Name: マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶマイクロ電極アレイ記録法を用いたマウス中房ノードの発火率測定技術。心内ペース作りの欠損を同定し、薬理学的影響を評価するための信頼性の高い方法です。

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この研究は、国立衛生研究所、助成金番号R01NS100954とR01NS099188によって資金提供されました。

著者らは開示するものは何もない。

SAN解剖プロセスの練習と習得は、組織が壊れやすく、健全な組織が正常な記録のために必要であるため、不可欠です。SAN解剖の間、組織の適切な領域を得るために正しい方向が不可欠である。しかし、心臓の本来の向きは解剖プロセス中に容易に失われ、この努力を複雑にする。したがって、適切な左右方向を確保するために、アトリアを視覚的に検査する必要があります。典型的には、右心房はより透明になる傾向があるが、一方、左心房は通常、色25、48においてより暗く、より赤である。さらに、SAN組織は、それを用いて作業したり、電極グリッドに取り付けたりしながら、組織が機械的に損傷しやすい51を持ち込むので、伸ばさないのが重要である。健康で適切に解剖されたSAN組織を確認するためのヒントは、顕微鏡下の完全なタイローデの溶液でそれを調べ、組織が鼓動していることを確認することです。技術が習得されると、組織製剤の少なくとも90%が記録に適しているはずです。
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心臓は、脳に由来するもののような心臓固有および外因性の両方の影響によって支配される複雑な器官である。この正気ノード(SAN)は、哺乳類の心拍の開始および永続化を担うペースメーカー細胞(シナウ細胞、またはSA細胞とも呼ばれる)を収容する心臓の定義領域である。固有の心拍数は、他の心臓や神経体液の影響を受けずにペースメーカー細胞によって駆動される速度ですが、心電図などの人間と生きている動物の心拍数の伝統的な尺度は、ペースメーカーと神経の両方の心臓への影響を反映しています。SA細胞に対する最も顕著な神経影響は自律神経系からであり、それは常に身体の生理学的要件を満たすために発火パターンを調節する3.この考えを支持して、交感神経と副交感神経の両方の投影は、SAN4の近くで見つけることができます。心内神経系(ICNS)は、神経節化された神経神経の影響、特に右心房、インナーベート、SAN5、6の活性を調節するもう一つの重要な神経影響である。
機能不全は多くの心臓疾患の根源となり、他の合併症のリスクに寄与する可能性があるため、ペースメイキングの赤字を理解することは臨床的に重要です。病気の正座症候群(SSS)は、適切なペースメイキング7、8を妨げる正属ノードの機能不全を特徴とする疾患のカテゴリーである。SSSは、正気性徐脈、正弦波休止、正弦波停止、正気出口ブロック、および交互のブラダリトミアおよび頻脈性不整脈9を呈し、塞栓症および突然死のリスクの増加を含む合併症を引き起こす可能性がある8,10。ブルガダ症候群を有する者は、突然の心臓死のリスクが高い心室細動によって特徴付けられた心疾患であり、併存SAN機能不全11、12を有する場合、不整脈性事象のリスクが高い。中房機能不全はまた、心臓を超えて生理学的な結果をもたらす可能性があります。例えば、SSSは、脳低灌流13による患者の発作を引き起こすことが観察されている。
心房ペース作りの欠損を特定するには、自律神経系や体液性因子の影響を受けずにSANの活動を測定することによって、本質的な心拍数を決定する必要があります。臨床的には、これは薬理学的自律神経遮断14によって近似することができるが、この同じ技術は、哺乳類モデルにおいても、固有の心機能15、16を研究するために適用することができる。このアプローチは、寄与する神経影響の大部分をブロックし、生体内心臓検査を可能にするが、それは完全に心臓に対するすべての外因性の影響を排除しない。動物モデルにおける固有の心臓機能を研究するために使用される別の研究技術は、ランゲンドルフ透過心臓を用いた孤立した心臓記録であり、これは典型的には、エレクトログラム、ペーシング、または外膜多電極アレイ17、18、19、20を用いた測定を含む。この技術は、心筋から心臓を除去することを含むので心機能に特異的であるが、測定値は依然として、本質的な心拍数測定21に影響を与える可能性のあるメカノ電気自動調節機構の影響を受ける可能性がある。孤立した心臓の記録は、ICNS5、6、22、23を通じた自律的な規制の影響を受ける可能性もあります。さらに、心機能測定に重要な心臓の生理学的に関連する温度を維持することは、単離された心臓アプローチ20において困難であり得る。SAN機能を研究する直接的な方法は、SAN組織を特異的に隔離し、その活性を測定することです。これは、SANストリップ(孤立したSAN組織)または孤立したSANペースメーカーセル24、25を介して達成できます。SANは非常に小さく高度に定義された領域であるため、どちらも高度な技術トレーニングが必要であり、解離が正しく実行されない場合、細胞の全体的な健康状態に損傷を与える可能性があるため、細胞分離はさらに大きな課題となります。さらに、これらの技術は、個々の記録マイクロ電極を使用して組織または細胞から正常に記録するために、専門的な電気生理学的スキルを必要とします。
本プロトコルでは、マイクロ電極アレイ(MEA)を用いて固有の心拍数測定を得ることによって、SAN in vitroを記録する技術について述べています。このアプローチは、集中的な電気生理学的スキルセットを欠いている研究者が非常に特異的な電気生理学的記録を利用できるようにするという利点を有する。MEAは、原発性心筋細胞培養26、27、28、29、30、31、32、心臓シート33、34、35、36、37、38、39、および組織全体マウント40、および組織全体のマウントで心筋細胞機能を研究するために以前に使用されています。 41,42,43,44,45,46,47.SAN組織41,42の分野ポテンシャルを調べる前の作業も行われてきました。ここでは、MEAを使用してマウス固有SAN発火率を記録および分析する方法を提供します。また、この技術を用いて、電圧ゲートK+チャネルブロッカーである4-アミノピリジン(4-AP)の効果を示すサンプル実験を提供することにより、SAN固有の発火率に対する薬物の薬理学的効果をテストする方法についても説明します。定義された解剖学的ランドマークを使用して、我々は他の方法で必要とされる広範な組織解剖または細胞分離を行うことなく正確にSANを記録することができる。MEAはコストが非常に高い場合がありますが、記録は、臨床および生理学的研究アプリケーションの広大な配列で使用することができるペースメイキングの非常に具体的で信頼性の高い尺度を提供します。

<table><tbody><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>シグマ</td><td>A78403-25G</td><td></td></tr><tr><td>22ゲージ シリンジ 針</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-826-5A</td><td>解剖に使用</td></tr><tr><td>23ゲージ シリンジ針</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-826-6C</td><td>解剖に使用</td></tr><tr><td>60mm シャーレ ジェネ</td><td>シー・サイエンティフィック</td><td>32-105G</td><td></td></tr><tr><td>500mL パイレックス・ボトル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>06-414-1C</td><td>溶液の保存に使用</td></tr><tr><td>1000mL パイレックスボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-414-1D</td><td>溶液の保存に使用</td></tr><tr><td>骨鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>16060-11</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>カルボゲン (95% O2、5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo はさみ、4 インチ</td> <td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>データ収集 PC</td><td></td><td></td><td>CPU:Intel XeonまたはIntel Core i7、メモリ:8GB、HDD:1TB、グラフィックカード:NVIDIAまたはオンボード、画面:1920x1080</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Jenco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#2椎弓切除鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#55 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;エクストラファイングレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>ガラスチャンバー</td><td>グレイン</td><td>ジャー49WF30</td><td>マウス安楽死に使用</td></tr>ハー<tr><td>プアンカーキット</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>&nbsp;SHD-22CL/15 WI 64-0247</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>フィッシャー ケミカルズ</td><td>SA48-4</td><td>pH バランス調整に使用</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram</td><td>NDC 63739-953-25</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>ラボテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-950</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡用ライト</td>ドー<td>ランジェンナー</td><td>MI150DG 660000391014</td><td></td></tr><tr><td>塩化マゲシウム(MgCl<サブ>2</サブ>)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>MED64ヘッドアンプ</td><td>MED64</td><td>MED-A64HE1S</td><td></td></tr><tr><td>MED64 メインアンプ</td><td>MED64</td><td>MED-A64MD1A</td><td></td></tr><tr><td>MED64 灌流キャップ</td><td>MED64</td><td>MED-KCAP01</td><td></td></tr><tr><td>MED64 灌流パイプホルダーキット</td><td>MED64</td><td>MED-KPK02</td><td></td></tr><tr><td>MED64 ThermoConnector</td><td>MED64</td><td>MED-CP04</td><td></td></tr><tr><td>メッシュ</td><td>&nbsp;ワーナーインスツルメンツ</td><td>640246</td><td></td></tr><tr><td>微小電極アレイ(MEA)</td><td>Alpha Med Scientific</td><td>MED-R515A</td><td></td></tr><tr><td>メビウスソフトウェア</td><td>WitWerx Inc.</td><td></td><td>MED64</td></tr><tr><td>NaOH</td>のための特定のソフトウェア <td>フィッシャーの化学薬品</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>正常な生理食塩水</td><td>のUltigiene</td><td>NDC 50989-885-17</td><td></td></tr><tr><td>のペンキのブラシ</td><td>フィッシャーの科学</td><td>的なNC1751733</td><td></td></tr><tr><td>のパラフィルム</td><td>ジェネシー科学</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td>F155009</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-171-298</td><td>1/8 ''内径ポリエチレン</td></tr><tr><td>イ</td><td>ミンシグマ</td><td>P3143</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム(KCl)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ>)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P5655-500G</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム重炭酸塩</td><td>シグマ</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>シルグルアードエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td>184 SILエラストキット0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウムモノベーシック</td><td>シグマ</td><td>S6566</td><td></td></tr>四<tr><td>ホウ酸ナトリウム</td>シ<td>グマ</td><td>S9640</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14074-09</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット(3mL目盛り付き)</td><td>Samco Scientific</td><td>225</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

右心房に位置する心房ノード(SAN)は、心臓のペースメーカー細胞を含み、この領域の機能不全は頻脈または徐脈を引き起こす可能性がある。心臓ペースメイキング欠陥の確実な同定は、主に率の欠陥を隠すことができる自律神経系の影響を防ぐことによって、本質的な心拍数の測定を必要とする。心臓ペースメーカーの固有の機能を分析する従来の方法には、 インビボ 心拍数を測定するための薬物誘発自律神経遮断、内因性心拍数を測定するための孤立した心臓記録、およびシナウアーストリップまたは単細胞パッチクランプ記録が含まれ、自発的作用電位発射率を測定する。しかし、これらの従来の手法は、技術的に困難で実行が困難な場合があります。ここでは、マウスからの全実装サイノアオアノード製剤の微小電極アレイ(MEA)記録を行うことにより、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を提示する。MEAは、 体外 細胞外電位を記録するためのグリッド状のパターンに配置された複数の微小電極で構成されています。本明細書に記載されている方法は、本質的な心拍数を記録するための以前のアプローチよりも比較的速く、より簡単で、より正確であるという組み合わせの利点を有する一方で、容易な薬理学的尋問を可能にする。

15分間皿の中で組織を順応させ、10の1分間の痕跡を記録する。現在のプロトコルは1時間以上の活動を記録していますが、ここには示されていない未公開データに≥4 hの安定した発射パターンを記録しています。実験準備がデータ収集に適している場合、各記録チャンネルは、所定のチャンネルに対して一定の均一な形状の一定の間隔の繰り返し波形(すなわちスパイク)を示すべきである(図11D)。これらの波形は、心臓のペース作りの活動を反映する個々の心臓の拍動に対応します。インタースパイク間隔は、脱分極の開始部位に対する位置の小さな違いのためにチャネル間で完全に整列していない場合でも、すべてのチャネルで同じである必要があります(図8)。所定のチャネルの波形の形状は一貫している必要がありますが、波形の形状は、組織内の電極の位置によってチャネルによって異なります(図8)。電極との組織の接触の程度はまた、振幅などの波形特性に影響を与える可能性がある。しかし、準備が満足のいく場合は、振幅の最大...

このプロトコルは、マウスのペースメイキング欠陥を同定するために、サイノアノード組織全体のマイクロ電極アレイ記録を用いて、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を記述することを目的とする。薬理学的薬剤は、本質的なペースメイキングに及ぼす影響を研究するために、この方法で導入することもできる。

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...

固有の心拍数を測定することは、心臓の健康の重要な指標です。この技術は、この速度を正確に測定しながら、地球間ノードに対する交わりの影響の大部分を除外します。固有の心拍数のMEA記録は、広範な電気生理学の訓練なしで単一細胞の記録と同様の正確な発火率データをキャプチャする。この技術を使用する個人は、初期の実験で健康な組織製剤を得るのに苦労するかもしれないので、実際のデータ収集を開始する前に、解剖を練習し、バッファとデータ収集設定を最適化してください。この手順を実証するには、私の研究室の博士研究員であるドクターズ・マン・シとプラヴィーン・クマールです。安楽死させたマウスの皮膚を止めで保持することから始め、外科的はさみを使用して、左の肋骨アーチから右の肋骨アーチまで胸部の底のすぐ下の皮膚に横断切開を行う。手術用ハサミを使用して腹膜を切り開き、過度の出血を防ぐために肝臓をニッキングすることなく、慎重に横隔膜から肝臓を分離します。胸郭に沿って横隔膜を切開して胸腔を露出する。外科用ハサミを使用して、肋骨アーチの端から鎖骨までの胸郭の側面を切断して心臓を露出させ、23ゲージの注射針を使用して胸部を肩に固定します。転送ピペットを使用して、暖かいヘパリン化された完全なタイロードの溶液を心臓に落とし、しっとりと保ちます。余分な細かいグレイフ鉗子で肺を保持し、肺を取り除くために外科的なはさみで気管を切断します。心臓を取り除くには、余分な細かいグレイフ鉗子で心臓の頂点を保持し、手術用ハサミで大間と下の大静脈を切断します。硬化したシリコーンエラストマーを含むペトリ皿に心臓を移し、温かいヘパリン化された完全なタイロードの溶液の2〜3ミリリットルで心臓を入浴させるために移入ピペットを使用する。解剖ピンで皿に心臓の頂点を取り付けます。デュモン2ラミネクトミー鉗子で下の大静脈を保持します。22ゲージの注射針を下および上の静脈に挿入して右心房の位置を見つけ、サイノアノードのおおよその位置を特定します。デュモン2ラミネクトミー鉗子で右心房付属器を保持し、適切な心房付属器を通して解剖ピンを置いて所定の位置に保持します。左心房の付属物についても同じ手順を繰り返し、静脈に及ぶ注射針を取り除きます。カストロビエホはさみを使用して、心室を横切って心臓から血液を放出する横断切開を行い、温かいヘパリン化された完全なタイローデの溶液を加えて心臓を洗うことによって心臓の頂点を取り除きます。カストロビエホはさみを使用して、心房が心室から分離されるまで房室中隔に沿って切断し、切開を心室に近づけます。動脈間中隔に沿って切って左心房を取り除く。右心房の周囲に解剖ピンを置き、平らにします。カストロビエホはさみを使用して心房から残っている脂肪、血管、または組織を取り除き、右心房の中房ノードを見つけます。タイロードのソリューションを入力ソリューションモデルに追加し、カルボゲンガスの流れをオンにしてTyrodeのソリューションを酸素化します。蠕動ポンプを25 RPMに設定し、毎分2ミリリットルの流量を与えます。ポンプを起動した後、バッファがシステムから漏れていないことを確認し、温度コントローラを摂氏37度に設定します。Dumont 55鉗子を使用して、解剖されたペトリ皿から微小電極アレイグリッドに解剖組織を移します。柔らかいペイントブラシで組織をそっと配置して、電極グリッドの線膜ノード領域をオーバーレイします。次に、骨鉗子または湾曲した鉗子を使用してティッシュの上に網を置く。ボーン 鉗子を使用して、ハープ アンカーをメッシュ上に配置して、すべてを所定の位置に保持します。コネクタプレートにマイクロ電極アレイ皿を並べます。ハープスライスアンカーを邪魔することなく、慎重にマイクロ電極アレイ皿に灌流キャップを置き、テープで灌流ギャップを確保します。アンプの電源を入れ、ソフトウェアでの録音のワークフローを設定します。beat_recordingを選択します。moflo テンプレート。それを開き、トレースの数、トレース期間、トレース間隔、入力電圧、サンプリングレート、および他の記録パラメータを、目的の記録条件に従って設定します。記録と再生ボタンをクリックして記録を開始し、トレース間の間隔を 2 分で 1 分間の 10 トレースのデータを取得します。ポンプを一時停止し、ポンプの流入チューブを通常の記録溶液から、目的の薬剤を含むTyrodeの溶液に切り替えます。ポンプを再起動し、録音を再開します。薬物注入タイロードの溶液が組織に達したら、ベースライン記録のために以前に行われたのと同じ方法で10の痕跡を記録する。微小電極アレイ上の組織の位置を最後に撮影します。保存された記録データファイルを解析ソフトウェアのビート周波数解析テンプレートで開きます。再生をクリックし、データの視覚化のために全体の記録を実行し、適切な分析パラメーターを割り当てます。解析に含めるチャンネルを選択し、自動波形のピーク識別に必要な振幅最大または振幅の最小値のしきい値を設定します。もう一度再生アイコンをクリックしてデータセットを再実行し、分析パラメータがスパイク抽出に適していることを確認します。分析のために、実験のベースライン期間中にほとんどのチャネルで各トレースの安定した拍動率を示す3つの最も安定した連続したトレースを特定し、薬物暴露期間中に別の3つの連続した安定したトレースを同定する。再生アイコンと記録アイコンをクリックして、分析を開始します。データは、シナ房ノードビート周波数測定のために45日齢の雄の野生型黒いスイスマウスから収集されました。異なる形状と振幅を持つ波形は異なるチャネルで観測され、すべてのチャンネルは同一のインタースパイク間隔と発射周波数を示した。しかし、電極との組織接触の程度は、振幅などの波形特性にも影響を与える可能性がある。記録された10のトレースから、安定したビート周波数とインタースパイク間隔を持つ3つの連続したチャンネルが、さらなる分析のために選択されました。抽出されたスパイクパターンが悪い場合は存在しないはずですが、存在する場合はノイズまたは不安定の影響を受けます。個々の心拍に対応する波形は、固有の心臓ペースメイキング活性を反映する。マイクロ電極アレイシステムは薬理効果を分析するために薬剤の容易な適用を可能にする。64チャンネルの3つのトレースの固有の発射率は、サンプリングデータで毎分約320拍であることが判明しました。4-アミノピリミジンの導入は、予想通りにスパイク間間隔を増加させ、1分間に320から210ビートのビート周波数を減少させた。分析のために信頼性の高いデータを収集するには、トレースが安定しており、標準基準を満たしていることを確認することによって、記録中に組織が健全であることを確認することが重要です。MEAは、心臓の他の領域における心臓活動を記録するために使用することができ、遺伝的および薬理学的操作の効果を研究するのに適した詳細な領域特異的特徴付けが可能である。

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マウスモデルからの洞房結節分離:マウス心臓からSA結節を採取する手順

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学ぶマイクロ電極アレイ記録法を用いたマウス中房ノードの発火率測定技術。心内ペース作りの欠損を同定し、薬理学的影響を評価するための信頼性の高い方法です。

マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録

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