Name: 二重蛍光系比測定法を用いたマクロピノソームのpH、レドックス化学、分解能の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶ二重蛍光系比測定法によるマクロピノソームのpH、酸化還元状態、タンパク質分解のリアルタイム測定法。Raw264.7細胞を用いてオルガネラレベルの不均一性を解析し、創薬研究に貢献します。

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私たちは、カルガリー大学の支援に感謝します。また、試薬、機器、有益な議論へのアクセスをロビン・イェーツ博士に感謝したいと思います。

1. 細胞の調製
<ol><li>37°CでRaw264.7細胞を増殖させ、10%の熱不活性化血清を加えたRPMIで5%CO2〜70%の合流性を有する。</li>
	<li>アッセイの前日には、96ウェルプレートで1ウェルあたり5 x 104 細胞の密度でRaw264.7細胞をシードします。各ウェルに100 μLの成長培地が含まれていることを確認します。96ウェルプレートに黒い側面とイメージング用のガラス底があることを確認します。 注: ここでは、96 ウェルプレートをイメージングに使用しました。96ウェルプレートは、より大きな画像処理室に比べて少量の細胞および試薬を使用することを可能にします。しかし、ライブ細胞のイメージング用に設計されたチャンバーはいずれも使用でき、それに応じて試薬をスケールアップすることができます。</li>
	<li>アッセイの日に、ウェルが少なくとも70%コンフルエントであるかどうかを確認してください。</li>
</ol>2. マクロピノソームpHの測定
<ol><li>セクション 1 のようにセルを準備します。</li>
	<li>37°Cで100μLのHBSSですべてのウェルを洗います。</li>
	<li>TMR標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとフルオレセイン標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLを含むHBSSの100 μLを各ウェルに充填してください。</li>
	<li>細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。</li>
	<li>インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗います。</li>
	<li>37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。</li>
	<li>加熱されたステージとチャンバーで顕微鏡の上にプレートを置きます。</li>
	<li>必要に応じて、各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。 注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、Leica SP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得した。TMRは543レーザーラインで励起され、放出は610 nmから650 nmまで収集された。フルオレセインは488レーザーラインで励起し、500 nmから550 nmまでの放出を収集した。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。</li>
	<li>各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。</li>
	<li>最初の取得後、すべての井戸がプレート全体に焦点を合わせ続けているかどうかを確認します。</li>
	<li>所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。</li>
</ol>3. マクロピノソームpHの その時点 での較正
<ol><li>画像取得中に、140 mM KCl、1 mM MgCl 2、1 mMCaCl2、および5 mMグルコースを含むカリウムが豊富な(K+-リッチ)溶液を1L調製します。25 mM HEPES (1 M、 pH 7.2 ストック溶液) と 25 mM MES (0.5 M、pH 6.0 ストックソリューションから) を含む別の 400 mL 容積を加えた K+豊富な溶液の 400 mL 容積を補います。</li>
	<li>必要に応じて、10 M HCl または 10 M KOH を使用して、25 mM HEPES でバッファリングされた K+リッチソリューションの 50 mL アリコートを pH 7.5 に調整します。</li>
	<li>必要に応じて、10 M HCl または 10 M KOH を使用して、25 mM MES でバッファーされる K+リッチソリューションの 3 つの別個の 50 mL アリコートを pH 6.5、pH 5.5、および pH 5.0 に調整します。 注: 低いpH溶液には酢酸酢酸緩衝液が好ましい場合があります。</li>
	<li>画像取得が完了したら、細胞を含む96ウェルプレートからHBSSを取り出し、pH 7.5にあるK+-リッチ溶液に交換します。</li>
	<li>10 μg/mLの最終濃度にニジェリシンを加えます。 注:ニジェリシンは、H+のためにK+を交換するイオノフォアです。K+リッチ溶液のK+濃度をサイトゾルのK+濃度に近似する値に設定することで、ニジェリジシンがマクロピノソームのpHをサイトゾルのpHにクランプし、キャリブレーションバッファのpHを反射することを保証できる。</li>
	<li>プレートを顕微鏡に戻し、上記と同じ取得設定を使用して各ウェルの画像を取得します。</li>
	<li>各キャリブレーションバッファに対して、ステップ3.5と3.6を繰り返します。</li>
</ol>4. マクロピノソームpHのデータ分析
<ol><li>フィジーソフトウェアを使用して、TMRとフルオレセインチャネルの両方から背景を差し引きます。</li>
	<li>TMR チャネルでマスクを生成します。マスクを生成するには、[閾値を調整]を選択してイメージ >をバイナリイメージ>変換>します。次に、バイナリイメージをハイライト表示し、[ 選択範囲>編集]を選択>マスクを作成します。</li>
	<li>TMR画像とフルオレセイン画像の両方に適用します。これを行うには、マスクをハイライト表示し、[ 選択範囲の編集] >選択>選択を作成します。TMR イメージをクリックし 、Shift + E キーを押して、マスクを TMR チャネルに適用します。同様に、フルオレセイン画像をクリックし 、Shift + E キーを押して、OBチャンネルにマスクを適用します。</li>
	<li>マスク内のマクロピノソームごとにTMRとフルオレセインの強度を記録します。</li>
	<li>時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。</li>
	<li>in キャリブレーションで撮影した画像について、手順 4.1 ~ 4.3 を 繰り返します。</li>
	<li>フッ素の強度を TMR 強度で割って、フルオレセイン:TMR 比を生成します。</li>
	<li>キャリブレーション画像のフルオレセイン:TMR比に対してpHをプロットします。</li>
	<li>キャリブレーションデータにカーブをフィットさせます。</li>
	<li>時間経過から各時点のデータを補間して、絶対 pH 値を取得します。</li>
</ol>5. マクロピノソーム内の酸化事象の測定
<ol><li>セクション 1 のようにセルを準備します。</li>
	<li>アッセイの前日、H2DCFDAスクシニミジルエステルを調製し、70 kDaデキストランの標識を10mgの70kDaデキストランアミノを0.1 Mの炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.3)の1mLで再懸濁して調製した。Dextran-アミノ溶液にH2DCFDAスクシニミジルエステルの1mgを加え、1時間インキュベートします。D透析 H2DCFDA ラベル 70 kDa dextran を PBS に対して.H2DCFDA標識70 kDaデキストランは、貯蔵時に酸化するので、1日以上保存しないでください。</li>
	<li>アッセイの日に、37°CでHBSSの100 μLですべての井戸を洗います。</li>
	<li>TMR標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとH2DCFDA標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLを含むHBSSの100 μLで各井戸を充填します。</li>
	<li>細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。</li>
	<li>インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗浄します。</li>
	<li>37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。</li>
	<li>加熱されたステージとチャンバーを使用して顕微鏡にプレートを置き、必要に応じて各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。 注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、ライカSP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得しました。TMRは543レーザーラインで励起し、610 nmから650 nmまでの放出を収集した。H2DCFDAは488レーザーラインで励起され、放出は500 nmから550 nmまで収集された。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。</li>
	<li>各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。</li>
	<li>最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けるかどうかを確認します。</li>
	<li>所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。</li>
</ol>6. マクロピノソーム内の酸化事象のデータ解析
<ol><li>フィジーソフトウェアを使用して、TMRとH2DCFDAチャネルの両方から背景を差し引きます。</li>
	<li>TMR チャネルでマスクを生成します。マスクを生成するには、[閾値を調整]を選択してイメージ >をバイナリイメージ>変換>します。次に、バイナリイメージをハイライト表示し、[ 選択範囲>編集]を選択>マスクを作成します。</li>
	<li>マスクを TMR および H2DCFDA イメージの両方に適用します。これを行うには、マスクをハイライト表示し、[ 選択範囲の編集] >選択>選択を作成します。TMR イメージをクリックし 、Shift + E キーを押して、マスクを TMR チャネルに適用します。同様に、H2DCFDA イメージをクリックし 、Shift + E を押して、マスクを H2DCFDA チャネルに適用します。</li>
	<li>マスク内のマクロピノソームごとにTMRとH2DCFDAの強度を記録します。</li>
	<li>時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。</li>
	<li>H2DCFDA強度をTMR強度で割り、H2DCFDA:TMR比を生成する。</li>
	<li>時間に対するH2DCFDA:TMR比をプロットします。</li>
</ol>7. マクロピノソーム内のタンパク質消化の測定
<ol><li>セクション 1 のようにセルを準備します。</li>
	<li>アッセイの日には、37°Cで100 μL HBSSですべてのウェルを洗浄してください。</li>
	<li>HBSSで4mg/mLの濃度にBODIPY標識オボアルブミンを溶解します。</li>
	<li>TMRラベル70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとBODIPYラベルのオボアルブミンの0.2 mg/mLを含むHBSSの100 μLを各ウェルに充填してください。</li>
	<li>細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。</li>
	<li>インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗浄します。</li>
	<li>37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。</li>
	<li>加熱されたステージとチャンバーを使用して顕微鏡にプレートを置き、必要に応じて各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。 注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、Leica SP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得した。TMRは543レーザーラインで励起し、610 nmから650 nmまでの放出を収集した。BODIPYは488レーザーラインで励起され、500 nmから550 nmまでの放出を収集した。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。</li>
	<li>各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。</li>
	<li>最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けるかどうかを確認します。</li>
	<li>所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。</li>
</ol>8. マクロピノソーム内のタンパク質消化に関するデータ解析
<ol><li>フィジーのソフトウェアを使用して、TMR と BODIPY の両方のチャネルから背景を差し引きます。</li>
	<li>TMR チャネルでマスクを生成し、上記のステップ 6.2 および 6.3 の手順 (図 3B)のように、TMR および BODIPY イメージの両方に適用します。</li>
	<li>マスク内のマクロピノソームごとに TMR と BODIPY 強度を記録します。</li>
	<li>時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。</li>
	<li>BODIPY 強度を TMR 強度で割って、BODIPY:TMR 比を生成します。</li>
	<li>時間に対する BODIPY:TMR 比をプロットします。</li>
</ol>

<ol><li>Canton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis%3A+New+insights+into+its+underappreciated+role+in+innate+immune+cell+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance.</a> Frontiers in Immunology. 9, (2018).</li>
<li>Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Macropinocytosis.</a> Cell. 169, 766(2017).</li>
<li>Williams, T., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+measurement+of+Dictyostelium+discoideum+macropinocytosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).</li>
<li>Ganot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+macropinocytosis+in+anthozoans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans.</a> eLife. 50022, (2020).</li>
<li>Charpentier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+drives+T+cell+growth+by+sustaining+the+activation+of+mTORC1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1.</a> Nature Communications. 11, 180(2020).</li>
<li>Bohdanowicz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidic+acid+is+required+for+the+constitutive+ruffling+and+macropinocytosis+of+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes.</a> Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).</li>
<li>Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+macropinocytic+index+of+cells+through+a+quantitative+image-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay.</a> Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).</li>
<li>Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+ruffles+enhance+activation+of+Akt+by+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors.</a> Journal of Cell Science. 131, (2018).</li>
<li>Commisso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+of+protein+is+an+amino+acid+supply+route+in+Ras-transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells.</a> Nature. 497, 633-637 (2013).</li>
<li>Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pervasiveness+of+macropinocytosis+in+oncological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153(2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+cancer-associated+fibroblasts+is+dependent+on+CaMKK2%2FARHGEF2+signaling+and+functions+to+support+tumor+and+stromal+cell+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness.</a> Cancer Discovery. , (2021).</li>
<li>Lee, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-Pak+signaling+selectively+regulates+glutamine+deprivation-induced+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis.</a> Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).</li>
<li>Michalopoulou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+renders+a+subset+of+pancreatic+tumor+cells+resistant+to+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition.</a> Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).</li>
<li>Mercer, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+entry+by+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Virus entry by macropinocytosis.</a> Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305, 1153-1157 (2004).</li>
<li>Canton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptors+signal+constitutive+macropinocytosis+and+facilitate+the+uptake+of+NOD2+ligands+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages.</a> Nature Communications. 7, 11284(2016).</li>
<li>Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+macropinocytosis+and+the+mannose+receptor+to+concentrate+macromolecules+in+the+major+histocomaptibility+complex+class+II+compartment%3A+downregulation+by+cytokines+and+bacterial+products%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products.</a> Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).</li>
<li>Bhosle, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLIT2%2FROBO1-signaling+inhibits+macropinocytosis+by+opposing+cortical+cytoskeletal+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling.</a> Nature Communications. 11, 4112(2020).</li>
<li>Liu, Z., Roche, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macropinocytosis+in+phagocytes%3A+regulation+of+MHC+class-II-restricted+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells.</a> Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).</li>
<li>Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+macropinocytosis+for+intracellular+delivery+of+therapeutic+nucleic+acids+to+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156(2019).</li>
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<li>Canton, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+phagosomal+pH+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).</li>
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<li>Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+macropinocytosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of macropinocytosis in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).</li>
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</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

マクロファージ、線維芽細胞、さらにはジクチオステリウム属のマクロピノサイクの取り込みの低スループットと高スループットの両方の測定のためのプロトコルの数がありますが。3、7、31、32、33、非常に少数の試みは、これらの動的コンパートメントの発光生化学を測定するために行われている。これは、他のエンドサイトコンパートメントを避けながら、マクロピノソームコンパートメントに効率的に標的化できるプローブの貧弱性が原因である可能性があります。ここでは、マクロピノソーム内のpH、酸化イベント、およびタンパク質消化の動的測定のための蛍光プローブを標的とする技術について説明します。
レシオメトリック蛍光顕微鏡は、何十年もの間、内経pHを測定してきた主要な技術で...

マクロピノサイトーシスとは、マクロピノソーム1,2と呼ばれる膜結合細胞質小器官への大量の細胞外液の取り込みのことをいう。これは、アメーバ・ジクチオステリウム属のような自由に生きている単細胞生物によって行われる高度に保存されたプロセスである。3、アントゾアン4とメタゾアン2と同様に。ほとんどの細胞では、マクロピノサイトーシスは誘発事象である。細胞表面受容体のライゲーションは、フリルと呼ばれるアクチン駆動形質膜拡張の突起を誘導する。これらのフリルの一部は、いくつかの十分に理解されていないメカニズムによって、マクロピノソームを形成するために遠位の先端をシールします(しかし、この方法の論文の範囲を超えて、マクロピノサイトーシスの力学に関する詳細なレビューについては、参照1、2、5、6、7を参照してください)。マクロピノサイトーシスを誘発する細胞外刺激は、最も多い可溶性増殖因子5,8である。したがって、マクロピノサイトー事象は、細胞が成長を促進するために有用な代謝産物を導き出すことができる細胞外物質のボーラスの摂取を可能にする。残念ながら、栄養分娩のためのこの経路はまた、病理学を駆動することができます。ある種の癌細胞は、連続的または構成的なマクロピノサイトーシスをもたらす突然変異を収容する。栄養素の連続的な送達は癌細胞の制御不能な増殖を促進し、特に積極的な腫瘍9、10、11、12、13にリンクされている。同様に、ウイルスは、宿主細胞へのアクセスを得るためにマクロピノサイトーシスを誘導し、それによってウイルス病理14を駆動することができる。
マクロピノサイトーシスは、病原体に対する免疫の維持にも機能する。マクロファージや樹状細胞などの特定の自然免疫細胞は、マクロピノサイトーシス6、15、16を介して細胞外液の構成的かつ積極的なサンプリングに従事する。このマクロピノサイトーシスのモードは非常に活発であり、単一の樹状細胞は、1時間ごとに自重に相当する細胞外液の体積を持つことができます。この構成的なサンプリングにもかかわらず、マクロファージと樹状細胞は腫瘍細胞のように制御不能に複製されず、代わりに、潜在的な脅威の存在、または実際に不在を知らせるために情報を抽出できるように細胞外物質を処理するように見えます。情報は、i)細胞内病原体認識受容体およびii)適応免疫系16、18、19の細胞によるスクリーニングのために主要な組織適合性分子にロードされ得るアミノ酸の短い伸縮によって読み取ることができる病原体関連分子パターンとして抽出される。病原体が免疫細胞による情報処理のためにこの経路を覆すかどうかは、現時点では不明である。
免疫と恒常性の両方の維持および他のより一般的に研究されたエンドサイトーシスのモードとは対照的に、マクロピノサイトーシスのこれらの明確かつ重要な役割にもかかわらず、マクロピノソームの内部(発光)働きはほとんど知られていない。マクロピノソームの発光生化学を研究するための標準化されたプロトコルとツールを開発することは、私たちが彼らのユニークな生物学をよりよく理解するのに役立つだけでなく、薬物送達を含む新しい治療戦略に活用できる洞察を提供します20.この方法原稿は、マクロピノソームの発光生化学のさまざまな側面を単一のオルガネラレベルで解剖するための最近開発されたツールに焦点を当てます。
フルオロフォアは、オルガネラの特定の生化学生物を測定するために使用することができます(i)関心のある区画に優先的に分割し、および/またはii)関心のあるパラメータに応答してスペクトル変化を受ける。例えば、pHの場合、アクリジンオレンジ、クレシルバイオレット、およびリゾトラッカー色素などの蛍光弱塩基は酸性オルガネラに優先的に蓄積する。したがって、それらの相対強度は、標識されたオルガネラが酸性であることを大まかな示すものである。フルオレセイン、pHrodo、cypHer5eなどの他のpH応答性フルオロフォアは、陽子に結合するとスペクトル変化を起こします(図1A-C)。したがって、pH感受性蛍光性蛍光体の蛍光発光の変化は、pHの有用近似を提供することができる。しかし、単一の蛍光器を使用すると、多くの欠点があります。例えば、焦点面への変更、光漂白、および個々のオルガネラの体積の変化は、マクロピノソーム21において一般的に起こる、単一蛍光性の蛍光強度の変化を誘発し、これは容易に22のために修正することができない。したがって、単一波長評価は酸性コンパートメントの可視化には有用であるが、純粋に定性的である。
より定量的なアプローチは、対象のオルガネラへの参照フルオロフォアと共にパラメータ感受性フルオロフォアを標的にすることです。参照フルオロフォアは、オルガネラ内の生化学的変化に対して理想的に無神経である(図1D-F)、したがって、焦点面、オルガネラ体積、および、ある程度、光漂白23の変化を修正するために使用することができる。このアプローチを用いて、二重蛍光系蛍光率と称し、パラメータ感受性蛍光の蛍光発光率を参照蛍光に対して生成することにより補正を行うことができる。
ここで、このプロトコルは、マクロピノソーム内のpH、酸化イベント、およびタンパク質分解を測定するために、二重蛍光泳動比イメージングの原理を利用するであろう。いずれの場合も、対象のパラメータと参照フルオロフォアに敏感な蛍光色素が選択されます。特にマクロピノソームに対してフルオロフォアを標的とするために、それらは70kDaデキストランに共有結合され、マクロピノソーム24に優先的に組み込まれる。すべてのアッセイはRaw264.7細胞で行われますが、他の細胞タイプに適合させることができます。可能な限り、蛍光比は基準曲線に対して較正され、絶対値を得る。重要なことに、すべての測定は、マクロピノソームの光環境の動的および定量的評価のために、生細胞で行われます。
pH感受性蛍光ホルを選択する場合、いくつかの考慮事項を検討する必要があります。最初のpKは、プローブが最も敏感になるpH値の範囲を示すフルオロフォアのaです。形成直後にマクロピノソームのpHが細胞外培地(〜pH7.2)に近いものであり、後期のエンドーソームとリソソーム(〜pH5.0)との相互作用によって徐々に酸性化すると仮定した場合、その範囲内に感受性であるpKaを有するプローブ(図2C)を選択すべきである。6.4のpKaを有するフルオロフォアフルオレセインは、その範囲内で最適に敏感である。これは、ファゴソームなどの他の同様のオルガネラを測定するために広く使用されており、この原稿22,25において選択したフルオロフォアとなる。参考蛍光体として、テトラメチルローダアミンが使用され、pHに対して無感受性である(図1E)。pHrodoやcypHer5eなどの他のフルオロフォアは、フルオレセインのスペクトル特性が他の実験変数と一致するフルオレセインに代わりてもよい。pHrodo および cypHer5e に対して推奨される参考蛍光体のいくつかを図 1に示します。
第二の考察は、2つのフルオロフォアをマクロピノソームに特異的に標的とする方法である。約7nmの流体力学的半径を有するサイズ70kDaのデキストランは、細胞に非特異的に固執せず、マクロピノソームに組み込まれるが、クラトリンコーティングされたピットやカベオラには含まれないため、マクロピノソーム(図2Aおよび図3A、B)16、24、26を示す。このプロトコルでは、フルオレセイン標識70kDaデキストランおよびテトラメチルrhodamine(TMR)標識70 kDaデキストランがそれぞれpH感受性および基準プローブとして使用される。
自然免疫細胞において、マクロピノサイトーシスおよび貪食細胞症は、適応免疫応答27の細胞への処理とその後の提示のための外因性物質の内在化のための2つの主要な経路を表す。ファゴソームとマクロピノソームの内腔のレドックス化学の慎重かつ協調的な制御は、外因性物質の文脈特異的な処理にとって重要である。ファゴソームにおける酸化事象の最もよく研究された調節因子は、ファゴソーム28の内腔内で大量の活性酸素種(ROS)を産生する大型マルチサブユニット複合体であるNADPHオキシダーゼである。実際、その活性は、ファゴソーム29,30内で適切な抗原処理の中心である。しかし、マクロピノソーム膜に対するNADPHオキシダーゼの活性は検討されていない。
このプロトコルでは、H2DCFDAスクシニミジルエステルは、マクロピノソーム内の酸化事象を測定するために使用される。これは、フッ素(2',7'-ジクロロジヒドロフルオアセインジアセチン)の修飾された形態であり、減少した形態で最小限の蛍光である。酸化の際、その蛍光発光は著しく増加する。しかし、H2DCFDAの重要な注意点は注目に値する - それはフルオロフォアフルオレセインに基づいているので、その蛍光も酸性コンパートメントで消光され、実験28を設計する際にこの変数を制御するために注意する必要があります。pHを測定するアプローチと同様に、H2DCFDAスクシニミジルエステルは70kDaデキストランに共有結合され、TMR標識70kDaデキストランが参照フルオロフォアとして使用される(図3A)。
蛍光オバアルブミンは、マクロピノソーム内のタンパク質分解を測定するために使用されます。ここで使用されるオボアルブミンは、自己消光された4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a、4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY)FL染料で密にラベル付けされています。消化の際、強い蛍光色素標識ペプチドが遊離されます。オボアルブミンは70kDaデキストランに容易にコンジュゲートすることができないので、TMR標識70 kDaデキストランと流体相オブアルブミンを有する細胞は共インキュベートされる。TMR信号は、画像後分析中にマクロピノソームマスクを生成するために使用され、消化されたオボアルブミンから解放された信号はマスク内で測定される(図3B)。

<table><tbody><tr><td>黒壁96ウェルプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>6005430</td><td></td></tr><tr><td>CypHer5e, NHS ester</td><td>Cytiva</td><td>PA15401</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-amino 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1862</td><td></td></tr><tr><td>DQ-ovalbumin</td><td>Invitrogen</td><td>D12053</td><td></td></tr><tr><td>FITC-デキストラン 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14287</td><td></td></tr><tr><td>ニゲリシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>OxyBurst Green-SE</td><td>Invitrogen</td><td>D2935</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red, SE</td><td>Invitrogen</td><td>P36600</td><td></td></tr><tr><td>Raw264.7 細胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培地</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SP5 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-デキストラン 70 kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>u-Dish</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td></td></tr></tbody></table>

二重蛍光系比測定法を用いたマクロピノソームのph、レドックス化学、分解能の測定

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

近年、マクロピノサイトーシスの分野は急速に成長しています。マクロピノサイトーシスは、自然免疫細胞が生体恒常性および免疫を維持する中心的なメカニズムとして出現した。同時に、そのホメオスタティックな役割とは対照的に、癌およびウイルス感染を含む様々な病理を促進することもできる。他のエンドサイトーシスのモードとは異なり、マクロピノソームの成熟を研究するために開発されたツールは未発達のままです。ここでは、初期および成熟したマクロピノソームの内腔内の酸化還元環境を研究するための新しく開発されたツールについてプロトコルが説明されています。pHを評価する際に蛍光顕微鏡のレシオメトリックを用いる方法論、活性酸素種の産生、および生細胞における個々のマクロピノソームの内腔内の分解能が記載されている。単一のオルガネラの測定は、人口ベースのアプローチでしばしば失われる時空間的不均一性を明らかにする利点を提供する。プローブ選択、計測、キャリブレーション、単細胞と母集団ベースの方法を含む二重蛍光色素比顕微鏡の基本原理に重点が置かれています。

マクロピノソームpHを測定する場合、酸性化のダイナミクスを測定できない期間があります。この期間は、デキストラン荷重フェーズ(図2Cおよび図3C、Dの灰色のボックス)に対応し、使用するセルの種類によって異なります。ローディングフェーズの長さは、(i)細胞のマクロピノサイト活性と(ii)使用される器具の感度によって異なります。フルオレセインとTMRチャンネルの両方に対して4:1より大きい信号:ノイズ比が達成されるような、各実験の開始時にこの期間を調整することをお勧めします。未治療細胞では、マクロピノソームが酸性化するにつれてフルオレセインの放出が徐々に弱くなり、TMRシグナルは一定のままになるか、明るくなるはずです。マクロピノソームがサイズ16,21で縮小するとTMR信号が明るくなる可能性がある。これは、フルオレセイン信号がオルガネラサイズ<sup class="xref"...

生細胞の個々のマクロピノソームにおけるpH、酸化事象、タンパク質消化を測定するためのプロトコルについて述べています。二重蛍光系比測定顕微鏡と、人口ベースの技術よりも利点に重点が置かれています。

二重蛍光系比測定法を用いたマクロピノソームのpH、レドックス化学、分解能の測定

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

このプロトコルは、個々のマクロピノソームの内腔内の様々なプロセスと生化学的パラメータのリアルタイム評価を可能にする。これらの方法は、マクロピノサイトーシスの細胞生物学における創薬に使用することができる。このプロトコルは、細胞レベルとオルガネラレベルの両方で不均一性を明らかにする利点を提供する。アッセイシードRaw264.7細胞の1日前に、1ウェルあたり100マイクロリットルの細胞の力に対して、黒い側面を持つガラス底96ウェルプレートに5倍の10の密度で。アッセイの日に、ウェルが少なくとも70%コンフルエントであるかどうかを確認します。その後、37°Cで予熱HBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。次に、70キロダルトンデキストランと0.025ミリグラムのフルオレセインを各ウェルに70キロダルトンデキストランとラベル付けした1ミリリットル当たり0.025ミリグラムを含むHBSSの100マイクロリットルを加え、15分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。インキュベートが完了したら、インキュベーターからプレートを取り出し、HBSSを100マイクロリットルで細胞を6回洗浄します。最後の洗浄の後、細胞に100マイクロリットルの前温めのHBSSを加え、加熱されたステージとチャンバーを持つ顕微鏡にプレートを置きます。必要に応じてTMRとフルオレセインの励起および発光パラメータを調整した後、各ウェル間の2つのフルオロフォアの間で交互に各ウェルから画像を取得します。最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けているかどうかを確認し、所望の時間の1〜15分間隔で各ウェルの画像を取得します。画像取得中に、必要に応じて10モル塩酸、または10モル水酸化カリウムを使用して、25ミリモルHEPESで緩衝されたカリウムリッチ溶液の50ミリリットルのアリコートのpHを7.5に調整します。次に、25ミリモルMESで緩衝されたカリウムリッチ溶液の350ミリリットルのアリコートのpHをpH 6.5、pH 5.5およびpH 5.0に調整します。画像の取得が完了したら、細胞を含む96ウェルプレートからHBSSを取り出し、カリウムリッチ溶液をpH 7.5に添加します。その後、1 ミリリットルあたり 10 マイクログラムの最終濃度でニジェリシンを追加します。.プレートを顕微鏡に戻し、前に示したように取得設定を使用して各ウェルの画像を取得します。マクロピノソーム内の酸化事象を測定するには、前述のように、アッセイの前日に96ウェルプレートにRAW264.7細胞をシードします。その後、アッセイの日に37°Cに予熱したHBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。次に、70キロダルトンデキストランと0.025ミリグラムのTMR 1ミリリットルを含むHBSSの100マイクロリットルを加え、各ウェルに70キロダルトンデキストランとラベル付けされたH2DCFDAのミリリットル当たり0.025ミリグラムを加え、37°Cで細胞を15分間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出した後、HBSSの100マイクロリットルで細胞を6回洗浄する。最後の洗浄後、HBSSを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、顕微鏡にプレートを置きます。必要に応じてTMRおよびH2DCFDAの励起および放出パラメータを調整した後、前に示したように、各ウェルの画像を1〜15分間隔で取得します。マクロピノソーム内のタンパク質消化を測定するために、前述のように、アッセイの前日にRAW264.7細胞をシードします。その後、アッセイの日に37°Cで予熱したHBSSの100マイクロリットルですべての井戸を洗います。次に、100マイクロリットルのHBSSを追加し、TMRのミリリットル当たり0.025ミリグラムを含み、各ウェルに1ミリリットルのBODIPYラベル付きオアルブミンあたり0.2ミリグラムで70キロダルトンデキストランとラベル付けしました。その後、15分間摂氏37度でプレートをインキュベートします。インキュベーターから細胞を取り出した後、HBSSの100マイクロリットルでそれらを6回洗浄します。最後の洗浄の後、各ウェルにHBSSの100マイクロリットルを追加し、顕微鏡の上にプレートを置きます。必要に応じてTMRとBODIPYの励起および放出パラメータを調整した後、前に示したように、各ウェルの画像を1〜15分間隔で取得します。マクロピノソームにおけるpH、酸化事象またはタンパク質分解を測定する場合、使用する細胞の種類によって変化するデキストランローディング相に対応する一定期間の酸性化のダイナミクスを測定することはできません。マクロピノソームpHを測定する場合、フルオレセイン対TMR比は徐々に小さくなり、取得後15分以内に高原化します。この高原は約5のpHに相当し、これはリソソームのpHとほぼ一致する。各集録の終了時に、In situキャリブレーションが実行されます。蛍光透光度は、pH 7.5のキャリブレーションバッファ内で最大であり、キャリブレーションバッファがより酸性になるにつれて徐々に小さくなるはずです。これにより、キャリブレーションカーブの生成が可能になります。マクロピノソーム内の酸化事象を測定する場合、H2DCFDAとTMRの比率は徐々に大きくなり、活性化されたRAW264.7細胞では最初の20〜30分以内に高原になる可能性が高くなります。マクロピノソームタンパク質消化を測定する場合、徐々に強いフルオレセインシグナルは、オボアルブミンが消化されると解放されます。RAW264.7細胞において、消化されたBODIPY標識されたオボアルブミンから遊離した蛍光の増加は、最初の30分以内に高原化する。恒常性におけるこの新たな役割を持ち、癌病理との関連性が新たに発見されたことで、現在、ルネサンスのマクロピノサイトーシス研究が進行中である。これらの研究分野に対するマクロピノサイトーシスの寄与を探るためのツールボックスに提供されるこれらの方法。

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Research

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