マウスにおける心内ペース作りの欠損を同定するための、中房ノードの発火率のマイクロ電極アレイ記録
2021年7月5日
このプロトコルは、マウスのペースメイキング欠陥を同定するために、サイノアノード組織全体のマイクロ電極アレイ記録を用いて、固有の心焼成率を測定する新しい方法論を記述することを目的とする。薬理学的薬剤は、本質的なペースメイキングに及ぼす影響を研究するために、この方法で導入することもできる。
固有の心拍数を測定することは、心臓の健康の重要な指標です。この技術は、この速度を正確に測定しながら、地球間ノードに対する交わりの影響の大部分を除外します。固有の心拍数のMEA記録は、広範な電気生理学の訓練なしで単一細胞の記録と同様の正確な発火率データをキャプチャする。
この技術を使用する個人は、初期の実験で健康な組織製剤を得るのに苦労するかもしれないので、実際のデータ収集を開始する前に、解剖を練習し、バッファとデータ収集設定を最適化してください。この手順を実証するには、私の研究室の博士研究員であるドクターズ・マン・シとプラヴィーン・クマールです。安楽死させたマウスの皮膚を止めで保持することから始め、外科的はさみを使用して、左の肋骨アーチから右の肋骨アーチまで胸部の底のすぐ下の皮膚に横断切開を行う。
手術用ハサミを使用して腹膜を切り開き、過度の出血を防ぐために肝臓をニッキングすることなく、慎重に横隔膜から肝臓を分離します。胸郭に沿って横隔膜を切開して胸腔を露出する。外科用ハサミを使用して、肋骨アーチの端から鎖骨までの胸郭の側面を切断して心臓を露出させ、23ゲージの注射針を使用して胸部を肩に固定します。
転送ピペットを使用して、暖かいヘパリン化された完全なタイロードの溶液を心臓に落とし、しっとりと保ちます。余分な細かいグレイフ鉗子で肺を保持し、肺を取り除くために外科的なはさみで気管を切断します。心臓を取り除くには、余分な細かいグレイフ鉗子で心臓の頂点を保持し、手術用ハサミで大間と下の大静脈を切断します。
硬化したシリコーンエラストマーを含むペトリ皿に心臓を移し、温かいヘパリン化された完全なタイロードの溶液の2〜3ミリリットルで心臓を入浴させるために移入ピペットを使用する。解剖ピンで皿に心臓の頂点を取り付けます。デュモン2ラミネクトミー鉗子で下の大静脈を保持します。
22ゲージの注射針を下および上の静脈に挿入して右心房の位置を見つけ、サイノアノードのおおよその位置を特定します。デュモン2ラミネクトミー鉗子で右心房付属器を保持し、適切な心房付属器を通して解剖ピンを置いて所定の位置に保持します。左心房の付属物についても同じ手順を繰り返し、静脈に及ぶ注射針を取り除きます。
カストロビエホはさみを使用して、心室を横切って心臓から血液を放出する横断切開を行い、温かいヘパリン化された完全なタイローデの溶液を加えて心臓を洗うことによって心臓の頂点を取り除きます。カストロビエホはさみを使用して、心房が心室から分離されるまで房室中隔に沿って切断し、切開を心室に近づけます。動脈間中隔に沿って切って左心房を取り除く。
右心房の周囲に解剖ピンを置き、平らにします。カストロビエホはさみを使用して心房から残っている脂肪、血管、または組織を取り除き、右心房の中房ノードを見つけます。タイロードのソリューションを入力ソリューションモデルに追加し、カルボゲンガスの流れをオンにしてTyrodeのソリューションを酸素化します。
蠕動ポンプを25 RPMに設定し、毎分2ミリリットルの流量を与えます。ポンプを起動した後、バッファがシステムから漏れていないことを確認し、温度コントローラを摂氏37度に設定します。Dumont 55鉗子を使用して、解剖されたペトリ皿から微小電極アレイグリッドに解剖組織を移します。
柔らかいペイントブラシで組織をそっと配置して、電極グリッドの線膜ノード領域をオーバーレイします。次に、骨鉗子または湾曲した鉗子を使用してティッシュの上に網を置く。ボーン 鉗子を使用して、ハープ アンカーをメッシュ上に配置して、すべてを所定の位置に保持します。
コネクタプレートにマイクロ電極アレイ皿を並べます。ハープスライスアンカーを邪魔することなく、慎重にマイクロ電極アレイ皿に灌流キャップを置き、テープで灌流ギャップを確保します。アンプの電源を入れ、ソフトウェアでの録音のワークフローを設定します。
beat_recordingを選択します。moflo テンプレート。それを開き、トレースの数、トレース期間、トレース間隔、入力電圧、サンプリングレート、および他の記録パラメータを、目的の記録条件に従って設定します。
記録と再生ボタンをクリックして記録を開始し、トレース間の間隔を 2 分で 1 分間の 10 トレースのデータを取得します。ポンプを一時停止し、ポンプの流入チューブを通常の記録溶液から、目的の薬剤を含むTyrodeの溶液に切り替えます。ポンプを再起動し、録音を再開します。
薬物注入タイロードの溶液が組織に達したら、ベースライン記録のために以前に行われたのと同じ方法で10の痕跡を記録する。微小電極アレイ上の組織の位置を最後に撮影します。保存された記録データファイルを解析ソフトウェアのビート周波数解析テンプレートで開きます。
再生をクリックし、データの視覚化のために全体の記録を実行し、適切な分析パラメーターを割り当てます。解析に含めるチャンネルを選択し、自動波形のピーク識別に必要な振幅最大または振幅の最小値のしきい値を設定します。もう一度再生アイコンをクリックしてデータセットを再実行し、分析パラメータがスパイク抽出に適していることを確認します。
分析のために、実験のベースライン期間中にほとんどのチャネルで各トレースの安定した拍動率を示す3つの最も安定した連続したトレースを特定し、薬物暴露期間中に別の3つの連続した安定したトレースを同定する。再生アイコンと記録アイコンをクリックして、分析を開始します。データは、シナ房ノードビート周波数測定のために45日齢の雄の野生型黒いスイスマウスから収集されました。
異なる形状と振幅を持つ波形は異なるチャネルで観測され、すべてのチャンネルは同一のインタースパイク間隔と発射周波数を示した。しかし、電極との組織接触の程度は、振幅などの波形特性にも影響を与える可能性がある。記録された10のトレースから、安定したビート周波数とインタースパイク間隔を持つ3つの連続したチャンネルが、さらなる分析のために選択されました。
抽出されたスパイクパターンが悪い場合は存在しないはずですが、存在する場合はノイズまたは不安定の影響を受けます。個々の心拍に対応する波形は、固有の心臓ペースメイキング活性を反映する。マイクロ電極アレイシステムは薬理効果を分析するために薬剤の容易な適用を可能にする。
64チャンネルの3つのトレースの固有の発射率は、サンプリングデータで毎分約320拍であることが判明しました。4-アミノピリミジンの導入は、予想通りにスパイク間間隔を増加させ、1分間に320から210ビートのビート周波数を減少させた。分析のために信頼性の高いデータを収集するには、トレースが安定しており、標準基準を満たしていることを確認することによって、記録中に組織が健全であることを確認することが重要です。
MEAは、心臓の他の領域における心臓活動を記録するために使用することができ、遺伝的および薬理学的操作の効果を研究するのに適した詳細な領域特異的特徴付けが可能である。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、マウスの洞房結節組織のマイクロエレクトロードアレイ記録を用いて固有の心臓発火率を測定する手法を説明しています。この技術により、ペースメーカー欠陥の特定と、その効果を研究するための薬理学的薬剤の導入が可能になります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 心臓電気生理学
- マイクロエレクトロードアレイ技術
- 薬理学的分析
背景
- 固有心拍数は心臓の健康の重要な指標です。
- 発火率の正確な測定は洞房結節機能の理解に不可欠です。
- 従来の方法は広範な電気生理学トレーニングを必要とする場合があります。
- 信頼性の高いデータ収集には健康な組織の準備が不可欠です。
研究の目的
- 固有の心臓発火率を測定するための信頼性の高い方法を開発すること。
- マウスモデルにおけるペースメーカー欠陥を特定すること。
- 薬理学的薬剤が固有のペースメーカーに与える影響を評価すること。
使用した方法
- 洞房結節組織のマイクロエレクトロードアレイ記録。
- 組織サンプルを取得するための安楽死したマウスの解剖。
- バッファとデータ収集設定の最適化。
- 組織準備のための外科技術トレーニング。
主な結果
- この技術は単一細胞記録に匹敵する正確な発火率データを提供します。
- 初期の実験では健康な組織の準備を得るために練習が必要になる場合があります。
- 薬理学的薬剤を効果的に導入してその影響を研究できます。
- 経験豊富な研究者が手順を示すことで信頼性が向上します。
結論
- この方法論は心臓ペースメイキングを研究するための堅牢なアプローチを提供します。
- これは固有の心臓メカニズムと薬理学的効果の探索を促進します。
- 将来の研究は、この技術を基に心臓の健康をさらに調査することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of intrinsic cardiac firing rate is essential for identifying pacemaking defects and de-risking cardiovascular target validation. This microelectrode array method enables reliable, high-throughput assessment of sinoatrial node function in murine models, supporting mechanistic insight into autonomic-independent heart rate regulation. The approach bridges discovery electrophysiology with pharmacological screening, enhancing predictive confidence in early-stage cardiac safety and efficacy evaluations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cardiac pacemaker function by isolating intrinsic firing rate from autonomic influences.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for validating genetic or pharmacological modulation of sinoatrial node activity.
- Strategic Value: Supports target confidence by confirming on-target effects of compounds modulating heart rate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, channel-resolved extracellular field potential data for beat frequency and interspike interval analysis.
- Operational Value: Allows simultaneous recording from 64 electrodes, increasing throughput and data robustness compared to single-cell methods.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization for cardiovascular liability screening and lead optimization.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables region-specific characterization of cardiac electrophysiology in whole-mount sinoatrial node preparations.
- Operational Value: Supports dose-response testing of pharmacological agents such as 4-aminopyrimidine to assess chronotropic effects.
- Strategic Value: Improves translational continuity by providing preclinical data directly comparable to clinical heart rate endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, from early target validation through lead identification to preclinical safety assessment, by providing a scalable readout of pacemaker cell function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ion channel or gene contributions to automaticity by measuring spontaneous firing rates.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (beats per minute, interspike interval) suitable for compound effect profiling.
- Analytics: Enables automated spike extraction and frequency analysis across multiple channels for consistent, objective quantification.
- Translational Research: Connects murine sinoatrial node function to human cardiac safety biomarkers through conserved pacemaker mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for chronic disease model testing and repeat pharmacology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in heart rate regulation by providing direct, autonomic-independent pacemaker readouts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through stable tissue preparation and consistent MEA-based signal acquisition.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by minimizing reliance on low-throughput, technically demanding patch-clamp or isolated heart methods.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cardiovascular targets based on validated effects on intrinsic pacemaker function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine cardiac dissection and tissue handling to ensure viable sinoatrial node preparations.
- Dependent on microelectrode array instrumentation, perfusion systems, and electrophysiology amplifiers for extracellular recording.
- Necessitates standardization of buffer composition, temperature (37°C), and flow rate (2 mL/min) across laboratories for data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to disease models with structural or fibrotic atrial remodeling.
- Limited by tissue viability duration, necessitating timely experimentation post-dissection to maintain stable baseline recordings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:58
Dissecting the Sinoatrial Node
3:50
Microelectrode Array System Preparation for Recording
4:18
Heart Tissue Placement on Microelectrode Array Grid
5:03
Data Acquisition
6:10
Analysis of Microelectrode Array Recordings for Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
7:13
Results: The Sinoatrial Node Beat Frequency Measurement
8:41
Conclusion
