Name: 領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学ぶ、ヒトiPSC由来脊髄特異的アストロサイトとニューロンの共培養法による電気生理学的解析。ALSなどの神経変性疾患における細胞間相互作用のメカニズム解明に貢献する革新的なモデリング手法です。

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この原稿は、2019 MSCRFF 5119(AT)によってサポートされました。K08NS102526 NIH / NINDS(CWH)、2020年ドリスデューク慈善財団臨床科学者キャリア開発賞(CWH)。1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM).記載された電気生理学的プラットフォームを検証するために利用したMEAプラットフォームとデータ分析ソフトウェアを提供してくれたRaha Dastgheyb博士とNorman Haughey博士に感謝します。プロトコルのデモンストレーションと撮影に協力してくれたKhalil Rustに感謝します。

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

今日まで、星状細胞とニューロンの共培養の電気生理学的記録のためのhiPSCおよびMEAベースの方法は、てんかん9のin vitroモデリングのためのより広範な使用とは対照的に、ALS6の分野では限られた用途であり、完全なヒトプラットフォームではまだ適用されていません。しかし、このプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズム、神経毒性への星状細胞の寄与、または疾患の進行におけるネットワーク活動の役割など、ALS研究における病態生理学的に関連する質問に対処する可能性を秘めています。さらに、このプラットフォームは、in vitroで9か月以上にわたって将来の電気生理学的データを収集できるため、治療の可能性を秘めた化合物を試験するためのアプローチを提供します2。
文献に見られるhiPSC-NおよびhiPSC-Aの生成プロトコルは、培地条件、培養のタイミング、収量、成熟プロファイルなどの要因に関して大きく異...

ヒト多能性幹細胞由来アストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学をin vitroでモデル化するための強力なツールであり、創薬戦略のトランスレーショナルパラダイムを提供します1。研究者らは、hiPSC-AとhiPSC-Nの共培養が、両方の細胞タイプの形態学的、分子的、電気生理学的、および薬理学的成熟を促進し、複雑なニューロンネットワークと、in vivo対応物に似た星状細胞-ニューロン相互作用を生成することを実証しました2,3。同様の共培養実験は、星状細胞を介した神経毒性4,5やニューロンの過剰興奮性6などのALS病理生物学の特徴を再現することができます。さらに、分化プロトコルの進歩により、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、皮質および脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-N 7,8を含む領域特異的な神経サブタイプに分化することができます。これらの戦略は、ALSにおける皮質および脊髄運動ニューロンの病理、ならびに両方に対する星状細胞の影響をモデル化する可能性を提供します。しかしながら、これには、これらの効果を決定するための再現可能な機能アッセイが存在することが必要である。
最近、多電極アレイ(MEA)記録がニューロン-アストロサイト共培養の電気生理学的特性評価に特に適していることが示されました2。シングルセル電気生理学的分析とは対照的に、これらの高密度電極アレイは、培養条件を破壊したり、細胞膜の完全性を維持したりすることなく、ニューロンの大規模な集団からの細胞外野電位を受動的に記録します。これらのプラットフォームは、経時的および薬理学的操作に応答して培養物の細胞およびネットワーク活性を記録するのに特に有用である。最後に、アストロサイトの存在が培養変数である場合、MEA記録はアストロサイト-ニューロンの双方向相互作用に関する機能的な洞察を提供することができます2,9。
ここで紹介するのは、以前に検証されたhiPSCを脊髄hiPSC-AおよびhiPSC運動ニューロン(MN)に分化させるための最適化されたプロトコルです2。脊髄hiPSC-A分化プロトコルは一貫して星状細胞培養をもたらし、S100カルシウム結合タンパク質B(S100β)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびホメオボックスB4(HOXB4)に対して陽性であり、それぞれ最大80%、50%、および90%の細胞で陽性であり、成熟グリアおよび脊髄の仕様を示しています2,10.hiPSC-MN分化プロトコルは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対して>90%陽性のニューロンを生成し、成熟したα運動ニューロンの同一性を示唆しています2。さらに、このプロトコルでは、アストロサイトなしまたはげっ歯類のアストロサイトを使用したニューロン培養と比較した場合、ショール分析および免疫蛍光顕微鏡によって形態学的複雑さが増したニューロンをもたらすことが以前に実証されたhiPSC-A/MN共培養の生成技術について説明しています2。これらの説明は脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-Nに固有ですが、ユニークな利点は、星状細胞とニューロンの最初の独立した培養とそれに続く後の時点での共培養のステップを翻訳して、他の特定の領域および疾患特異的細胞からのニューロン-アストロサイト相互作用の影響を研究できることです7,8.最後に、プロトコルは、細胞組成および培養条件を操作する能力を有する共培養組成物の因子としての機能的活性を経時的に研究できるように、MEAプレート上でこれらの培養物を増殖させる方法を記載している。
これらのプロトコルの目標は、星状細胞とニューロンの相互作用を調査し、疾患特異的な変化を調べ、ALSの分野で治療の可能性を秘めた薬物をテストするための機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、ビデオの説明が提供されています。

<table><tbody><tr><td>10 cm 滅菌培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 滅菌培養フラスコ</td><td>ファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (&beta;-ME)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21985023</td><td>作業濃度 110 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>500 mL 0.2 &micro;m CA フィルターシステム</td><td>コーニング</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル滅菌培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>3046</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>ギブコ</td><td>15290018</td><td>作業濃度 2.0 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>陰イオン性界面活性剤 プロテアーゼ酵素 - Terg-A-Zyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273287</td><td>使用濃度 1% m/v</td></tr><tr><td>アスコルビン酸 (ASAC)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>100 mg を 250 mL の dH2O に溶解して、0.4mg/ml ストックを得ます。0.22 &micro;mフィルター、分注し、-80°Cで凍結します。1:1000で希釈して使用します。(作業濃度0.4&マイクロ;g/mL)です。</td></tr><tr><td>アクシオン CytoView MEA 24 プレート (M384-tMEA-24W)</td><td>アクシオン</td><td>OPT-24</td><td></td></tr><tr><td>アクシオン エッジ MEA プラットフォーム</td><td>アクシオン</td><td>マエストロ エッジ</td><td></td></tr><tr><td>ベースメント メンブレン マトリックス - マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>プロトコルの詳細</td></tr><tr><td>卓上顕微鏡 (細胞培養フードの下で滅菌)</td> <td>ツァイス</td><td>415510-1100-000</td><td>プリモ バート</td></tr><tr><td>バイキュクリン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>14340</td><td>作業濃度10 &mu;M</td></tr><tr><td>毛様体神経栄養因子 (CNTF)</td><td>Peprotech</td><td>450-13</td><td>100 & micro;gを滅菌PBS1mLに注入し、次いで9mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 &microに加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。</td></tr><tr>Axion Edge <td>AirGas/Harris</td><td>9296NC</td><td></td>コンパウンドE Abcam ab142164 250 & micro を溶解するための <td>CO2</sub/sub> タンクとレギュレータ</td></tr>ー。<tr><td></td><td></td><td></td><td>2.0387 mLのDMSOにgを入れて、250 &micro;M株。-80°Cでアリコートして凍結し、1:2000に希釈して使用します。(作業濃度125 nM)。</td></tr><tr><td>シアンキサリン&nbsp;(CNQXの)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>C239</td><td>作業濃度 50 &mu;M</td></tr><tr><td>ジヒドロカイニン酸 (DHK)</td><td>Tocris</td><td>111</td><td>使用濃度 50 &mu;M および 300 &mu;M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>113300</td><td>使用濃度 1x</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8 培地 + エッセンシャル 8 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1517001</td><td>10 mL のエッセンシャル 8 (10x) &nbsp; サプリメントと 500 mL のエッセンシャル 8 成長培地 (1x)</td></tr> <tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>16140071</td><td>使用濃度 1x</td></tr><tr><td>グリア細胞株由来神経栄養 (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>ディゾルブ 100 & マイクロ;1mLのPBS中のgを100μ未満;g/mL に添加し、9 mL の滅菌 0.1% BSA-PBS を 10 &micro に加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Election Microscopy Sciences</td><td>63510-20</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Millipore-sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>PBS100 mLに200 mgを溶解して、2 mg/mLのストック溶液を得ます。15 mLと500 &microのストックを分注します。Lチューブ。1:1000に希釈して使用します。(作業濃度2 & マイクロ;g/mL)です。</td></tr><tr><td>湿度制御された細胞培養インキュベータ</td><td>ーThermoFisher</td><td>370</td>を<td>37 &ordmに設定。C, 5 % CO2</td></tr><tr><td>インスリン様成長因子 1 (IGF-1)</td><td>R&Dシステム</td><td>291-G1-200</td><td>ディゾルブ200&micro;gを2mLのPBSから100&microに。g/mL に添加し、18 mL の 0.1% BSA-PBS を加えて 10 &micro にします。g/mL ストックし、-80°Cで保存し、アリコートして-80°Cで凍結し、10°Cを希釈します。1:1000で使用するためのg / mLストック。(使用濃度10 ng / mL)。</td></tr><tr><td>Kainc acid</td><td>Abcam</td><td>ab144490</td><td>使用濃度 5 &mu;M</td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換 (KSR)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10828</td><td>使用濃度 1x</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>23017-015</td><td>原液 1 mg/mL、使用濃度 10 & マイクロ;g / mL(コーティング)、1&マイクロ;g/mL (細胞培地)</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>2 mg の LDN を 500 &micro;10 mMストックを得るためのクロロホルムのL。これをアリコートし、-80°Cで凍結します。使用するには、まずストックを1〜10でDMSO[1 mM]に希釈し、次に1 mMの1:5000を目的の培地に希釈して0.2 & microにします。Mワーキングソリューション</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25030</td><td>使用濃度 100x</td></tr><tr><td>MEAガラスプレート</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>60MEA200/30iR-Ti-gr</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット P200</td><td>ギルソン</td><td>PJ22224</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21103049</td><td>使用濃度 1x</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (NEAA)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td>使用濃度 100x</td></tr><tr><td>ペンシルリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td>使用濃度 100x</td></tr><tr><td>ポリオルニチン (PLO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td>100 mg を ddW 1 mL に溶解して、100 mg/mL のストック溶液を得ます。100&microで在庫を分注します。Lチューブ。(作業濃度100&マイクロ;g/mL)</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>使用濃度100 mM</td></tr><tr><td>プルモルファミン (PMN)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>540223</td><td>5 mg を 9.6 mL の DMSO に溶解して 1 mM 溶液を得る。-80°Cでアリコートして凍結し、1:1000に希釈して使用します。(作業濃度1 & マイクロ;M)。</td></tr><tr><td>組換えヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>再構成前に短時間遠心分離します。100 & micro を溶解します。1mLのPBSにgを100μに;g/mL に添加し、9 mL の滅菌 0.1% BSA-PBS を 10 &micro に加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。</td></tr><tr><td>レチノイン酸(RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>100 mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMのストック溶液を得ます。在庫100&microをアリコートします。L /チューブで-80°Cで凍結します。200 & マイクロを取ります。100 mMストックをL化し、10倍に希釈(DMSO1.8 mLを添加)して10 mMストックを調製します。アリコート50 & マイクロ;L /チューブ&nbsp;-80°Cで保管し、1:10000で希釈して使用します。(作業濃度2 & マイクロ;M)。</td></tr><tr><td>ROCK-I nhibitor</td><td>Peprotech</td><td>1293823</td><td>5 mg を 1480 & micro に溶解します。10 mMのストックを得るためにdH2OのL、アリコートして-80°Cで凍結します。(作業濃度20&マイクロ;M)。</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Sigma</td><td>S4317</td><td>5mgを1.3mLのDMSOに溶解して、10 mMのストック溶液を得ます。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(ワーキングコン10&マイクロ;M)</td></tr><tr><td>無菌細胞培養フード</td><td>ベイカー社</td><td>SG-600</td><td></td></tr><tr><td>サプリメント B - B27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21985023</td><td>使用濃度 50倍</td></tr><tr><td>サプリメント N - N2 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17502048</td><td>使用濃度 100倍</td></tr><tr><td>テーブルトップ細胞培養遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー</td><td>75004261</td><td>ソーバル レジェンド X1R</td></tr><tr><td>熱可塑性プラスチック&nbsp;フィルム - Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>組織解離プロテアーゼ - Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td>作業濃度 1x</td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>Σ</td><td>T6522-1G</td><td>1g 1g 100mL ddH2O に溶解して 10mg/mL ストックを得る。アリコートして4°Cで保存し、トリプシンの量を1:10に希釈して使用します。(使用濃度1mg / mL)。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.05%)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2530054</td><td>作業濃度1x</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー2332</td><td>アイソテンプ</td></tr></tbody></table>

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたalsモデリングのための電気生理学的基盤の確立

Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons

ヒト多能性幹細胞由来のアストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学 をin vitroでモデル化するための強力なツールを提供します。多電極アレイ(MEA)記録は、ニューロンの大規模な集団からの電界ポテンシャルを記録し、時間の経過に伴うネットワーク活動を分析するための手段です。脊髄星状細胞の表現型を促進する技術を用いて分化したhiPSC-Aの存在は、hiPSC-Aなしまたはげっ歯類の星状細胞の存在下で培養されたものと比較して、領域特異的な脊髄hiPSC-運動ニューロン(MN)の成熟および電気生理学的活性を改善することが以前に実証されました。ここで説明するのは、脊髄hiPSC-AをhiPSC-MNと共培養し、MEA記録を用いて電気生理学的活性を記録する方法である。ここで説明する分化プロトコルは、脊髄に地域特異的な星状細胞およびニューロンに特異的であるが、共培養プラットフォームは、皮質hiPSC-AおよびhiPSC-Nを含む他の運命に特異的な技術で分化した星状細胞およびニューロンに適用することができる。これらのプロトコルは、グリアとニューロンの相互作用について知らせるための電気生理学的アッセイを提供し、ALSの治療の可能性を秘めた薬物をテストするためのプラットフォームを提供することを目的としています。

hiPSC-MNおよび脊髄hiPSC-Aを生成するための脊髄パターニングプロトコルを 図1に概説します。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持され、継代されます(図2A)。神経新生は、LDN193189およびSB431542の添加による二重SMAD阻害によって開始され(神経誘導)、それぞれ骨形成タンパク質(BMP)およびトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)経路を不活性化する。このステップでは、単層ベースの方法が使用され、hiPSCを付着性マトリックス、つまり基底膜マトリックス上に播種して、神経上皮様の2D培養を生成します。形態学的には、神経誘導は、大きな核と丸い形状のiPS細胞から、大きな細胞質と円筒形のしっかりと圧縮された神経上皮(幹)細胞への移行によって特徴付けられます。これらの細胞は水平方向と垂直方向に分裂し、多層上皮を生成します(図2B、i)。
<p class="jo...

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

Human pluripotent stem cell-derived astrocytes (hiPSC-A) and neurons (hiPSC-N) provide a powerful tool for modeling Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) ...

今日紹介する技術は、内因性の神経因子と周囲の星状細胞の影響の結果としての脊髄ニューロン活動の分析を可能にします。この技術は、脊髄特異的なヒトニューロンとヒトアストロサイトの両方を確実に生成し、再現性のためにスケーリングできる機能的出力測定値を使用します。本研究では、孤発性または遺伝性疾患の患者のニューロンを用いて、筋萎縮性側索硬化症などの脊髄ニューロン特異的疾患を調査することができます。まず、ヒトiPSプレートを調べて、コロニーの中心に白い領域が散在するように十分に密度の高いコロニーがないか調べます。次に、セルのパッケージングを開始するには、プレートの下部外面にマーカーを使用してグリッド線を描画し、プレート全体を正確にカバーできるようにします。培養液中で倍率10倍の位相差顕微鏡を使用し、200マイクロリットルのピペットチップで手動でこすり落とすことで分化したコロニーを剥離します。次に、プレートをPBSで2回すすぎます。次に、摂氏37度に予熱した5ミリリットルの組織解離プロテアーゼを加えます。プレートからコロニーを持ち上げる前に、コロニーの端が切り上げ始めるまで摂氏37度で細胞を4〜7分間インキュベートします。解離プロテアーゼを注意深く吸引し、コロニーを脱落させずにプレートをPBSで2回穏やかにすすぎます。培養プレートに5ミリリットルの予熱したヒトiPS細胞培地を加えます。次に、上から下に前後に動かして、5ミリリットルのピペットの先端でプレート全体を引っ掻き、コロニーをより小さな細胞凝集体に分割しながら持ち上げます。ヒトiPS細胞の神経前駆細胞への分化に。ヒトiPS細胞が単層を形成し、90%コンフルエントになったら、原稿に記載されているように分化を開始します。12日目に、トリプシン処理後、細胞が懸濁状態でない場合は、1000マイクロリットルのピペットチップから神経誘導培地を細胞上に円運動で吐出して細胞を機械的に剥離し、表面全体を覆う。神経前駆細胞培養物が凍結されている場合は、それらを解凍する。原稿に記載されている培地交換とPBSリンスの後、0.02マイクロモルのシトシンアラビノシドを含む運動ニューロン分化培地で培地を交換し、グリアコミット前駆細胞が有糸分裂後運動ニューロン前駆細胞の下で単一の増殖扁平細胞として出現したときに、摂氏37度と5%二酸化炭素で48時間細胞をインキュベートします。 セルクラスターに集約されます。その後、原稿に示されているように培地交換を行った。めっき当日またはそれ以前に、最初にPLOを水またはPBSで希釈することにより、24ウェルMEAプレートのコーティングを開始します。次に、各ウェルに15〜20マイクロリットルのPLOを加えてウェルの中央に液滴を形成し、ピペットチップで電極を損傷しないように電極領域を覆います。井戸を囲む区画に水を加え、十分な湿度を確保します。そして、PLOを摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。次にプラスチック製のマイクロピペットチップを用いて、電極に触れずにできるだけ多くのPLOを吸引する。次に、井戸を250マイクロリットルの水で3回洗浄します。ピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除き、蓋を外した状態で表面を乾かします。次に、各電極アレイを覆うために15〜20マイクロリットルの希釈ラミニンを追加します。湿度コンパートメントに水を加えて蓋を交換した後、摂氏37度で最低2時間から一晩インキュベートします。プレーティング当日、運動ニューロンとアストロサイト培養物をPBSで1回すすいだ後、0.05%トリプシンを加え、摂氏37度で約5分間インキュベートして細胞を持ち上げます。トリプシン阻害剤を含む15ミリリットルの円錐管に細胞を収集します。そして、プレートを培地またはベースで洗浄して、すべての細胞が確実に収集されるようにします。遠心分離によって細胞をペレット化します。次いで、1000マイクロリットルのピペットを用いて、運動ニューロンおよびアストロサイトを20マイクロモルのROCK阻害剤を含む共培養培地で再懸濁し、1ミリリットルの単一細胞懸濁液を生成する。血球計算盤を使用して、運動ニューロンと星状細胞を数えます。そして数えながら、細胞懸濁液を保管し、摂氏4度の発泡スチロールラックに入れます。両方の細胞懸濁液1ミリリットルを300倍Gで5分間遠心分離する。所望の体積を計算し、ペレットを再懸濁する。必要量のニューロンとアストロサイト懸濁液を等しい比率で混ぜ合わせ、2回ピペッティングして穏やかに混合して完全に混ぜ合わせます。次に、プレートの各ウェルからラミニンを除去し、10マイクロリットルの最終合わせ細胞懸濁液を各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成します。プレートを乱されていない細胞液滴で摂氏37度で20〜30分間インキュベートし、プレートに最初の付着物を形成します。次に、ROCK阻害剤を含む250マイクロリットルの温かい共培養培地を各ウェルの壁にピペットで置き、各ウェルの反対側の壁に同じ容量のピペットを置き、プレートを摂氏37度で24〜36時間インキュベートします。翌日、プレートに破片や死んだ細胞がないか調べます。そして必要に応じて、ROCK阻害剤を含む新鮮な共培養培地と培地を交換します。それ以外の場合は、共培養2日目からROCK阻害剤を含まない共培養培地を使用して、週に2回ハーフ培地交換を行います。記録を行うには、共培養初日からできるだけ早く温度を摂氏37度に設定し、二酸化炭素を5%に設定してからプレートを記録機に移し、少なくとも5分間平衡化してから記録します。実験デザインに応じて、ベースラインアクティビティを隔日または毎週1〜15分記録します。ニューロンまたはアストロサイトを標的とする化合物の一時的な電気生理学的影響を調べるには、プレートの蓋を取り外しますが、機械の蓋を閉じたままにして、ベースライン活動を最低1分間記録します。電気生理学的記録を停止せずに機械の蓋を手動で開き、25マイクロリットルの培地を適切な薬剤ビヒクルと交換します。次に、蓋を手動で閉じ、必要に応じてさらに数分間記録します。同様に、目的の薬をテストします。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持および継代されました。神経新生は、BMPおよびTGF-β経路を不活性化することによる二重SMAD阻害によって開始された。得られた神経上皮幹細胞が分裂し、多層上皮を生成した。神経細胞成長因子とグリオジェニック毛様体神経栄養因子への早期曝露は、前駆細胞の混合集団を生成した。ニューロンは、この混合集団から自発的に出現した。グリオジェニックスイッチは、JAK-STAT経路の活性化を通じて星状細胞の分化を誘導しました。ノッチ阻害剤で処理され分化した運動ニューロン細胞の脊髄同一性は、高いコリンアセチルトランスフェラーゼ発現レベルによって支持された。in vitro培養後90日目に、ヒトiPS細胞アストロサイトはS100ベータおよびGFAP発現によって示される成熟表現型を示し、それらの脊髄局所同一性は以前のタカの発現によって支持された。共培養された細胞は、アストロサイトが下部に摂食層を形成し、上部にネットワークを接続するニューロンと自発的に再配列しました。ニューロンは、単独で培養すると大きな細胞クラスターに凝集し、ヒトiPS運動ニューロンとヒトiPS細胞アストロサイトの共培養では、単層が均一に分布しました。ヒトiPS細胞アストロサイトは、共培養におけるより高い程度のスパイクおよびバースト活性によって示されるように、ヒトiPS細胞運動ニューロンの電気生理学的成熟を増強した。私たちの経験では、幹細胞培養と早期NPC分化は最も困難であり、技術的エラーに敏感です。この段階では、トラブルシューティングの余地がほとんどなく、一貫性と精度で手法を実行してはなりません。ここで説明する共培養技術は、他の細胞型特異的モデルでも同様に使用することができる。

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