Name: 間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶ間葉系幹細胞によるマクロファージ食前細胞の調節メカニズム。pH感受性蛍光粒子を用いた共培養法で、自然免疫における細胞接触機構を可視化・定量化する技術を解説します。

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この研究は、NSFの主要な研究機器メカニズムによって、1626093および1919583の助成金の下で支えられた。

<ol><li>Phinney, D. G., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Mesenchymal+stem%2Fmultipotent+stromal+cells%3A+The+state+of+transdifferentiation+and+modes+of+tissue+repair--current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views.</a> Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).</li>
<li>Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+sensors+and+switchers+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation.</a> Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).</li>
<li>Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+suppress+donor+CD4%28%2B%29+T+cell+proliferation+and+reduce+pathology+in+a+humanized+mouse+model+of+acute+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease.</a> Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).</li>
<li>Giuliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+inhibitory+effects+of+fetal+liver+mesenchymal+stem+cells+on+T-lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation.</a> PLoS One. 6 (5), 19988(2011).</li>
<li>Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+induce+apoptosis+of+activated+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells.</a> Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).</li>
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<li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+paradigm%3A+Polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), 10088(2010).</li>
<li>Nemeth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+stromal+cells+attenuate+sepsis+via+prostaglandin+E%282%29-dependent+reprogramming+of+host+macrophages+to+increase+their+Interleukin-10+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production.</a> Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).</li>
<li>Maggini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stromal+Cells+Turn+Activated+Macrophages+into+a+Regulatory-Like+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile.</a> PLoS One. 5 (2), 9252(2010).</li>
<li>Takizawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+propagate+immunosuppressive%2Fanti-inflammatory+macrophages+in+cell-to-cell+contact-independent+and-dependent+manners+under+hypoxic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture.</a> Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).</li>
<li>Kim, J., Hematti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-educated+macrophages%3A+a+novel+type+of+alternatively+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages.</a> Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).</li>
<li>Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+aorta-derived+mesenchymal+progenitor+cells+contribute+to+and+enhance+the+immune+response+of+macrophage+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions.</a> Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).</li>
<li>Cho, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reciprocally+regulate+the+M1%2FM2+balance+in+mouse+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages.</a> Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).</li>
<li>Fernandez, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+mesenchymal+progenitor+cells+expressing+adipogenic+and+osteogenic+transcription+factors+suppress+the+macrophage+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response.</a> Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).</li>
<li>Jackson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transfer+via+tunneling+nanotubes+is+an+important+mechanism+by+which+mesenchymal+stem+cells+enhance+macrophage+phagocytosis+in+the+in+vitro+and+in+vivo+models+of+ARDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS.</a> Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).</li>
<li>Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Overview of the immune response.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).</li>
<li>Lim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+mechanisms+of+nonopsonic+uptake+of+cryptococci+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages.</a> Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B3+inhibits+nonopsonized+phagocytosis+of+macrophages+via+an+mTORC1-c%2FEBP+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway.</a> Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).</li>
<li>Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+assays+with+different+PH-sensitive+fluorescent+particles+and+various+readouts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts.</a> Biotechniques. 68, 245-250 (2020).</li>
<li>Kapellos, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+real+time+imaging+platform+to+quantify+macrophage+pahgocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis.</a> Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).</li>
<li>Takahashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+quantitation+of+platelet+phagocytosis+by+monocytes+using+a+pH-sensitive+dye%2C+pHrodo-SE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE.</a> Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).</li>
</ol>

著者は宣言する利害の対立を持っていません。

pH感受性色素に結合した生体粒子を用いた貪食の分析は、従来の蛍光標識粒子12、19、20よりも有利であることが証明された比較的新しいツールである。従来の蛍光標識粒子では、エンドポイント分析のみが可能です。検出は、食細胞によって取り込まれていない粒子を洗浄または消毒した後、蛍光顕微鏡および/または分光蛍光法で行われます。分光フルオロメトリーから得られた定量的データは、非巻き込み粒子を検出する可能性を有し、そして細胞内粒子のみを定量する画像解析は、従来の蛍光顕微鏡システム14を用いて、退屈で時間のかかる。pH感受性染料に結合した生体粒子は、食道体などの酸性環境でのみ蛍光を発し、したがって、退屈な洗浄および焼入工程は不要である14。さらに、pH感受性標識化されたバイオ粒子は、FITCや他の蛍光圏共役生物粒子では容易に取得できない運動データを提供するという利点を提供...

間葉系幹細胞(MSC)は、結合組織細胞を生み出す前駆細胞です。MSCは、哺乳動物の成人組織に存在し、骨髄1から単離することができる。それらの免疫調節特性のために、これらの細胞は広く研究されている2.初期の研究は、T細胞3、4、5、6のMSC調節に焦点を当てたが、最近では、自然免疫の主要な細胞成分であるマクロファージ細胞(MΦ)の調節が、7、8、9、10、11、12、13、14の注目を集めている.炎症性疾患の治療におけるMSC-MΦ相互作用の重要性は、単球/マクロファージの枯渇が動物モデル8におけるMSCの治療効果を損なうという事実によって強調される。ここで、焦点はMΦとMSCの細胞接触相互作用である。MSCは、炎症反応から抗炎症反応への切り替えを促進することによってMΦの表現型を調節する能力を有し、組織修復活動8、9、10、11に至り、これらの調節メカニズムを実証するために多くが行われている。他の状況下では、MSCはMΦ駆動の炎症反応12、13を支持または悪化させ、MΦ貪食活性14、15を増強することができる。しかし、MSCがMΦ貪食活性を調節するメカニズムと条件を特定する既存のデータが欠けています。
MΦは、オプゾン化(抗体または補体被覆)または食作用に至る非オプソン化病原体のいずれかを認識する受容体のファミリーを有する16。後者の活性化と活動はあまりよく研究されていない17.非炎症性インビトロ環境において、MSCは非オプソン化病原体13のMΦ貪食症を増強する。しかし、MΦによる非オプソナイズ病原体の認識は、適応免疫応答中にリンパ球によって産生される炎症環境への曝露後に減少し得る。天然キラー細胞およびエフェクターリンパ球によって放出されるIFN-γは、非オプソン化粒子18のMΦ貪食症に対して阻害効果を有する。MΦ貪食症のMSC直接接触調節機構を研究するために、共培養モデルが開発された。ここで提示する実験の目的は、MΦがIFN-γにさらされた後にMSCが非オプス化病原体のMΦ貪食症を調節するかどうかを決定することです(図1)。

<table><tbody><tr><td>96ウェルブラックポリスチレンマイクロプレート</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3603-48EA</td><td></td></tr><tr><td>0.4%トリパンブルー溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>15 mLおよび50 mL円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>ThermoFisher</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルチャンバーカバーグラス付き 取り外し不可能なウェル</td><td>ThermoFisher</td><td>155382PK</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬(100倍)&nbsp;Gibco</td><td>ThermoFisher</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Axiobserver 7 イメージングシステム</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A8806-1G</td><td></td></tr><tr><td>セルリフター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS3008-100EA</td><td></td></tr><tr><td>培養フラスコ、組織培養処理済み、表面積 75&nbsp;cm2、カントネック、キャップ付き、フィルター付き</td><td>ミリポアSigma</td><td>C7231-120EA</td><td></td></tr><tr><td>D1 ORL UVA [D1]</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424</td><td>マウスMSC細胞株</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、熱不活化</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>FisherScientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>I-11.15</td><td>ATCC</td><td>CRL-2470</td><td>マウス M&Phi;細胞株</td></tr><tr><td>LADMAC細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td>LADMAC細胞は、成長因子コロニー刺激因子1(CSF-1)を分泌します。</td></tr><tr><td>生細胞イメージングソリューション</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>P35365</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine IFN-&gamma;</td><td>Preprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Spectramax i3X</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み単回使用真空フィルターユニット、250 mL、0.2 &micro;m</td><td>ThermoFisher</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター、0.2 μm</td><td>ThermoFisher</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>組織培養処理培養ディッシュ、100 mm x 20 mm</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430167-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

Mesenchymal Stem Cell Regulation of Macrophage Phagocytosis; Quantitation and Imaging

間葉系幹細胞(MSC)は、伝統的に再生特性について研究されてきましたが、最近では免疫調節特性が最前線に位置しています。彼らは免疫細胞の活性と相互作用し、調節します。.本研究の焦点は、マクロファージ貪食活動のMSC調節である。マクロファージ(MΦ)貪食症は、感染に対する自然免疫系の反応の重要な部分であり、MSCがこの応答を調節するメカニズムは積極的に調査中である。本明細書に提示される非オプソ化ザイモサン粒子のMΦ食細胞化を研究する方法であり、MSCと共培養中にpH感受性蛍光分子に結合する。食作用活性が増加し、標識されたザイモサン粒子がファゴリソームの酸性環境内に封入されると、pH感受性分子の蛍光強度が高くなる。適切な励起波長と発光波長により、蛍光分光光度計を用いて貪食活性を測定し、70分の間に相対的な蛍光単位の変化として運動データを提示します。この定量的データをサポートするために、食作用活性の変化を動的イメージングを用いて可視化する。この方法を用いた結果は、共培養時に、MSCがナイーブとIFN γの両方の非オプソナイズザイモサンのMΦ貪食症を増強することを示γ MΦを治療した。これらのデータは、自然免疫系のMSC調節の現在の知識に追加されます。この方法は、将来の調査で、基礎となる細胞および分子機構を完全に引き出すために適用することができます。

すべての時間ポイントで各グループの平均±SEMを計算した後、データはY軸を相対蛍光強度、X軸を時間として折れ線グラフ形式で表示します。 補足ファイル 1 は、96 ウェルプレートのキネティック読み取りからスプレッドシート形式での生データの例を提供します。
本研究では、図3Aおよび表3に示す最適な結果は、1)MSCとの共培養がマクロファージの貪食活性を高めることを示し、2)IFN-y治療はマクロファージの活性を低下させ、3)MSCとの共培養はMΦ貪食活性を部分的に救う。これらの研究では最適な細胞密度が重要であり、MΦが低密度でメッキされると、蛍光強度の変化は検出できない(図3B)。図3Cは、MΦが高すぎる密度でメッキされ、蛍光強度が全群で急速に上昇し、差異を識別できない研究のデータを表している。動的イメージングビデオは、蛍光強度の変化が、培...

ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。

Mesenchymal stem cells (MSC) have traditionally been studied for their regenerative properties, but more recently, their immunoregulatory characteristics ...

この共培養法は、間葉系幹細胞調節のマクロファージ食細胞調節の背後にある細胞接触機構を取り巻く主要な質問に答え、したがって、自然免疫を調節するMSCの役割を明示するのに役立ちます。この手法は、ハイスループット分析で適用できます。pH感受性の色素に結合した生体粒子は、酸性ファゴリソソーム環境でのみ蛍光を発する。そのため、洗浄と焼入れが必要です。この方法は、好中球および他の食細胞を含む様々な共培養モデルにも適用することができる。この手順のデモンストレーションは、現在私の研究室の学部生であるイーサン・チェトコフです。まず、培養間葉系幹細胞の合流性を観察する。70~80%の合流が達成されると、培養細胞から培養液を100ミリメートル皿に吸引し、5ミリリットルのPBSを加える。PBSを吸引した後、0.05%トリプシンEDTA溶液の2ミリリットルを加え、細胞を3分間インキュベートします。3分後、逆顕微鏡を使って細胞剥離を確認します。そして、細胞が剥離されていない場合は、再び1〜2分間インキュベートします。すべての細胞が切り離されたら、5ミリリットルの新鮮な成長培地をプレートに加えます。トリプシン培地混合物を使用してプレートをすすった後、無菌血清ピペットを使用して、清潔で無菌の50ミリリットル円錐形チューブに細胞を収集します。次に、遠心分離により細胞をペレットダウンさせる。上清を吸引した後、細胞ペレットを上下に軽くピペット化して10ミリリットルの新鮮な成長培地で再懸濁する。セルカウントの場合、0.4%のトリパンブルー溶液の30マイクロリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に10マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、その後、ヘモサイトメーター計のカバースリップの下に10マイクロリットルの混合物を加えます。反転顕微鏡またはブライトフィールド顕微鏡の下で、10X対物レンズと4つの1平方ミリメートル室を使用して染色されていない生存細胞を数え、テキスト原稿に記載されているように細胞数を計算します。C1V1はC2V2と等しい式を使用して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に10〜5番目の細胞の最終濃度で細胞懸濁液を調製するために必要な新鮮な培地および細胞懸濁液の所望の体積を決定する。マルチチャンネルマイクロピペッタを使用して、プレート設計に従って96ウェルプレートのウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。マイクロピペットを使用して、プレート設計に従ってチャンバースライドの各1つに細胞懸濁液の530マイクロリットルを加え、一晩インキュベートします。100ミリメートル皿でマクロファージ細胞を活性化するために、1ミリリットル当たり250ナノグラムの濃度でインターフェロンガンマを含む活性化培地の10ミリリットルを調製する。マクロファージ細胞培養物から増殖培地を吸引し、インターフェロンガンマを欠いた活性化培地を5ミリリットルで細胞をすすくする。実験皿の中でリンス培地を吸引した後、インターフェロンガンマを補った活性化培地を10ミリリットル添加する。そして、コントロールディッシュに、インターフェロンガンマなしで10ミリリットルの活性化培地を加え、16〜24時間細胞をインキュベートする。インキュベーションの終わりに、共培養を調製するために、マクロファージ細胞から活性化培地を取り出し、新鮮な増殖培地を5ミリリットル添加する。セルリフターを使用して細胞を優しく削り取り、50ミリリットルの円錐管に細胞を集めます。次に、トリパンブルー排除および血球測定を用いて細胞を数え、続いて、間葉系幹細胞について先に示したように、1ミリリットル当たり2倍の10〜5番目の細胞の濃度でマクロファージ細胞懸濁液を調製し、処置した。間葉系幹細胞を含む実験井戸から培地を穏やかに吸引する。マルチチャネルマイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの処理物を添加し、かつ、プレート設計に従って適切な実験井戸に制御マクロファージ細胞懸濁液を加え、実証したように一晩インキュベートする。間葉系幹細胞を含む四壁のチャンバースライドから培地を穏やかに吸引する。マイクロピペットを使用して、530マイクロリットルのマクロファージ細胞懸濁液を適切なウェルに追加し、一晩インキュベートします。1ミリグラムのZymosan粒子を含むバイアルに生細胞イメージング培地を1ミリリットル加え、培地粒子混合物をガラス培養チューブに集める。さらに1ミリリットルのイメージング溶液でバイアルをすすった後、ガラスチューブにリンスイメージング媒体を移し、3ミリリットルのイメージング溶液を追加して、1ミリリットルのZymosan粒子懸濁液あたり0.2ミリグラムを達成する。30〜60秒間クイックパルスを使用してZymosanサスペンションをボルテックスし、プローブ超音波処理器を使用して60のクイックパルスでサスペンションを超音波処理します。培地を吸引した後、実験井戸と試薬ブランクウェルを100マイクロリットルの生細胞イメージング溶液でリンスします。次に、生細胞イメージング溶液をウェルから吸引し、100マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。タッチパッドインターフェイスを使用して、蛍光リーダーのプレートトレイを開きます。トレイの蓋を付けずにプレートを左上にA1ウェルにセットします。タッチパッドを使用してトレイを閉じ、トップメニューの緑色の読み取りボタンをクリックします。食塩基性アッセイを行うために、イメージング培地の750マイクロリットルで第1の実験をよくすすった後、残りのウェルを成長培地に残して400マイクロリットルのZymosan懸濁液を加える。次に、撮像システムのインキュベート段階にスライドを置きます。イメージング ソフトウェアを使用します。[探す] タブの [明るいフィールド] オプションを選択し、接眼アイコンをクリックします。10Xの目的を所定の位置に置いて、接眼レンズとフォーカスノブを使用して細胞に焦点を当てます。取得タブを選択します。実験ドロップダウンメニューを開き、509ナノメートルの励起とpH感受性色素の533ナノメートルの発光波長に対応するように設定されたEGFPフィルタを含む波長のセットを選択します。タイマーに約2分残っている場合は、目的メニューの20Xアイコンをクリックして目的を20Xに変更し、チャンネルメニューをクリックしてEGFPフィルタを選択し、露出メニューでpH感受性の緑色のフルオロフォアを検出するために露出時間を400ミリ秒に設定し、ライブでクリックします。フォーカスを調整した後、停止をクリックしてライトをオフにし、トップタイムラプス実験設定の横にあるチェックボックスをオンにします。フォーカス戦略メニューでソフトウェアのオートフォーカスを選択し、ドロップダウンメニューからスマート設定とコア設定を選択して、オートフォーカスの実行中の光への露出時間を短縮します。タイムラプスメニューで、必要な取得数を30~60、間隔を1分に設定し、実験開始ボタンをクリックして取得を開始します。インターフェロンガンマの共培養に及ぼす影響を検討した。本代表結果は、間葉系幹細胞とマクロファージの共培養がマクロファージの貪食活性を高めることを示す。インターフェロンガンマ治療は、マクロファージの活性を低下させる。しかし、間葉系幹細胞の存在下では、マクロファージ貪食活性が部分的に救出された。これらの研究では、最適な細胞密度が重要です。また、マクロファージ細胞が低密度でめっきされた場合、蛍光強度の変化は検出されなかった。マクロファージ細胞を高密度でめっきした場合、蛍光強度は全群で急速に上昇し、差異は見分けができなかった。この手順で最も重要なことの 1 つは、細胞密度が最適化され、実験間で一貫性を保つようにすることです。

mesenchymal-stem-cell-regulation-macrophage-phagocytosis-quantitation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。...

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

このビデオは、共培養におけるマクロファージ食作用の間葉系幹細胞(MSC)制御を研究するアッセイを示しています。MSCをマクロファージと共培養すると、pH感受性蛍光色素に結合した非オプソニン化ザイモサン粒子が添加され、マクロファージによって食作用されます。食作用の増加に伴い、蛍光強度が上昇し、MSCを介した食作用活性の調節を決定することができます。...

間葉系幹細胞によるマクロファージ食作用の制御を研究するためのアッセイ

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骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

蛍光に分類された髄鞘の残骸と細胞内脂質液滴染色を使用してプライマリ...

体外骨髄由来マクロファージによって髄鞘の残骸の貪食

ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。...

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。...

M1マクロファージ-4T1マウス乳腺癌細胞における食細胞活性のタイムラプス2Dイメージング

このプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞からのマクロファージの堅牢な生成とその後の特性評価のための方法を記述する。細胞表面マーカー発現、遺伝子発現、および機能アッセイは、これらのiPSC由来マクロファージの表現型および機能を評価するために使用される。...

多能性幹細胞からのヒトマクロファージの生成と特性

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。...

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。...

iPSCマクロファージによる死んだ神経芽細胞の食細胞に対するインビトロ定量イメージングアッセイ

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

学ぶ間葉系幹細胞によるマクロファージ食前細胞の調節メカニズム。pH感受性蛍光粒子を用いた共培養法で、自然免疫における細胞接触機構を可視化・定量化する技術を解説します。

間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング

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