無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法
2021年6月14日
この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。
このプロトコルは、合成施設から受け取った小さな遺伝子断片から無細胞反応に使用する大量のDNAテンプレートを迅速に生成する方法を詳述しているため、重要です。転環増幅は、従来のクローニングよりも速く大量のDNAを生成することができます。したがって、合成DNAのライブラリからサイクルを学習する高スループット設計ビルドテストをサポートします。
これらの手法は、多くのステップと少量のボリュームが必要なため、新規ユーザーに対して大きな固有の変動を持つことができます。技術には細心の注意を払う必要があり、練習は完璧になります。まず、PCR キットのすべてのコンポーネントを 1 つの PCR チューブに追加します。
次に、再懸濁された遺伝子断片の1マイクロリットルを加える。培地設定で5~10秒間ボルテックスを行い、混合物を穏やかに均質化します。キットメーカーのプロトコルに従ってサーモサイクラーをプログラミングした後、PCRを実行します。
PCRが完了したら、PCR クリーンアップ キットを使用して、反応ミックスから DNA を精製します。1.5ミリリットルチューブに、DNA結合バッファーとPCRサンプルを5対1の比率で加えます。この混合物を16,000回Gのスピンカラムと遠心分離機に1分間移します。
フローを破棄します。200マイクロリットルのDNA洗浄バッファーをカラムに加え、室温で1分間インキュベートします。列を再び遠心分離し、フロースルーを破棄します。
実証されているように、DNA洗浄バッファーでカラムをもう一度洗います。2回目の洗浄からフロースルーを破棄した後、残りのバッファーを遠心してさらに1~2分間遠心して取り除きます。DNAを溶出するには、カラムを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。
その後、カラムに46マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。1分間のインキュベーションの後、遠心分離によってDNAをチューブに集める。そして分光光度計を用いて精製されたDNAを定量化する。
DNAを消化して円形化するには、必要な反応バッファーの5マイクロリットル、20単位のHindIII制限酵素、および精製されたDNAの45マイクロリットルをPCRチューブに組み合わせます。ピペットを使用して、この混合物を穏やかに均質化します。その後、サーモサイクラーで摂氏37度で15分間インキュベートします。
インキュベーションが完了した後、80°Cで20分間インキュベートすることによってHindIII酵素を加熱不活性化する。次に、T4リガーゼバッファーの5マイクロリットルとT4リガーゼの800単位を新たに消化したDNAに加えます。ピペットと軽く混合した後、25°Cで1時間インキュベートし、循環反応を行います。
反応が完了したら、前述のように PCR クリーンアップ キットを使用して DNA を精製します。その後、DNAを定量化します。転環増幅を行うために、精製された円形化発現テンプレートのすべての反応成分と1マイクロリットルを1本のチューブに結合する。
混合物をピペットとアリコート10マイクロリットルの混合物を4つの別々のチューブに均質化する。チューブを摂氏30度で4~18時間インキュベートし、65度で10分間インキュベートして酵素を不活性化します。熱不活性化後、摂氏12度で5分間インキュベートすることで、チューブ底部の結露を促します。
次に、各チューブに15マイクロリットルの二重蒸留水を加えて得られた溶液を希釈する。前に示したようにDNAを精製し、定量化する前に、各チューブの内容物を組み合わせます。無細胞反応を行うために、必要な様々な成分をチューブに加え、最終的な必要量に二重蒸留水で希釈します。
溶液の半分を上下に10~20回ピペット化して、溶液を十分に混ぜます。15マイクロリットルのアリコートで反応混合物をマイクロティタープレート内の所望のウェルに移します。その後、湿度を維持し、蒸発を防ぐために、無色のシールフィルムでプレートを密封します。
プレートリーダーに密封プレートを置き、反応を完了させます。無細胞系を用いてサブチレシンBPN遺伝子を発現する場合、アリコート94マイクロリットルの二重蒸留水と10マイクロモルPNAの1マイクロリットルを平底、無色96ウェルプレートに含む。その後、完成した無細胞反応の5マイクロリットルを加え、25°Cの温度を維持しながら10分間、20秒ごとに410ナノメートルで吸光度を測定するためにセットされたプレートリーダーを使用してプレートを読み取ります。
BL21 DE3スター抽出物中のスーパーフォルダGFPの発現は、15マイクロリットル反応で3マイクロリットルの未精製RCA DNAのみを使用して、PJL1プラスミドのそれと同等である。テンプレートの量を倍増して3倍にすることは明らかな利点を提供していないようで、反応あたり3マイクロリットルですでに飽和レベルのテンプレートを示唆しています。逆に、シャッフル歪みセル抽出物を使用する場合、RCAテンプレートの量を増やす利点があるようです。
より低い温度または長い折りたたみ時間を必要とするタンパク質は、ワークフロー全体を完了するために必要な時間に影響を与えます。例えば、4時間の発現後にサチリスチンをアッセリングすると、4時間はサブチラシン成熟には不十分であるため、失敗した結果をもたらす。しかし、反応を16時間継続することを可能にすることは、検出可能なレベルのサブチリシンにつながる。
このプロトコルが最大限の効率で動作するためには、すべてのコンポーネントが適切に混在している必要があります。これらの方法に従って、タンパク質候補の大規模なライブラリーを合成的に生成し、次いで特性評価に十分な収率で発現させることができる。この方法により、細胞抽出物で働くNC2センサーを開発する道が開き、プロトタイプタンパク質を迅速に特徴付けることができます。
これにより、新しいバイオ触媒や治療法のタンパク質設計をより迅速かつインテリジェントに繰り返し処理できるようになります。
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概要
この研究は、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニング用の大量のDNAを生成するためのプロトコルを提示します。クローニングや生細胞を必要とせずに、アイソサーマルローリングサークル増幅を用いて細胞フリー発現反応に適したDNAテンプレートを迅速に生成します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- バイオテクノロジー
- 分子生物学
- 遺伝子工学
背景
- 従来のクローニング法は時間がかかり、労力が必要です。
- 細胞フリー発現システムはタンパク質生産の迅速な代替案を提供します。
- ローリングサークル増幅は効率的に大量のDNAを生成できます。
- 技術の多様性は新しいユーザーにとって課題となる可能性があります。
研究の目的
- DNA生成のための合理化されたプロトコルを提供する。
- 設計・構築・テスト・学習サイクルのスループットを向上させる。
- 細胞フリー反応のためのDNA準備の複雑さを軽減する。
使用された方法
- 最小限のテンプレートの酵素消化。
- DNA断片の環状化。
- DNA増幅のためのアイソサーマルローリングサークル増幅。
- 精製されていない製品を使用した細胞フリー発現反応。
主な結果
- 小さな遺伝子断片から大量のDNAの生成に成功しました。
- 従来の方法と比較して、より速いDNA生産を実証しました。
- 新しいユーザーにとって技術と実践の重要性を強調しました。
- 合成DNA応用においてより高いスループットを促進しました。
結論
- このプロトコルはDNA生成のための効率的な方法を提供します。
- 細胞フリータンパク質合成の進歩をサポートします。
- プロトコルの慎重な実行により、変動を最小限に抑えることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid enzymatic amplification of minimal, linear DNA templates enables accelerated protein prototyping in cell-free systems, reducing cycle times from gene synthesis to functional assay. This approach supports high-throughput design-build-test-learn workflows, critical for early-stage biopharma discovery and synthetic biology innovation. By bypassing traditional cloning and leveraging direct cell-free expression, teams can iterate on protein candidates with greater speed and flexibility.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation and testing of protein variants from synthetic DNA libraries.
- Supports functional validation of novel targets without cell-based cloning constraints.
- Facilitates iterative optimization of protein design for mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Provides microgram to milligram quantities of DNA template for scalable cell-free assays.
- Reduces preparation time, allowing faster assay standardization and reproducibility checks.
- Enables direct use of RCA products in screening workflows, minimizing purification steps.
Translational & Preclinical Research
- Accelerates prototyping of candidate biocatalysts and therapeutic proteins for downstream validation.
- Supports rapid characterization of protein function in disease-relevant cell-free systems.
- Improves continuity from synthetic gene design to preclinical protein evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of synthetic gene receipt and early protein function screening, bridging discovery biology and assay development. It is positioned to streamline workflows from gene synthesis through lead identification and preclinical prototyping.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway interrogation by enabling fast protein expression from minimal templates.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative DNA inputs for high-throughput cell-free assays.
- Analytics: Supports direct measurement of protein activity and expression levels from unpurified templates.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from synthetic construct to functional protein for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for diverse protein prototyping needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein function and target engagement.
- Operational Value: Standardizes DNA preparation, reduces hands-on time, and enhances throughput.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces resource investment in early-stage candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling rapid, parallel evaluation of multiple constructs.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in PCR, enzymatic digestion, and isothermal amplification techniques.
- Needs access to thermocyclers, plate readers, and basic molecular biology infrastructure.
- Demands careful technique to minimize variability, especially for new users handling small volumes.
- Adaptable to various protein targets and cell-free systems with minimal protocol changes.
- Workflow efficiency may vary with protein folding requirements and assay maturation times.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Amplifying the Gene Fragment via PCR
2:21
Digestion and Circularization
3:28
Isothermal Rolling Circle Amplification (RCA)
4:28
Cell-free Reaction and Subtilisin Assay
5:41
Results: Protein Expression from the Rolling Circle Amplification (RCA) Templates Using Cell-Free Systems
6:49
Conclusion
