Name: メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子F420 の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: 学ぶ、補因子F420の抽出と液体クロマトグラフィーによるポリグルタミン酸尾長分析の最適化手法。メタノゲン純粋培養物と環境試料からの代謝研究に応用可能です。

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コリン・ジャクソン教授の精製補因子F420のサポートに感謝します。この研究は、チロル科学基金(TWF)とインスブルック大学(プブリケーションズフォンズ)によって支援されました。我々は、GPS、HK、SB、GG、およびHBのサポートを大いに認識しています。

注: 補因子F420 の抽出と分析は、サンプルの溶菌、固相抽出(SPE)による補因子予精製、蛍光検出によるイオンペアRP-HPLC(IP-RP-HPLC)による補因子検出を含む3段階のプロセスです。開始する前に、 表1に記載されている材料および試薬を準備します。
1. サンプルのリシス
<ol><li>適切なチューブ(例えば、50 mL円錐管)にサンプルの5 gまで追加します。</li>
	<li>溶解バッファーの 5 mL (2x ストック溶液、 表 1) をサンプルに加えます。</li>
	<li>蒸留水で最終体積10mLに持ち込み、最終濃度0.5g・mL-1に到達します。</li>
	<li>20 sの希釈サンプルを渦液。</li>
	<li>121 °Cで30分間オートクレーブ。</li>
	<li>森林土壌のような乾燥サンプルの場合は、オートクレーブ後に蒸留水で20mLの最終体積を持ち、希釈されたサンプルを渦巻きます。 注意: オートクレーブの間に温度が上昇すると、チューブが破裂する可能性があります。</li>
</ol>2. 固相抽出(SPE)による補因子F 420 の予精製
注:SPEのすべてのステップは室温で行われます
<ol><li>サンプルを室温まで冷やします。</li>
	<li>11,000 x gで5分間オートクレーブサンプルを遠心分離 します。</li>
	<li>弱いアニオン混合モードポリマー吸着剤の100mgで満たされた5 mL SPEカラムを準備します。</li>
	<li>3 mLのメタノール(条件溶液、 表1)でアニオン交換器を条件にします。</li>
	<li>3 mLの蒸留水でアニオン交換器を平衡化する(平衡溶液、 表1)。</li>
	<li>遠心分離したリセートからSPEカラムに上清の9.0 mLまでロードします。</li>
	<li>25mM酢酸アンモニウム(SPE洗浄液1、 表1)の5mLで不純物を洗い流す。</li>
	<li>5mLのメタノールで不純物を洗い流す(SPE洗浄液2、 表1)。</li>
	<li>溶出バッファーの 1.0 mL で補因子 F420 を溶出する(表 1)。 注:新鮮な溶出バッファを準備してください。真空が適用され溶出バッファーの蒸気圧が高いため、溶出量はサンプルごとに異なる場合があります。すべてのサンプルで同じ最終容積を確保するために、溶出の前後に回収容器の重量を量り、有効溶出量を計算することを推奨します。溶出バッファーの添加により差のバランスを取る。</li>
</ol>3. 補因子F420の検出
<ol><li>オーブンを40°Cに、蛍光検出器を420 nmの絶滅波長および470 nmの発光波長に設定します。移動相AとBを用いて勾配モードで分離を達成する(表1):0-3分:26%B;3-24分:26%-50%B;24-25分:50%B;25-27分:50%-26%B;27-35分:0.75 mL·min-1の流量で26%B。 注: 少なくとも 74% 移動相 A および 26% 移動相 B の 3 列ボリュームで列をフラッシュして、サンプルを注入する前に列条件の平衡を保証します (表 1)。<ol>
<li>0.22 μmの孔径のPTFEフィルターを使用して、SPEから溶出したサンプルをHPLCバイアルにフィルターします。 注:0.22 μmの孔径のPTFEフィルタをお勧めします。</li>
		<li>溶出したサンプル50 μLをHPLCシステムに注入し、補因子F420 組成と濃度を分析します。 注: このプロトコルでは定量的な標準が使用されていないので、サンプルとバリアントをピーク面積で比較する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Bashiri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+biosynthetic+pathway+for+the+cofactor+F420+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A revised biosynthetic pathway for the cofactor F420 in prokaryotes.</a> Nature Communications. 10 (1), 451(2019).</li>
<li>Grinter, R., Greening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+F420%3A+an+expanded+view+of+its+distribution%2C+biosynthesis%2C+and+roles+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cofactor F420: an expanded view of its distribution, biosynthesis, and roles in bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. , (2021).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+structure+for+coenzyme+F+420+from+methanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Proposed structure for coenzyme F 420 from methanobacterium.</a> Biochemistry. 17 (22), 4583-4593 (1978).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methanogenic+redox+cofactor+F420+is+widely+synthesized+by+aerobic+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The methanogenic redox cofactor F420 is widely synthesized by aerobic soil bacteria.</a> The ISME Journal. 11 (1), 125-137 (2017).</li>
<li>Braga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+rerouting+in+Paraburkholderia+rhizoxinica+evolved+long-overlooked+derivatives+of+coenzyme+F420%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway rerouting in Paraburkholderia rhizoxinica evolved long-overlooked derivatives of coenzyme F420.</a> ACS Chemical Biology. 14 (9), 2088-2094 (2019).</li>
<li>Eirich, L. D., Vogels, G. D., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+coenzyme+F420+and+properties+of+its+hydrolytic+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Distribution of coenzyme F420 and properties of its hydrolytic fragments.</a> Journal of Bacteriology. 140 (1), 20-27 (1979).</li>
<li>Michaelis, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+reefs+in+the+Black+Sea+fueled+by+anaerobic+oxidation+of+methane%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane.</a> Science. 297 (5583), 1013-1015 (2002).</li>
<li>Knittel, K., Lösekann, T., Boetius, A., Kort, R., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+methanotrophic+archaea+at+cold+seeps%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of methanotrophic archaea at cold seeps.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (1), 467-479 (2005).</li>
<li>Lin, X. -L., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Coenzyme+F420+and+Its+y-Monoglutamyl+derivative+in+nonmethanogenic+archaebacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Coenzyme F420 and Its y-Monoglutamyl derivative in nonmethanogenic archaebacteria.</a> Journal of Bacteriology. 168 (1), 444-448 (1986).</li>
<li>Spang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+ammonia-oxidizing+Candidatus+Nitrososphaera+gargensis%3A+insights+into+metabolic+versatility+and+environmental+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genome of the ammonia-oxidizing Candidatus Nitrososphaera gargensis: insights into metabolic versatility and environmental adaptations.</a> Environmental Microbiology. 14 (12), 3122-3145 (2012).</li>
<li>Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+and+hydrogenase+function+in+methanogenic+archaea%2C+in+particular+the+genus+Methanosarcina%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Energy conservation and hydrogenase function in methanogenic archaea, in particular the genus Methanosarcina.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR. 83 (4), (2019).</li>
<li>Lupa, B., Hendrickson, E. L., Leigh, J. A., Whitman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formate-dependent+H2+production+by+the+mesophilic+methanogen+Methanococcus+maripaludis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Formate-dependent H2 production by the mesophilic methanogen Methanococcus maripaludis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 74 (21), 6584-6590 (2008).</li>
<li>Kulkarni, G., Mand, T. D., Metcalf, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+conservation+via+hydrogen+cycling+in+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+barkeri%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Energy conservation via hydrogen cycling in the methanogenic archaeon Methanosarcina barkeri.</a> mBio. 9 (4), (2018).</li>
<li>Purwantini, E., Gillis, T. P., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+in+Mycobacterium+and+Nocardia+species%2C+but+absence+from+Streptomyces+and+Corynebacterium+species+and+methanogenic+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Presence of F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase in Mycobacterium and Nocardia species, but absence from Streptomyces and Corynebacterium species and methanogenic Archaea.</a> FEMS Microbiology Letters. 146 (1), 129-134 (1997).</li>
<li>Purwantini, E., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+novel+coenzyme+F420-dependent+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+from+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Purification of a novel coenzyme F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis.</a> Journal of Bacteriology. 178 (10), 2861-2866 (1996).</li>
<li>McCormick, J. R. D., Morton, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+of+cosynthetic+factor+I+of+Streptomyces+aureofaciens+and+fragment+FO+from+coenzyme+F420+of+Methanobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F420 of Methanobacterium species.</a> Journal of the American Chemical Society. 104 (14), 4014-4015 (1982).</li>
<li>Coats, J. H., Li, G. P., Kuo, M. -S. T., Yurek, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery%2C+production%2C+and+biological+assay+of+an+unusual+flavenoid+cofactor+involved+in+lincomycin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Discovery, production, and biological assay of an unusual flavenoid cofactor involved in lincomycin biosynthesis.</a> The Journal of Antibiotics. 42 (3), 472-474 (1989).</li>
<li>Bown, L., Altowairish, M. S., Fyans, J. K., Bignell, D. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+the+Streptomyces+scabies+coronafacoyl+phytotoxins+involves+a+novel+biosynthetic+pathway+with+an+F420+-dependent+oxidoreductase+and+a+short-chain+dehydrogenase%2Freductase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Production of the Streptomyces scabies coronafacoyl phytotoxins involves a novel biosynthetic pathway with an F420 -dependent oxidoreductase and a short-chain dehydrogenase/reductase.</a> Molecular Microbiology. 101 (1), 122-135 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F%28420%29+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel F(420) -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Molecular microbiology. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+F420H2-dependent+reductases+promiscuously+reduce+diverse+compounds+through+a+common+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial F420H2-dependent reductases promiscuously reduce diverse compounds through a common mechanism.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1000(2017).</li>
<li>Mathew, S., Trajkovic, M., Kumar, H., Nguyen, Q. -T., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantio-+and+regioselective+ene-reductions+using+F420H2-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Enantio- and regioselective ene-reductions using F420H2-dependent enzymes.</a> Chemical Communications. 54 (79), Cambridge, England. 11208-11211 (2018).</li>
<li>Ney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+tail+length+modulates+catalysis+of+bacterial+F420-dependent+oxidoreductases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cofactor tail length modulates catalysis of bacterial F420-dependent oxidoreductases.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1902(2017).</li>
<li>Grinter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+structural+basis+of+synthesis+of+the+unique+intermediate+dehydro-F420-0+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Cellular and structural basis of synthesis of the unique intermediate dehydro-F420-0 in mycobacteria.</a> mSystems. 5 (3), (2020).</li>
<li>Peck, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+concentrations+of+coenzyme+F420+analogs+during+batch+growth+of+Methanosarcina+barkeri+and+Methanosarcina+mazei%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Changes in concentrations of coenzyme F420 analogs during batch growth of Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei.</a> Applied and Environmental Microbiology. 55 (4), (1989).</li>
<li>Gorris, L. G., vander Drift, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofactor+contents+of+methanogenic+bacteria+reviewed%5BTitle%5D)+AND+%22BioFactors%22%5BJournal%5D)">Cofactor contents of methanogenic bacteria reviewed.</a> BioFactors. 4 (3-4), Oxford, England. 139-145 (1994).</li>
<li>Bair, T. B., Isabelle, D. W., Daniels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+coenzyme+F%28420%29+in+Mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structures of coenzyme F(420) in Mycobacterium species.</a> Archives of Microbiology. 176 (1-2), 37-43 (2001).</li>
<li>Portillo, M. C., Gonzalez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moonmilk+deposits+originate+from+specific+bacterial+communities+in+Altamira+Cave+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Moonmilk deposits originate from specific bacterial communities in Altamira Cave (Spain).</a> Microbial Ecology. 61, (2011).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+preparation+for+the+cultivation+of+microorganisms+under+strictly+anaerobic%2Fanoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60155(2019).</li>
<li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogenotrophic+methanogenesis+and+autotrophic+growth+of+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22Archaea%22%5BJournal%5D)">Hydrogenotrophic methanogenesis and autotrophic growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li>
<li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+acetate%3A+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li>
<li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation%2C+preservation%2C+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li>
<li>Bashiri, G., Rehan, A. M., Greenwood, D. R., Dickson, J. M. J., Baker, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cofactor+F420+production+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cofactor F420 production in Mycobacterium smegmatis.</a> PloS one. 5 (12), 15803(2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

微量原性純粋培養物からの補因子F420 の評価のために、関係する微生物の増殖および活性(蛍光顕微鏡)を可視化する顕微鏡評価を行うことができる(図1)。自然環境から派生したサンプルについては、F420 を検出または定量するための顕微鏡検査の使用は、他の蛍光微生物、有機および無機粒子との干渉のために制限されます。この文脈では、F420 の抽出およびHPLCを用いたその後の蛍光測定分析は、前述の5に記載したように、補因子F420 の全体的な濃度に関する情報を提供できるだけでなく、ポリグタメートの尾尾長分布にも関する情報を提供することができる。
補因子F420の抽出に関しては、圧力温度処理が非常に有効であることが示された(図2)、そして、これまでの知見5,27...

F420は、広く普及しているが、しばしば無視された補因子であり、これは、古細菌および細菌1,2の両方の一次および二次代謝プロセスにおける義務的な2電子水素化物担体として機能する。F420は5-デアザフラビンであり、構造的にはフラビンに類似しており、それによってその化学的および生物学的特性はNAD+またはNADP+のものとより同等である。イソロキサジン環の位置5で窒素と炭素を置換するため、それは強力な還元剤であり、したがって-340 mV1,3の低標準酸化還元電位を示す。F420は、5-デアザフラビン環と2-ホスホ-L-乳酸リンカーを含む(F420-0)。n+1グルタミン酸モノマーを含むオリゴグルタミン酸尾を分子に結合させることができる(F420-n+1)4。
長い間、補因子F420は、単に古細菌とアクチノバクテリアと関連付けられてきた。これは主に覆されています。最近の分析では、F420はフィラプロテオバクテリア、クロロルレクシの多様な嫌気性および好気性生物の間に分布し、土壌、湖、人間の腸のような無数の生息地に生息する可能性のあるフィルミキュートが明らかになりました1,5.2019年、Bragaら.6は、プロテオバクテリウムパラブルクホルデリア・リゾキシニカが、様々な生息地で広まっている可能性のある2-ホスホラクテート尾の代わりに3-ホスホグリセリン酸を含むユニークなF420誘導体を産生することを示した。ドメインアルカエアの中で、F420は、メタノジェニック7、メトトロピー8、9、硫酸還元オーダー10を含むいくつかの系統で発見されており、タウマルカエオタ11で生産されることになっている。F420は、水素栄養学およびメチロトローフ性メタン新生において必須のレドックス補酵素として最もよく知られている。F420(F420H2)の還元形態は、メチレンネテトラヒドロメタノプテリン(メチレン-H4MPT、Mer)およびメテニルH4MPT12,13の還元のための電子ドナーとして機能する。また、シトクロム12,14を含有するメタノゲンのH2非依存性電子輸送経路における電子担体として用いることができる。さらに、F420の酸化型は、420nmでの励起時に特徴的な青色・緑色蛍光を有し、微小微小の微小化した微量体原の検出を容易にする(図1)。その低い酸化還元電位のために、F420は(i)それ以外の場合は再カルシタントまたは有毒な有機化合物の広いスペクトルの外因性減少を促進し、 (ii)ストレプトマイセテ(フィラムアクチノバクテリア)におけるテトラサイクリンおよびリンコサミド抗生物質またはフィトトキシンの合成、および(iii)抗酸菌(フィラムアクチノバクテリア)における酸化またはニトロ化ストレスまたはその他の不利な状態に対する耐性、 16,17,18,19,20,21,22.その結果、F420依存性酸化還元酵素は、工業および製薬の目的および汚染された環境のバイオレメディエーションのための有望な生体触媒である1,23。これらの最近の知見にもかかわらず、補因子F420の正確な役割は、アクシノバクテリアまたは他の細菌フィラでまだわずかに知られている。
F420生合成には少なくとも3つの経路があります2,6,24。初めに、生合成経路は5-デアザフラビン生合成および2-ホスホラク酸代謝分岐に分割される。F420分子の反応性部分は、フィロシンと5-アミノ-6-リビチルアミノ-2,4(1H, 3H)-ピリミジンジオンの基質を用いてFO-シンターゼを介して合成される。結果はリボフラビンレベルのクロモフォアFOです。現在受け入れられている乳酸代謝ブランチ内では、L-乳酸はL-乳酸キナーゼ(CofB)によって2-ホスホ-L-乳酸にリン酸化される。2-ホスホ-L-乳酸は、今度は、2-ホスホ-L-乳酸グアニリルトランスファーゼ(CofC)によってL-ラクチル-2-ジホスホ-5'-グアノシンにグアニル化される。次のステップでは、L-ラクチル-2-ジホスホ-5'-グアノシンは、F420-02を形成する2-ホスホ-L-乳酸トランスファーゼ(CofD)によってFOにリンクされています。最後に、酵素F420-0:ɣグルタミルリガーゼ(CofE)はグルタミン酸モノマーをF420-0にリゲートし、異なる数23,25で最終的な補因子6を形成する。異なる生物は、ミコバクテリア2,25,26よりも安価な尾がメサノゲンに見られる短い尾で、付着したグルタミン酸残基の数で異なるパターンを示す。一般的に、メタノゲンは2から3までの尾の長さを示し、アセトクラス性メタノゲン、メサノサルシナsp.で最大5つ、マイコバクテリウムspに見られる尾長は5〜7個のグルタミン酸残基2,25,26,27の範囲でした。しかし、最近の知見では、長鎖F420が短鎖F420よりも高い親和性を有するF420依存性オキシド還元酵素に結合することが示された。また、結合長鎖F420は基質親和性を高めるが、それぞれの酵素23の回転率を低下させる。
補因子F420の検出は、多くの場合、その蛍光に基づいています。それにより、そのオリゴグルタミン酸誘導体を逆相(RP)-HPLC27,28を用いて分離した。最近、Ney et al. は、負に荷電したグルタミン酸尾のイオン対向試薬として水酸化テトラブチラモニウムを使用し、RP-HLPC上での分離を正常に促進した5。ここでは、純粋な培養物からだけでなく、異なる環境サンプル(土壌および消化剤汚泥)からの補因子F420のサンプル、その後のリシス、抽出、精製、分離、定量の調製方法を提示する。

<table><tbody><tr><td>グラジエントモジュル、オーブン、蛍光検出器を搭載した</td><td></td>オート<td></td>クレーブ生体適合性HPLCシステム 島津<td></td>製作所HPLCシステム</tr><tr><td></td> 50mL用遠心分離機とローター "<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファルコン」チューブ(11.000 rcf)と適切なチューブHPLC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カラム:Gemini NX C18、5 &mu;m、150 x 3 mm</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>HPLC カラム</td></tr><tr><td>PTFE フィルター (細孔径 0.22 &micro;m) HPLC分析</td><td></td><td></td><td></td>前の粒子状物質を除去する</tr><tr><td>SPE用樹脂:Strata-X-AW 33 &mu;m as 弱陰イオン ミックスモードポリマー吸着剤</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>弱陰イオン混合モードポリマー吸着剤</td></tr><tr><td>SPEおよび適切な収集チューブ</td><td></td><td></td>用真空マニホールド <td>SPE装置</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子f420 の抽出

Extraction of Cofactor F420 for Analysis of Polyglutamate Tail Length from Methanogenic Pure Cultures and Environmental Samples

補因子F420 は、多くの細菌および古細菌分類の一次および二次代謝における水素化物担体としての中心的な役割を果たす。補因子は、熱力学的に困難な反応を促進する、温記生成におけるその役割で最もよく知られている。ポリグルタミン酸尾翼は生物間で長さが異なるため、長さプロファイル解析は、様々な生息地で異なるグループや経路を区別し、特徴付けるための強力なツールとなる可能性があります。ここで、プロトコルは、文化的または分子生物学的アプローチに依存しない高性能液体クロマトグラフィー分析と組み合わせた固相抽出を適用することによって補因子F420 検出の抽出および最適化について説明する。この方法は、土壌中の微生物群集、嫌気性汚泥、純粋な培養物から補因子F420 の発現に関する追加情報を得るために適用され、スパイク実験によって評価された。それにより、制御されたタンパク質原性純粋培養物、嫌気性消化剤汚泥や土壌などの環境試料から、水素栄養学およびアセトクラス系のメタノゲンに対する異なるF420 尾長プロファイルの生成に成功した。

メタノサルシナ熱性菌およびメタノカレウス熱性の純粋な培養物は、いずれも好熱性の古大なものであり、以前に説明した好性の培地で増殖した。メタノールはエネルギー源としてメタノールを使用し、一方、メタノカレウスはH2/CO2で増殖した。成長は顕微鏡評価によって確認し、活性は、前述のガスクロマトグラフィーによるメタン(CH4)の測定を介して調べられた31。純粋な培養物は、提示されたプロトコルに従って補因子F420の抽出に使用された。また、2020年秋には、中球性バイオガス反応器スラッジ(廃水処理プラント、ジルル、オーストリア)のサンプルを含む環境試料を採取し、農業用牧草地(オーストリア、インスブルック、オーストリア)、森林土壌(オーストリアのランズ)を採取し、コ...

純粋な培養物から補因子F420 を抽出する方法を、純粋培養および環境試料におけるF420 尾長の液体クロマトグラフィー分離および分析に最適化した。

メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子F420 の抽出

The cofactor F420 plays a central role as a hydride carrier in the primary and secondary metabolism of many bacterial and archaeal taxa. The cofactor is ...

補因子F420は、多くの原核生物の一次および二次代謝において重要な役割を果たす。環境試料の中でこの分子を測定することで、その有病率と機能を深く理解することができます。この技術は、汚泥や土壌などの難しいサンプル材料における補因子の分析を可能にする。それによって、分析前の材料のリシスおよび予精製が中心的なステップである。このプロトコルには、サンプルの準備中にさまざまな手順が含まれています。これらのステップは、サンプル処理を開始する前に、非常に適切に計画および準備する必要があります。例えば、新鮮なバッファーの調製は重要です。サンプルのライシスを開始するには、50ミリリットルの円錐管にサンプル5グラムを入れる。その後、サンプルに2Xリシスバッファーの5ミリリットルを追加し、1ミリリットル当たり0.5グラムの最終的な濃度に達するために蒸留水で10ミリリットルにボリュームを持って来ます。希釈したサンプルを20秒間渦液化し、続いて摂氏121度で30分間オートクレーブする。森林土壌のような乾燥サンプルの場合は、オートクレーブ処理後に蒸留水で20ミリリットルの最終体積を持ち、実証したように希釈したサンプルを再び20秒間渦巻きます。サンプルが冷めたら、サンプルを11,000 x gで5分間遠心分離し、上清を収集します。5ミリリットルの固相抽出またはSPEカラムを調製し、弱いアニオン混合モードポリマー吸着剤を100ミリグラム充填し、3ミリリットルのメタノールでアニオン交換器を調整します。次に、3ミリリットルの蒸留水でアニオン交換器を平衡化する。遠心分離したライセートからSPEカラムに上清の9ミリリットルまでロードします。25ミリモルアンモニアアセテートと5ミリリットルのメタノールでカラムから不純物を順次洗浄します。洗浄後、1ミリリットルの溶出バッファーで補因子F420を溶出する。オーブンを摂氏40度にプリセットし、蛍光検出器を420ナノメートルの絶滅波長と470ナノメートルの発光波長に設定します。次に、0.22ミクロンの孔径のPTFEフィルタを使用して、SPEからHPLCバイアルに溶出したサンプルをフィルタリングします。フィルタリングされたサンプルの50マイクロリットルをHPLCシステムに注入し、原稿に記載されているように移動相の組み合わせを使用して勾配モードで補因子F420を分離する。補因子F420組成と濃度を分析します。メサノゲンの純粋な培養物の成長は顕微鏡で検証された。位相対面顕微鏡では、メタノゲンの凝集体が目に見え、補因子F420が紫外線で励起されると青みがかった光を発する。異なる量のメサノカレウス熱球培養物を有するSPE後の回収補因子F420のピーク領域を分析した。オートクレーブ崩壊戦略は、最高のピーク面積を達成し、圧力温度処理を使用して最大抽出効率を達成しました。尾長分布の分析は、環境試料中の純粋なメタノジェニック培養物の補因子F420の全体的な濃度とF420尾の長さの分布の違いを明らかにした。この手順を適用する場合は、溶出バッファーの総体積を完全に収集するか、フロースルーの正確なボリュームを記録することに注意してください。この技術は、土壌や汚泥のようなより複雑なサンプルで補因子F420の探査への道を開き、この分子の生態学的影響に関するより深い洞察を可能にする。

extraction-cofactor-f420-for-analysis-polyglutamate-tail-length-from

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JoVE Journal

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メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子_F420 の抽出

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