インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価
2021年11月20日
蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。
この手順の目的は、生体内の微小管組織とダイナミクスを評価することです。ニューロンは、軸索、樹状、シナプスコンパートメントを持つ偏光細胞であり、その根底にある細胞骨格によって維持されます。微小管はニューロン細胞骨格の大部分を形成し、ダイナミクスと向きは神経細胞の発達と成熟の間に主要な事象を決定する。
微小管は、アルファおよびベータチューブリンヘテロダイマーで構成され、本質的に非常にダイナミックなプラスエンドと安定したマイナスエンドで二極化しています。プラスエンドでの重合の間、エンド結合タンパク質の多分子複合体は、プロトフィラメントと一過性に関連付け、チューブリンダイマーの組み立てを促進する。この技術は、生体内の神経微小管を可視化するのに役立ちます。
この技術を使用して、C.elegansニューロンの発達および再生中に動的微小管の向きおよび他のパラメータを決定することができる。我々は通常、このレポーターを使用して、感覚ニューロンの微小管ダイナミクスを視覚化する。しかし、筋肉や皮膚などの他の細胞型でこのレポーターを発現させ、これらの細胞内の動的微小管を可視化することができます。
ここで蛍光標識されたエンド結合タンパク質は、ここでEBPをGFPにし、彗星として現れる。これらの彗星のダイナミクスは、微小管の併発成長と相関しており、微小管のダイナミクスと向きを測定するための重要な指標である。特定の細胞型でこれらの彗星を観察するために、EBP-2およびGFPのDNAを有するトランスジーンは、特定のプロモーター下で発現される。
PLMニューロンにおける発現に関しては、このトランスジーンはプロモーターのmakeの下で発現される。これらのトランスジェニックワームは、選別または取り付け前に蛍光を設定して、ステレオ顕微鏡で見ることができます。EBP彗星をイメージングするためのワームを取り付けるために、M9バッファに10%アルゴスを作ります。
とガラススライドにドロップを置きます。別のスライドは、パッドに固めるフィルムにドロップを押すために使用されます。我々は0.1ミクロン、ポリスチレンビーズを取り付け媒体として使用し、いくつかのワームが選ばれ、ビーズ溶液に再懸濁される。
カバースリップは、ワームを固定するために密猟され、イメージングのために撮影されます。取り付けられたものは、高解像度イメージングのためのカメラを使用して、任意の蛍光顕微鏡で画像化することができます。セットアップはより速く集録し、減らされた写真の漂白および光毒性のための回転ディスク装置が装備されている。
スライドはステージ上に保持され、ワームのフィールドは、明視野照明を使用して集中し、中央に配置されています。5Xや10Xのような低倍率の目的は、この目的のために使用することができます。同じ照明を使用して63Xのような高倍率の目的でワームを再集重することができます。
この目的は彗星のイメージ投射に最適な空間分解能を提供する。PLMニューロンの固定センタリングは、過度の光暴露とprumの写真の漂白を防ぐために蛍光照明の下で行われます。画像取得のために、我々はサイトからソフトウェアを送信を使用します。
明視野チャネルでライブイメージング構成を使用して、我々は、ワームの尾領域をフォーカスし、ビューフィールドにそれを中心にします。その後、488ナノメートルの励起光を用いた光イメージング構成を用いてPNMニューロンを集光する。タイムラプス獲得の場合、露光時間、時間経過時間、フレーム間の間隔がイメージングの時間的スキルを定義する実験的な設定を作成します。
定量測定では、EBP彗星の一部の映画をオープンソースソフトウェアであるイメージJで分析する必要があります。取得したタイムラプスは、映画としてプレビューできるマルチイメージストランドとして開きます。この特定のタイムラプスでは、彗星は、細胞体、前および後工程のPLMニューロンに見ることができる。
細胞体から離れる彗星はプラスエンドアウトに分類され、細胞体に向かって移動する彗星はマイナスエンドアウトに分類されます。分析を開始するには、セグメント化された線が対象領域(この場合はPLMニューロンの内部プロセス)に引かれます。この線分は画像の再スライス機能を使用して、キモグラフに変換されます。
キモグラフは移動する彗星を表す対角線折り目を持つ距離時間画像です。これらのトレースに直線セグメントを描画し、分析メニューを使用して測定パラメータを設定できます。これらのパラメータは、Excel などのデータ分析プログラムで、標準の測定可能な数量と単位に変換できます。
トレースの幅は、拡張長に対応します。高さは成長期間を表し、折り目の角度は彗星の方向を示す。これらの彗星は、さらにプラスエンドアウトとマイナスエンドアウトに分類され、微小管の相対的な向きを見つけることができます。
EBTA GFPのトランスジェニック発現は、新しい再生などの様々な細胞コンテキストにおける微小管ダイナミクスを観察するように適応することができる。領域評価軸索の微小管ダイナミクスを観察するために、軸索はフェムト秒レーザーを使用して負傷し、大規模な担保損傷を引き起こすことなく軸索を正確に切断することができます。損傷後、ワームは後の観察のためにシードされたエンジンプレートに回収することができる。
PLMニューロンは、損傷後6時間で早くも観察することができる堅牢なエキセネリー再生を示す。新たな権利を再生する光毒性を防ぐために、生画像化は回転ディスク顕微鏡で行われる。再生軸索のタイムラプス獲得は、後で彗星の分析のためにカイモグラフに変換することができます。
彗星の距離の長さと方向は、微小管の向きとダイナミクスの観点から解釈することができます。私の重要な方向性とダイナミクスは、細胞分裂、移動、細胞アーキテクチャの維持などの民間細胞プロセスの重要な決定者です。生体内での微小管ダイナミクスの測定には多くのツールが利用できますが、難しい場合があります。
自己花序、光毒性、過発現アーティファクト、および可変報告強度は、エンド結合タンパク質の実観察中に遭遇する困難の一部であり、微小管ダイナミクスを評価する。この研究は、低濃度のDNAおよび低照度イメージングを伴う統合トランスジェニックを使用して、これらの課題のいくつかを軽減する方法に取り組んできた。ここで説明するイメージングおよび分析モジュールは、他の微小管ベースのレポーターおよびタンパク質輸送に向けて拡張することができる。
これは、C.エレガンスニューロンに適用されるだけでなく、他の細胞タイプやモデルシステムにも適用できます。
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概要
この研究は、蛍光タンパク質で標識された終端結合タンパク質EBPを用いてC. elegansの側面後微小管（PLM）ニューロンの動的微小管のin vivoイメージングを行うプロトコルを提示します。このプロトコルの目的は、微小管のダイナミクスを視覚化し、神経発達と再生中にこれらの細胞骨格構造の配向と挙動を評価できるようにすることです。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞骨格のダイナミクス
- 蛍光イメージング
背景
- 微小管は神経構造と機能に不可欠で、発達と成熟に影響を与えます。
- それらはアルファとベータチューブリンで構成され、神経プロセスに重要な動的挙動を示します。
- 終端結合タンパク質は微小管の集合とダイナミクスを促進する重要な役割を果たします。
研究目的
- in vivoで微小管のダイナミクスを視覚化する手法を開発すること。
- C. elegansにおける神経発達と再生中の微小管の挙動を分析すること。
- この技術をニューロン以外の様々な細胞タイプにも適用すること。
使用方法
- イメージングには、スピニングディスクユニットを備えた蛍光顕微鏡が使用されました。
- 生物モデルとしてC. elegansが使用され、PLMニューロンに焦点を当てました。
- GFPと融合したEBP-2のトランスジェニック発現が標識に使用されました。
- ワームはポリスチレンビーズを使用してマウントされ、蛍光顕微鏡下で観察されました。
- 時間差イメージングと分析は、微小管ダイナミクスの定量的測定のためにImageJを使用して実行されました。
主要な結果
- 観察されたコメットは動的微小管を表し、その動きはプラス端外またはマイナス端外に分類されます。
- この方法により、特に軸索損傷後の微小管の成長方向、持続時間、ダイナミクスの評価が可能になりました。
- 観察結果は、微小管配向の明確なパターンを伴う軸索の堅固な再生を示しました。
結論
- この研究は神経細胞における微小管ダイナミクスの視覚化と分析を促進し、発達と損傷反応時の神経挙動の理解を進めます。
- この知見は様々な生物学的文脈における神経メカニズムと可塑性の探索に影響を与えます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding microtubule dynamics in neurons provides critical insights into axonal integrity and regeneration, which are central to neurodegenerative disease mechanisms and neuroprotective target validation. This in vivo assay enables quantitative assessment of cytoskeletal behavior, supporting early-stage hypothesis testing in neuronal health and repair pathways. The approach offers a scalable, genetically tractable system for de-risking targets involved in cytoskeletal regulation and neuronal resilience.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule orientation and dynamics as functional readouts for target engagement in neuronal models.
- Operational Value: Provides a quantitative, imaging-based assay to assess compound effects on axonal microtubule behavior in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative readouts of microtubule growth direction and dynamics via comet analysis in kymographs.
- Operational Value: Establishes a standardized, adaptable platform for live imaging that can be applied across genetic backgrounds and neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking microtubule dynamics to axonal regeneration outcomes following injury.
- Operational Value: Facilitates longitudinal assessment of repair processes, enabling predictive modeling of neurotherapeutic efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional cytoskeletal readouts that inform target validation and lead optimization in neuroscience programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microtubule-regulating targets through direct visualization of plus-end dynamics in axons.
- Screening: Enables assay-ready systems with quantifiable outputs (comet trajectory, orientation) for compound screening in neuronal models.
- Analytics: Generates measurable parameters (growth velocity, duration, direction) from kymograph analysis to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects dynamic microtubule behavior to regenerative capacity, supporting continuity from hit identification to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: The transgenic reporter system can be redeployed across cell types and disease models, enhancing platform sustainability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking molecular perturbations to functional cytoskeletal outcomes in neurons.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging protocols with minimal variability through controlled mounting and low-phototoxicity acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-based biomarkers of axonal health and regenerative potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in cytoskeletal stability and neuronal repair mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic C. elegans handling, fluorescence microscopy, and kymograph-based image analysis.
- Dependent on spinning disk confocal or equivalent high-speed, low-phototoxicity imaging systems for longitudinal studies.
- Necessitates standardization of promoter-driven expression and mounting protocols across labs for reproducible comet detection.
- Adaptation to other cell types requires validation of promoter specificity and microtubule reporter compatibility.
- Practical limitations include potential overexpression artifacts and photobleaching, mitigated by low-expression transgenes and controlled illumination.
