスNPTアダプターを使用して、1/8インチのオスNPTをメスのルアーロックニッケルメッキコネクタに接続し、テフロンテープでネジ接続を包む真ちゅう製のバルクヘッドに接続します。ポリプロピレンねじ式のオスルアーキャップを使用して、使用しないときはルアーコネクタを密閉します。 注意: バルクヘッドコネクタをガラスジャーに締めすぎないでください, 亀裂が発生するため.必要に応じて、ゴム製ガスケットにシリコーンを添加して、隔壁をガラスジャーに気密に密閉することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. システムのセットアップ
<ol><li>製造元の指示に従って、8ピンDINコネクタを使用してサンプリングチャンバをブリッジアンプに接続し、ブリッジアンプをデータ収集デバイスに接続します。</li>
	<li>メーカーのケーブルを使用して、データ収集デバイスを電源と生理学的データ分析ソフトウェアを実行しているコンピューターに接続します。 注意: センサーが測定を安定させるために、使用する前にデータ収集デバイスの電源がオンになっていて、少なくとも5分間ウォームアップされていることを確認してください。</li>
	<li>ソフトウェアを起動して、データ集録システムとのインターフェースを行います。</li>
	<li>ソフトウェア内のオプションのスパイロメトリーモジュールをダウンロードし、[スパイロメトリ>設定]ウィンドウでデフォルトの単位設定をL/sからμL/sに変更します。</li>
</ol>3. システムキャリブレーション
<ol><li>ソフトウェア内で、次のデータウィンドウを含む 4チャンネル ウィンドウを作成します。 チャンネル1: 4 k/s のサンプルレートと 1 mV の範囲でデータをソースします。チャンネル2:ハイパス 1Hz自動調整 フィルターを使用したチャンネル1のデジタルフィルター。チャンネル3:100サンプルの平均によるチャンネル2データの 平滑化 。チャンネル4:チャンネル3データの スパイロメトリー フロー(カスタムフローヘッド、式(μL/s)= 120,000 x電圧に校正)。 注:120,000は、キャリブレーション中に変更されるプレースホルダー相関係数です。</li>
	<li>次の列を使用して、チャネル4のDataPad分析を設定します:列1: チャネル4データ、コメント>全コメントテキスト。列2:チャンネル4データ、 周期測定>平均周期周波数。列3:チャンネル4データ、 サイクリック測定値>平均サイクリック高さ。</li>
	<li>チャート表示の右下隅でフレームレートを100:1に設定します。このウィンドウ構成を、今後のすべてのスタディのテンプレートとして保存します。</li>
	<li>サンプルチャンバーの蓋を閉じ、25 μL気密シリンジをルアーバルクヘッドコネクタに取り付けます。シリンジにChaneyアダプターセットを取り付けて、20μLの容量を繰り返し供給します。 注意: オプションの1/16インチチューブとルアー/バーブコネクタの短いピースを使用して、シリンジをサンプルチャンバーに接続できます。ただし、サンプルチャンバーの総空気量に大きな変化を避けるために、長いチューブは避けてください。</li>
	<li>Chaneyアダプターのデプスストップを使用して、20μLの空気をシリンジに引き込みます。</li>
	<li>ソフトウェアでプレスをゼロにし(セットアップ>すべての入力をゼロにする(Alt-Z))、録音を開始します。</li>
	<li>記録中、安定したベースラインで、シリンジプランジャーを約10回繰り返して急速に押し下げ/引き出し、測定された20μLの呼吸で被験者の呼吸を再現します。録音を停止します。 注意: キャリブレーションの再現性を最大化するには、人工呼吸の周波数が2Hzを超える必要があります。</li>
	<li>番号付きプレス記録の先頭を右クリックし、[ コメントの追加]をクリックして、測定されたサンプルのIDにラベルを付けます。</li>
	<li>シリンジをリセットし、入力をゼロにし、20 μLパルスの記録測定をさらに2回繰り返します(合計3回の記録セッション)。</li>
	<li>すべての測定が完了したら、コンピューターのマウスを使用して、人工20μL呼吸を正確に表す呼吸プレスの一部を選択します。 注意: DataPadモジュール内で、データはプレビューヘッダーに表示され、呼吸数(平均サイクリック周波数、Hz)と呼吸深度(平均サイクリック高さ、μL)の一時的な読み出しを提供します。データ プレビューは、[データパッドに追加] アイコンを使用して データパッド に記録できます。</li>
	<li>列3のデータ(平均周期高さ)を確認し、3つの記録から平均測定呼吸量を計算します。平均測定呼気量の次の計算を実行します:校正係数=送達量/測定量x120,000。 注:120,000は、ステップ3.1で使用されたプレースホルダーフローヘッドキャリブレーション係数であり、測定データから変更されました。システムは、現在の環境温度と湿度を使用して、典型的なマウス呼吸に合わせて調整されました。システムは被験者の呼吸を監視できるようになり、温度/湿度の変動を考慮して毎日校正を再実行できます。</li>
</ol>4.被験者モニタリング
<ol><li>手順 3.4 で説明されているようにマスターテンプレートを開くか、手順 4.2 から 4.3 を実行します。</li>
	<li>ソフトウェア内で、次のデータ処理を行う 4チャンネル ウィンドウを作成します。 チャンネル1: 4 k/s のサンプルレートと 1 mV の範囲でデータをソースします。チャンネル2:ハイパス 1Hz 自動調整フィルターを使用したチャンネル1のデジタルフィルター。チャンネル3:100サンプルの平均によるチャンネル2データの 平滑化 。チャンネル4:チャンネル3データの スパイロメトリー フロー(カスタムフローヘッド、式(μL/s)= 120,000 x電圧に校正)。 注意: 120,000は、現在の圧力センサーに対して計算された相関係数です。ただし、ユーザーは手順3で説明したシステムキャリブレーションを実行し、代わりにこのユーザー定義の相関係数を使用する必要があります。</li>
	<li>次の列を使用して、チャネル4のDataPad分析を設定します:列1: チャネル4データ、コメント>全コメントテキスト。列2:チャンネル4データ、 周期測定>平均周期周波数。列3:チャンネル4データ、 サイクリック測定値>平均サイクリック高さ。</li>
	<li>被験者をサンプリングチャンバーに入れ、蓋を閉めます。この実験では、意識のある4〜12週間の雌アルビノC57BL / 6Jマウス(B6(Cg)-Tyrc-2J / J)を使用しました。</li>
	<li>ルアーバルクヘッドキャップを少し緩めて、チャンバー内の大気圧を均等にします(蓋を密閉することから)、締め直します。</li>
	<li>すべての入力をゼロにして(Alt-Zショートカット)、録音を開始する前に、被験者がサンプリングチャンバー内でアクティブに移動していないことを確認してください。 注:被験者がサンプリングチャンバー内で動き始めると、ベースラインがスケールから外れる可能性がありますが、これは録音の途中ですべての入力を再ゼロ化することで対処でき、スケールに新しい録音が作成されます。被験者が録音中に探索またはグルーミングに従事しているとします。プレチスモグラフィ記録のどの部分が通常の呼吸を最も正確に反映しているかに注意してください。</li>
	<li>番号付きのプレス録音の先頭を右クリックし、[ コメントの追加]をクリックして、被験者のIDにラベルを付けます。</li>
	<li>被験者をケージに戻します。窒息やストレスを避けるために、密閉されたサンプリングチャンバーで過ごす時間を5分に制限してください。 注:サンプルチャンバーの600 mLの空気量は、健康なマウスが<15 mL / minで呼吸することで急速に消費されないことを考えると、窒息のリスクは低いです。</li>
	<li>コンピューターのマウスを使用して、被験者の呼吸を正確に表す呼吸の部分を選択します。 注意: DataPadモジュール内で、データはプレビューヘッダーに表示され、呼吸数(平均サイクリック周波数、Hz)と呼吸量(平均サイクリック高さ、μL)の一時的な読み出しを提供します。データ プレビューは、[データパッドに追加] アイコンを使用して データパッド に記録できます。</li>
	<li>被験者マウスを1匹ずつ測定し続け、呼吸腿の代表的な切片をDataPadに記録する。</li>
	<li>データ記録後、データパッドのデータをエクセルにエクスポートします。分容量を次のように計算します:分容量(mL /分)=呼吸数(Hz)x呼吸容量(μl)x 0.06。</li>
</ol>

<ol><li>Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+Burkholderia+pseudomallei+capsular+polysaccharide+encoded+by+the+wcb+operon+in+acute+disseminated+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis.</a> Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).</li>
<li>West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pulmonary+infection+and+inflammation+induced+by+inhalation+of+Burkholderia+pseudomallei%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei.</a> International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).</li>
<li>Lawrenz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+murine+lung-specific+disease+models+for+Pseudomonas+aeruginosa+applicable+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing.</a> Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiratory+function+in+mice+using+unrestrained+whole-body+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755(2014).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).</li>
<li>Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+between+abnormalities+in+the+chest+radiograph+and+changes+in+pulmonary+function+in+chronic+bronchitis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema.</a> Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).</li>
<li>Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human melioidosis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+a+select+agent-excluded+Burkholderia+pseudomallei+capsule+mutant+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters.</a> Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).</li>
<li>Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+3+secretion+system+cluster+3+is+a+critical+virulence+determinant+for+lung-specific+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441(2015).</li>
<li>Rocco, P. R. M., Zin, W. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRocco%2C+PRM+%22Anaesthesia%2C+Pain%2C+Intensive+Care+and+Emergency+Medicine%22">Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine</a>. Gullo, A. , Springer. (2002).</li>
<li>Fodah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+Klebsiella+pneumoniae+comparative+genetic+analyses+with+virulence+profiles+in+a+murine+respiratory+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model.</a> PLoS One. 9 (9), 107394(2014).</li>
<li>Gotts, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+model+of+pneumococcal+pneumonia%2C+ARDS%2C+and+nonpulmonary+organ+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).</li>
<li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

sWBPは、小動物モデルにおける呼吸器感染症の理解を深めるための魅力的なアプローチです。重要なことに、これは非侵襲的なアプローチであるため、感染チャレンジ中に研究動物に過度のストレスを引き起こす重大なリスクはありません。実際、被験者の呼吸を監視する手順は、数分と最小限の被験者の取り扱いを必要とする迅速なテストです。科学的利点は、微生物病原体が疾患中の肺機能にどのように影響するかについての高解像度の理解です。このアプローチは、基礎研究に利益をもたらし、病原体がどのように病気を引き起こすかの理解を促進するだけでなく、新しい治療法が研究対象を呼吸器系の健康状態にどのように回復させるかを理解するための翻訳ユーティリティを提供します。
この原稿では、初期の無気力反応を引き起こす病原体B.シュードマレイの代表的な結果が提供されています。すべての細菌性肺感染症がマウス感染モデルに同じように存在するわけではありません。他の感染モデルに関する以前の経験では、細菌性病原体の肺炎桿菌は、マウスが感染に屈する時点まで、感染後約3日目まで無症候性感染として現れることが示されています11。吸気に対する宿主の需要(すなわち、微小体積)は、所与の疾患が提示する無気力の程度と密接に関連している可能性があると仮定されている。さまざまな細菌性病原体が呼吸器疾患時に肺機能にどのように影響するかを調べるには、今後の研究が必要になります。異なる病原体は、(1)細胞内または細胞外の病原体である傾向、(2)早期/後期低体温応答を引き起こす能力、および(3)病原性決定基の異なるレパートリーの使用の違いを含む、宿主防御を回避するための独自のアプローチを有することが理解される3,12,13。したがって、異なる疾患戦略は、感染中の肺機能と呼吸に独特の影響を与える可能性があります。
このプロトコルで説明されている推奨設定は、sWBP 中に存在する固有の課題に対応するように変更できます。sWBP記録セッション中に経験する一般的な問題の1つは、サンプルチャンバー内での被験者の動きです。前述のように、この動きはベースラインを変更し、呼吸測定の精度に影響を与える可能性があります。デジタルフィルターを使用して、シフトするベースラインを正規化し、小さな動きにもかかわらず実行可能な呼気測定を可能にしました。過度の動きは、ベースライン測定値をゼロ入力の範囲外に押し出す可能性があります。録音は1 mV範囲(チャンネル1設定)で推奨されており、範囲外のデータの損失を回避しながら、プレチスモグラフィのピークを観察するという妥協点を提供します。非常にアクティブな被験者の場合、範囲外の信号が持続しないように、記録範囲を>1 mV延長する必要がある場合があります。
推奨される手順では、環境の湿度/温度変動に対応するために、毎日のキャリブレーション(または各セッション)が必要です。従来のWBPは、環境と被験者5,6の両方の温度/湿度を考慮に入れた複雑な計算を使用します。現在のsWBP装置では、ホストの温度/湿度の影響が校正ソースの測定呼吸量を大きく変化させないことが実証されています。したがって、sWBPにおけるこのアプローチは、ドローボーとフェンの>50年前のアプローチとは根本的に異なります。ここで、sWBPは、ホストからのさらなる補正なしに、測定された呼吸量に圧力変化を直接関連付けます。
研究動物のWBPと臨床WBPを対比することが不可欠です。sWBPによって収集が試みられた生体認証データの種類は、呼吸量と頻度です。このような測定値は、患者が呼吸モニターを口に保持し、気流を監視するデバイスに正常に呼吸する単純な肺活量測定装置を使用して臨床的に収集されます。研究動物における同様の肺活量測定は拘束を必要とし、したがってストレスと呼吸の固有の混乱の一因となります。したがって、単純な肺活量測定は臨床的には機能しますが、研究動物には機能しません。WBPは、残留肺容量などの測定値を含む高度なデータを収集するために、クリニックで不可欠な目的を果たします。そのようなデータは、強制呼気(深い呼気による肺の排出)を含む、被験者がどのように呼吸するかについての指示に従うことができるという文脈でのみ含むことができる。研究動物は、研究者からの呼吸指示に従うことはできません。WBP中に臨床的に収集された高度な測定値の多くは、研究動物では再現できません。研究動物のWBPは、臨床WBPとは根本的に異なります。動物WBPは、動物のストレスや呼吸の乱れを避けるために、単純な換気データ(呼吸数と呼吸量)を無制限に収集しようとしています。これまでのところ、研究動物でのWBPの使用は、環境および被験者の温度と湿度に基づく複雑な計算を含む、臨床WBPで使用されている技術を再現しているように見えますが、強制呼気を実行する方法に関する指示に従うことができる被験者から高度なデータを収集することはできません。このことを念頭に置いて、呼吸器疾患の研究に関連する適切な呼吸頻度と呼吸量を収集するには、WBPの簡易版で十分かどうかを実証することが求められました。環境の温度と湿度の変動を補正するキャリブレーションセッションが採用されました。また、呼吸量を測定する被験者の体温、湿度が呼気量を正確に測定することに有意な影響を及ぼさないことを人工マウスを用いて実証した。sWBPは、ユーザーが面倒な数学的データ処理を採用することなく、動物実験の研究に優れた用途があると結論付けられました。

呼吸器細菌性病原体は、肺の炎症反応と関連していることが多く、肺の病状を引き起こします1,2。臨床現場では、肺炎の診断には、通常、喀痰、血中酸素飽和度分析、胸部X線などの培養技術が含まれます。これらの手法は小動物感染モデルに変換できますが、マウスでの病気の重症度に関する迅速なリアルタイム分析を表すのは酸素飽和度分析のみです。血中酸素飽和度(SpO2)は、呼吸器疾患研究で疾患の進行を追跡する方法として以前に調査されました。しかし、瀕死のマウスは、緑膿菌モデル3の両方で予想外に高いSpO2測定値を有し、これはおそらくマウスが生理活性を調節することができるため、予測疾患または瀕死性疾患ではない。この目的のために、これまでのところ、マウスの細菌性呼吸器疾患に対するSpO2の診断レベルは見出されていませんでした。
したがって、この研究では、肺機能に対する肺疾患の影響を検出する他の臨床的に関連する方法の使用を、迅速な生理学的測定として調査しました。簡易全身プレチスモグラフィ(sWBP)は、迅速で非侵襲的な生体認証分析として呼吸数と深度を調査する機会を提供します。以前の研究では、実験室でWBP装置を組み立てる方法が実証されています4;しかしながら、そのような研究に示される成分のいくつかは現在市販されていない。さらに、従来のWBPでは、湿度と温度に基づく複雑なデータ収集とデータ処理が必要です5,6。そこで、室温/湿度に毎日校正し、被験者自体の温度/湿度の寄与が測定された呼吸量に影響を与えるかどうかを評価する簡略化されたWBP装置を開発することが決定されました。したがって、現在入手可能な材料を調達する修正されたsWBP装置が作成されました。さらに、この実験室から調達された装置が、マウスの致死性呼吸器類鼻疽のモデル中に疾患進行に関連する呼吸の変化を検出できるかどうかが調査されています。
この作業のために構築されたsWBP装置は、市販の機器とソフトウェアを使用して、アナログ圧力センサーデータをデジタル読み出しに処理しました。圧力センサーは、バルクヘッドコネクタを備えた気密ガラスジャーに取り付けられました。ガラス瓶の利点は、材料の構造的剛性であり、これは瓶の内圧の変化に抵抗し、呼吸のモニタリング中の体積変化の測定に影響を与える。サンプリングチャンバーは、正方形のジャーの2つの平らな面に2つのポートがあり、1つは校正用のルアーコネクタでチャンバーにアクセスし、もう1つは圧力センサーを収納するように設計されています。選択された圧力センサは、圧力の小さな変化のための範囲(25mbarの範囲)を備えた高感度ゲージ圧力トランスデューサを備えています。
このプロトコルは、呼吸性類鼻疱症のマウスモデルを使用して実証されています。バークホルデリア偽マレイ(Bp)は、世界の熱帯地域に関連する疾患である類鼻疽の細菌剤です7。Bpは環境、特に立っている水と湿った土壌の湿った環境で見られ、そこから通常、影響を受けやすい宿主の切り傷/引っかき傷の皮下感染を引き起こします。しかし、Bpは吸入すると感染性もあり、エアロゾル拡散によるバイオテロでの使用に対する潜在的な脅威です。完全に毒性の高いBpはBSL-3実験室での取り扱いが必要ですが、被膜変異株は以前に設計されており、BSL-2で安全に取り扱うことができ、選択剤基準8から除外できます。さらに、Bp 5,9の呼吸器疾患進行を研究するために、呼吸器類鼻疱症の挿管媒介気管内(IMIT)感染モデルが開発されました。この感染モデルを使用して、瀕死のエンドポイントを介した疾患の進行中に発生する呼吸の変化を特徴付けました。

<table><tbody><tr><td>1/8" NPT ルアーアダプター</td><td>Amazon</td><td>B07DH9MY8W</td><td>キャリブレーションポート</td></tr><tr><td>1/8" NPT to 1/4" NPT アダプター</td><td>Amazon</td><td>B07T6CR6FS</td><td>バルクヘッド - ルアーアダプター</td></tr><tr><td>150kΩ 抵抗</td><td>Amazon</td><td>B07GPRYL81</td><td>圧力トランスデューサ 励起電圧選択</td></tr><tr><td>3/4" ダイヤモンドドリルビット</td><td>Drilax</td><td>DRILAX100425</td><td>バルクヘッドマウントをドリルするにはガラス瓶</td></tr><tr><td>ブリッジアンプ</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>FE221</td><td>ワンチャンネルオプション</td></tr><tr><td>バルクヘッドフィッティング</td><td>Legines</td><td>3000L-B</td><td>1/4" NPT, 3/4-16 UNF 真鍮バルクヘッドカップリング</td></tr><tr><td>チェイニーアダプター</td><td>ハミルトン</td><td>14725</td><td>設定容量用ガスタイトシリンジアダプター</td></tr><tr><td>DINコネクタ</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>SP0104</td><td>圧力センサーをブリッジアンプ</td></tr><tr><td>に接続するにはガスタイトシリンジ、25 uL</td><td>ハミルトン</td><td>80201</td><td>キャリブレーションシリンジ</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>ADインスツルメンツ</td><td></td><td>ライフサイエンスデータ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>ルアープラグ</td><td>コールパーマー</td><td>45513-56</td><td>キャリブレーションポート閉鎖</td></tr><tr><td>PowerLab 4/26</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>PL2604</td><td>コンピュータへのデジタルインターフェース</td></tr><tr><td>圧力トランスデューサ</td><td>オメガエンジニアリング</td><td>PX409-10WGV</td><td>高精度オイルファイルゲージ圧力センサー</td></tr><tr><td>ラバーガスケット</td><td>アマゾン</td><td>B07LH4C8LS</td><td>バルクヘッドを取り付けるには (チャンバーごとに4個必要)</td></tr><tr><td>正方形のガラス瓶</td><td>アマゾン</td><td>B07VNSPR8P</td><td>600ml 95 mmシリコンガスケット付き</td></tr></tbody></table>

呼吸性類鼻疽症中の肺機能を特徴付けるための簡略化された全身プレチスモグラフィ

Simplified Whole Body Plethysmography to Characterize Lung Function During Respiratory Melioidosis

病気の代理動物モデルは、責任ある研究の3Rの対象となります。動物福祉と科学的洞察の両方が新しい技術の利用可能性とともに進歩することを確実にするために、動物モデルの改良が頻繁に再検討されています。この記事では、 簡易全身プレチスモグラフィ(sWBP)を使用して、致命的な呼吸性類鼻疽症のモデルで呼吸不全を非侵襲的に研究します。sWBPは、疾患の経過全体を通してマウスの呼吸を検出する感度を有し、瀕死の関連症状(徐呼吸および低呼吸)を測定し、人道的エンドポイント基準を開発するために使用される可能性がある。
呼吸器疾患の文脈におけるsWBPの利点のいくつかは、宿主の呼気モニタリングが、一次感染組織、すなわち肺の機能不全を評価する際に生理学的測定に最も近いことである。生物学的意義に加えて、sWBPの使用は迅速かつ非侵襲的であり、研究動物のストレスを最小限に抑えます。この研究は、呼吸性類鼻疽のマウスモデルにおける呼吸不全の経過を通して疾患を監視するための社内sWBP装置の使用を実証しています。

システムキャリブレーション データ分析ソフトウェアは、本明細書に記載されているようなカスタムフローヘッドの直接較正を可能にする。これは、スパイロメトリーフローを設定するときに実行されます。ステップ3.1で説明したように、既知の校正風量を入力するオプションが存在し、システム内の電圧対体積相関係数を計算します。ただし、これは1回の読み取りに基づいて相関係数を生成し、n = 1標準からのキャリブレーションの固有の変動は有用性が低いことが観察されています。現在のアプローチでは、この欠点に対処でき、ユーザーは平均化された複数の読み取り値を使用して毎日の校正を実行して校正係数を計算することができます。20μLの注入された空気による較正が本明細書で実証され、典型的なマウスにおける典型的なハイエンド呼吸量を表す。ソフトウェアは原点切片(0,0)を想定しているため、このアプローチを使用して0〜20μLの範囲で校正されます。
ここで提案するsWBPの方法論は毎日校正されるため、環境の湿度/温度の変動を考慮します。特定のWBPに使用された元の方法は、人間の乳児の換気を測定するためのWBPを開発した1955年のDrorbaughとFennの方法論にまでさかのぼります5。ドローボーとフェンの計算は、環境と対象の温度と湿度の変化を考慮しています。現在のアプローチでは、各sWBPセッションをキャリブレーションすることで環境変動を補正します。それでも、マウスの鼻腔/肺を横切る呼吸の加熱と加湿が既知の空気量の測定に影響を与えるかどうかに対処することが決定されました。したがって、較正された空気測定の加熱および加湿に対する被験者の影響を模倣するために人工装置が作成された。ルアーコネクタを15 mLのコニカルチューブに取り付け、この密閉されたコニカルをサンプルチャンバーと気密校正シリンジの間にインラインで配置しました。室温(23°C)に保持した空のコニカルチューブを用いて20μLのキャリブレーションを行った。次に、円錐形のチューブをルアーコネクタのすぐ下まで蒸留水で部分的に満たし、円錐形のヘッドスペースを平衡化する時間を確保しました。次に、湿度の影響を調べるために校正量を再測定しました。円錐管を加熱ブロックに入れ、湿度の高い環境で37°Cで平衡化し、最後に水なしで37°Cに平衡化して、被験者の加熱の影響を評価し、湿度の追加寄与はありませんでした。 図2 は、テストしたすべての条件が、気密シリンジによって提供された校正された20 μL測定に大きな影響を与えなかったことを示しています。この知見から、sWBPは、測定された呼吸量に大きな影響を与えないため、被験者の温度と湿度を前提とした複雑な計算を必要とせずに、研究動物の呼吸を監視するためのアクセス可能なアプローチを提供すると結論付けられました。
被験者モニタリング sWBPは、細菌性病原体 B.シュードマレイによる致命的な呼吸器感染症の疾患中の呼吸を監視するために使用されました。意識のある動物の呼吸を監視する際の課題の1つは、サンプルチャンバー内を移動する正常な健康な動物の好奇心です。マウスの動きは絶えず動くベースラインを作り出しますが、これは測定前の数日間にわたって被験者をチャンバーに事前調整することによって部分的に軽減することができます。この問題は主に健康なマウスのベースライン測定に影響を及ぼし、感染中に被験者が無気力になり、被験者の活動が低下してsWBPがはるかに管理しやすくなります。身体的であろうと麻酔であろうと、何らかの形の拘束を使おうとしたくなるかもしれません。身体的拘束の使用は、ストレスを引き起こすことによって自然な呼吸に影響を与える可能性があります。さらに、麻酔薬の使用は、呼吸数および深さ10に顕著な影響を与えることが知られている。そこで、社内のsWBP装置を用いて麻酔の影響を調査することとした。イソフルランは、感染モデル中に in vivo 画像診断を行うために一般的に使用されるため、C57BL / 6マウスを麻酔し、sWBPを使用して麻酔から回復するまでの進行を監視しました。この試験は、麻酔からの回復ウィンドウを延長するために、4週齢の若年アルビノC57BL / 6Jマウスで実施されました。 図3 は、好ましい麻酔薬により、マウスが大きな一回換気量で遅い呼吸数を示すことを示しています。マウスが鎮静から回復し始めると、呼吸数が増加し、呼吸量が減少し、吸気された空気の合計がゆっくりと増加するという正味の効果があります。この試験では、呼吸量が回復の最初の30秒以内に麻酔前のレベルに回復することがわかりました。ベースライン呼吸が麻酔から除去されてから2〜2.5分に回復するまで、呼吸数は着実に増加します。.分容積は呼吸数の影響に密接に従い、麻酔からの除去後2.5分でベースライン分容積に達した。この知見は、sWBPアプローチにおいて麻酔を使用すべきではないことを裏付けている。麻酔は宿主の代謝を遅らせ、吸気酸素の需要を減らすため、当然のことながら、ベースライン呼吸に劇的な影響を及ぼします。サンプルチャンバーの衛生状態も、研究固有の感染管理、および被験者間のストレスに影響を与える可能性のある尿や糞便からのフェロモンの影響に対処するために、被験者間で考慮する必要があります。.
WBPは、呼吸器疾患モデルにおける肺機能を非侵襲的にモニタリングするための魅力的な戦略です。sWBPは、致死性呼吸器類鼻疱症感染時の呼吸の変化を研究するために使用され(図4)、ある時点は肺の生物発光モニタリングを反映しています。このモデルは、感染後約3日で瀕死の病気が発症するまでゆっくりと進行する嗜眠の早期発症と関連していることが観察されました。また、マウスの呼吸数と総吸気量(微小体積)は、感染の初日に急速に減少し、感染の残りの過程の間は低いままであることが観察されました(図4A、C)。このパターンは、感染の次の2日間持続する早期発症の嗜眠と一致しています。対照的に、呼吸量は最初の24時間の間に急激に低下することはなく、代わりにわずかかつ着実に減少し、疾患の3日間の経過にわたって直線的な減少に近づきます(図4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig01.jpg"> 図1:sWBP装置。 カスタムサンプルチャンバーは、2つの平らな面にバルクヘッドコネクタを備えた密閉可能な正方形のガラス瓶から構築されました。1つのバルクヘッドを使用して、8ピンDIN接続 を介して ブリッジアンプとデータ収集デバイスのデジタイザに接続されたゲージ圧力センサーを取り付けました。2番目の隔壁には、気密シリンジによる校正用のルアーコネクタが取り付けられていました。デバイスは、ソフトウェアを実行しているPCに接続されていました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig02.jpg"> 図2:被験者の温湿度が呼吸量に及ぼす影響。 ルアーコネクタ付きの15 mLコニカルチューブを、20 μLキャリブレーションシリンジとサンプルチャンバーの間にインラインで取り付けました。システムは、円錐管から追加の温度/湿度の寄与なしに20μLに較正されました。他の測定値は、蒸留水からの飽和湿度および/または室温(23°C)から体温(37°C)への円錐管の加温による平衡化後に収集された。テューキーの多重比較事後検定による一元配置分散分析による各条件のn = 5測定値から有意差は検出されませんでした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig03.jpg"> 図3:マウスの呼吸に対するガス麻酔の影響。4週齢の雌アルビノC57BL/6Jマウス(8.6g)の代表的なデータを、酸素中の3%イソフルランで5分間鎮静し、sWBPサンプルチャンバーに移した。プレスデータは、麻酔から取り出した後150秒間収集されました。.被験者は、麻酔から離れてから100秒までに最初の歩行を開始しました。(A)麻酔前のベースライン呼吸、4.97 Hzの呼吸数、9.74 μLの呼吸量、および2.91 mLの分容積を測定します。(B)麻酔からの回復中の呼吸の変化の最初の60秒。(A-B)縦軸は呼吸あたりのμLを測定し、横軸は秒単位です。(C-E)換気データは、麻酔からの回復の150秒間に収集され、(C)呼吸数、(D)呼吸量、および(E)計算された分量について、時点あたり≥3呼吸サイクルから平均されました。麻酔前のベースライン値は、それぞれのグラフに水平点線で示されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62722/62722fig04.jpg"> 図4:呼吸性類鼻疽が宿主呼吸に及ぼす影響。 5匹の8週間雌C57BL/6マウスに、生物発光 B.シュードマレイ 株JW270の4.9 log CFUを感染させた。sWBPは、感染の3日間の経過を通して実施され、呼吸数(A)と呼吸量(B)を測定しました。吸気空気の合計は、分体積(C)として計算されました。5つの被験者のそれぞれのデータは、3次多項式回帰で独立してプロットされます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62722/62722fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、細菌性呼吸器疾患の進行を非侵襲的に監視するための簡略化された全身プレチスモグラフィ装置の構築と使用を示しています。

Surrogate animal models of disease are subject to the 3Rs of Responsible Research. There is a frequent revisiting of refinements to animal models to ...

簡易全身プレチスモグラフィの使用は、研究動物の肺機能と疾患進行の関係を明らかにするのに役立ちます。この技術の主な利点は、拘束されていない動物から呼吸データを収集できることです。8ピンDINコネクタを使用してサンプリング・チャンバをブリッジ・アンプに接続し、ブリッジ・アンプをデータ・アクイジション・デバイスに接続することから、システムのセットアップから始めます。データ収集デバイスを電源に接続し、生理学的データ分析ソフトウェアを備えたコンピューターに接続します。接続したら、ソフトウェアを起動してデータ集録システムとインターフェースします。ソフトウェアでオプションの肺活量測定モジュールをダウンロードし、[肺活量測定]タブに移動して、設定ウィンドウでデフォルトの単位設定をリットル/秒からマイクロリットル/秒に変更します。システムのキャリブレーションのために、ソフトウェア内に4チャンネルウィンドウを作成します。チャンネル1では、ソースデータを毎秒4, 000データポイントのサンプルレートと1ミリボルトの範囲に設定します。チャンネル2は、ハイパス、1ヘルツ、自動調整フィルタを使用したチャンネル1のデジタルフィルタになります。チャンネル2データのスムージングタブでチャンネル3を作成し、100サンプルを平均します。そして、チャンネル3データの肺活量測定フローでチャンネル4を作成します。次に、3つの列を持つチャンネル4のデータパッド分析を設定します。列 1 については、チャネル 4 のデータとコメントに移動して、コメント テキスト全体にアクセスします。次に、列2とチャンネル4のデータと周期測定を設定して、平均周期周波数を選択します 列3とチャンネル4のデータでは、周期測定と平均周期高さを選択します。チャート表示の右下隅でフレームレートを100対1に設定し、ウィンドウ構成を将来の調査用のテンプレートとして保存します。完了したら、サンプルチャンバーの蓋を閉じ、25マイクロリットルの気密シリンジをルアーバルクヘッドコネクタに取り付けます。次に、シリンジをChaneyアダプターに取り付けて、Chaneyアダプターの深さストップを使用して、20マイクロリットルの空気をシリンジに引き込みます。次に、ソフトウェアでプレスをゼロにするには、[セットアップ]タブにアクセスし、録音を開始する前にすべての入力をゼロにします。記録中は、ベースラインが安定するのを待ってから、シリンジプランジャーを急速に押し下げて10回繰り返し、測定された20マイクロリットルの呼吸で被験者の呼吸を再現します。完了したら、番号付きのプレス記録の先頭を右クリックして記録を停止し、[コメントの追加]をクリックして測定されたサンプルのIDにラベルを付けます。シリンジをリセットして入力をゼロにし、20マイクロリットルのパルスの記録測定を2回繰り返します。3つの記録セッションですべての測定が完了したら、コンピューターのマウスを使用して、人工20マイクロリットルの呼吸を正確に表す呼吸プレスの部分を選択します。次に、列3のデータで平均周期高さを確認し、3つの記録から平均測定呼吸量を計算します。前述のように概説したマスターテンプレートを開きます。次に、意識のある4〜12週間のメスのアルビノC57ブラック6Jマウスをサンプリングチャンバーに入れ、蓋をラッチします。ルアーバルクヘッドキャップを少し緩めてチャンバー内の大気圧を均等にし、キャップを再度締めます。被験者がサンプリングチャンバー内でアクティブに動いていないことを確認してから、すべての入力をゼロにして録音を開始します。番号付きのプレス録音の先頭を右クリックし、[コメントの追加]をクリックして、被験者のIDにラベルを付けます。次に、マウスをケージに戻します。被験者の呼吸を正確に表す呼吸プレスの部分を選択します。データパッドモジュールでは、データがプレビューヘッダーに表示され、呼吸数と呼吸量の一時的な読み出しが提供されます。データプレビューは、データパッドに追加アイコンを使用してデータパッドに記録できます。被験者マウスについてのパラメータを一度に1つずつ測定し続け、呼吸プレスの代表的な切片をデータパッドに記録する。データ記録後、データパッドデータをExcelにエクスポートし、分量を計算します。全身プレチスモグラフィの臨床使用では、被験者自身の体温と環境温度、および湿度が複雑な呼吸の計算に影響を与えます。この研究では、簡略化された全身プレチスモグラフィまたはSWBPアプローチが環境の温度と湿度の変化を制御し、ホスト自体の温度と湿度への寄与が20マイクロリットルの校正量の呼気測定の精度に大きな影響を与えないことが観察されました。吸入麻酔薬がマウスの呼吸に及ぼす影響を調べた。麻酔前のベースライン呼吸と、マウスが麻酔から回復している間の呼吸をここに示します。好ましい麻酔薬による治療により、マウスは大きな一回換気量で遅い呼吸数を示した。マウスが鎮静から回復するにつれて、呼吸数は増加し、呼吸量は徐々に減少した。同様に、ベースライン呼吸が麻酔からの除去後2〜2.5分に回復するまで、呼吸数は着実に増加しました。.分量は、麻酔抜去後2.5分までに呼吸数がベースライン分量に達する効果に密接に従った。呼吸器類鼻疽感染中の呼気変化を宿主マウスにおいてモニターした。マウスの呼吸数と総吸気は、感染の初日に急速に減少し、病気の残りの経過の間低いままでした。対照的に、呼吸量は最初の24時間で急激に低下することはなく、代わりに病気の3日間の経過まで着実に減少します。これらのデータは、呼吸量がマウスの呼吸器疾患重症度の生体認証測定値を提供する可能性があることを示唆しています。この手順を試みる際に覚えておくべき最も重要なことは、マウスが動かなくなるまで待ってから記録を開始することです。好奇心旺盛なマウスがサンプリングチャンバーを探索している間、忍耐力が必要な場合があります。この技術は、細菌変異体が変化した疾患プロセス中に宿主の肺機能にさまざまな影響を与える方法、および治療的介入が感染したマウスの正常な肺機能の回復をどのように加速できるかを調査する道を開きます。

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Research

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