Name: 細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 学ぼう、細菌無細胞リザートの迅速かつ低コストな生産法。Escherichia coliを用いてGFP発現を確認し、バッチ間変動が2倍以内の再現性を実現。標準的な研究室で容易に実施可能な手法です。

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著者らは、ザカリー・サンとリチャード・マレー(カリフォルニア工科大学)がプラスミドP_araBADガムを提供してくれたこと、亀井佳子(京都工業大学)が高速冷却遠心分離機を親切に提供してくれたことに感謝する。この研究は、国立衛生研究所とARO MURIプログラムからの助成金によって支えられ、一部は優秀な若い研究者のためのリーディングイニシアチブ、MEXT、日本によって支援されました。

1. メディアとバッファを準備します。
<ol><li>2xYTPG培地を準備します。<ol>
<li>62g 2xYT粉末、5.99gリン酸カリウム一塩基、13.93gのリン酸カリウム二塩基、および2Lに脱イオン水を混合する。</li>
		<li>30分14の露出時間を持つ液体サイクル上のオートクレーブ。</li>
		<li>1.1.2から2xYTP培地の400mLに、7.2 gのD-グルコース(デキストロース)を加え、溶解するまで混ぜます。</li>
		<li>0.2 μmフィルターを通してフィルター滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>S30A バッファを準備します。<ol>
<li>トリス-HCl(pH 7.7、50 mM最終濃度)、グルタミン酸カリウム(60mM最終)、グルタミン酸マグネシウム(14mM最終)を混合します。</li>
		<li>10 M KOH を使用して pH を 7.7 に調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューション 1 の準備 ( 表 1を参照)。<ol>
<li>4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を2mLの水で再懸濁します。</li>
		<li>KOH を使用して pH を 8.0 に調整します。</li>
		<li>表 1から他のすべてのコンポーネントを追加します。</li>
		<li>10 M KOH を使用して pH を 7.6 に調整します。フィルター滅菌。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5x プレミックス ソリューションを準備します ( 表 2を参照)。<ol>
<li>表 2のすべてのコンポーネントを混合します。</li>
		<li>KOH を使用して pH を 7.5 に調整します。</li>
		<li>アリコートと -80 °Cで凍結します。 注意:20 μLの反応は8.9 μLのプレミックスを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞を準備します。
<ol><li>50 μg/mL アンピシリンを含むLB寒天プレートに自動調整セルをストリークし、37 °Cで成長します(注1参照)。</li>
	<li>ピペットチップを使用してLB/アンピシリン培地のスターター培養に単一コロニーを選び、一晩で37°Cで成長します。</li>
	<li>50 μg/mL アンピシリンを含む2xYTPG培地400mLを400μLのスターター培養で接種し、1Lエルレンマイヤーフラスコで37°Cで成長し、300rpmで振る。</li>
	<li>分光光度計を用いて、1cmのパス長を持つ光学キュベットを読み取り、600nm(OD600)で培養物の光学密度を定期的に測定します。OD600が1を超えると、測定前に培養物を5倍希釈し始め、測定が典型的な実験室分光光度計の線形範囲内に留まることを確認します。5倍希釈培養が0.3のOD600(1.5の培養OD600に相当する)に達するまで細胞を増殖し続ける。</li>
</ol>3. ライセートを準備します。
<ol><li>2 mMジチオトレイトール(DTT)を補ったS30Aバッファーを準備します。ステップ3.7で使用するために氷の上に置くDTTストック溶液の6 μLとS30Aバッファーの3 mLを混合します。</li>
	<li>室温で15分間1800×gで遠心分離機で細胞を収穫します。</li>
	<li>上清を流し、ピペットを使って残りの液体を取り除いて捨てます。</li>
	<li>ボルテックスミキサーを使用して、ペレットを45 mLの冷たい(4-10°C)S30Aバッファーに再懸濁します。</li>
	<li>空の50 mL遠心分離チューブの重量を量り、細胞を中に移し、ステップ3.2~3.3を繰り返して細胞を洗浄します。</li>
	<li>ペレットの重量を量り、空の50 mLチューブの重量を差し引く。ペレット重量の正確な測定を確実にするために、残りの上清を慎重に吸引してください。 注:典型的な収量は、生産培養の400 mLから細胞ペレットの〜1.3 gです。</li>
	<li>2 mMジチオトライトールを補った2量の冷たいS30Aバッファ、すなわち、細胞ペレットの1gごとに2mLのバッファーを加え、激しく渦混合することによって細胞を再懸濁する。</li>
	<li>セルを固定します。ペレットが完全に凍結されるまで、細胞を含む50 mLチューブを-20°Cまたは-80°Cの冷凍庫に入れ、 注:凍結ステップは、その日の良い停止点です。</li>
	<li>室温の水浴で細胞を解凍します。</li>
	<li>2-3分間激しく渦を出す。</li>
	<li>300rpmで振りながら37°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>4°Cで45分間、透明遠心管を30,000×gで遠心分離して重い細胞の破片のサンプルをクリアします。 注:30,000 x gの対応する遠心分離機が利用できない場合は、21,000×gで45分間遠心分離機を使用し、ペレットのコンパクト化が少なくてすむため、ステップ3.13で追加の注意を払ってください。</li>
	<li>慎重にピペットで新しいチューブに上清を移し、ペレットをできるだけ邪魔しないようにします。移された上清がペレットからの材料で汚染されている場合は、前のステップを繰り返します。</li>
	<li>上清を1.5mL遠心管と遠心分離機に21,000×g(または卓上遠心分離機の最高速度)でもう一度5分間移します。</li>
	<li>アリコートは、クリアした自動で所望のボリュームに自動化し、残りのペレットを慎重に避け、-80°Cで凍結するか、すぐに使用する。 注:単一の20 μLの反応は8 μLの自動調整を使用します。</li>
</ol>4. 無細胞遺伝子発現
注: 自動調整は、必要なエンドユースの準備が整いました。以下は、無細胞遺伝子発現の標準プロトコルの例である。
<ol><li>20 μL 反応の場合は、氷の上で 8 μL の自動調整液と 8.9 μL のプレミックスを混合します。グルタミン酸マグネシウムおよびPEG 8000濃度の最適化に関するプロトコルセクションの最後にあるNOTEを参照してください。</li>
	<li>DNA(例えば、pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500)を最終濃度の8 nMに加え、他の試薬、水を20μLに加えます。</li>
	<li>反応を384ウェルマイクロプレートに入れ、プレートリーダーを使用して蛍光時間の経過および/またはエンドポイントを測定します。緑色蛍光タンパク質(GFP)の場合、励起波長485nm、発光波長520nmを使用してください。</li>
</ol>5. プロトコルの変更
注: プロトコルの次の変更により、他のアプリケーションにサービスを提供できます。
<ol><li>線形DNAテンプレートを用いた無細胞遺伝子発現<ol>
<li>セクション4のステップを実行し、線形DNAを添加する前に、2.2 μM精製GamSタンパク質(発現および精製12)で反応を補う。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質分解を取り入れた無細胞遺伝子発現<ol>
<li>ステップ2.1では、プラスミドpACYC-FLAG-dN6-Hisを含む細胞を自動調整して使用します( 材料表を参照)。すべての成長媒体に、34 μg/mLクロラムフェニコールが含まれる。</li>
		<li>ステップ2.3では、プラスミドから発現を誘導する成長培地中に40μMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を含む。</li>
		<li>ステップ 3.2~3.4 (洗浄) を 2 回繰り返し(合計 3 回の洗浄で)、翻訳阻害剤であるクロラムフェニコールを完全に除去します。最初の2回のスケ(ステップ3.4)については、リン酸緩衝食塩(pH 7.4)でS30Aバッファーを置換する。</li>
		<li>ステップ4.2では、追加の3 mM ATP(水中100mM ATP、pH 7.2)および4.5mMマグネシウムグルタミン酸マグネシウム(水中1Mストック溶液を使用)(最終濃度)を加えて、ClpXPによる高いATP使用を補い、追加のATPによるマグネシウムのキレートを補います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>LacZベースの読出しを用いた無細胞遺伝子発現(測色を含む)<ol>
<li>手順 2.1 では、LacZ をネイティブに発現しない自動分解セルを使用します ( 材料表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>あるいは、凍結乾燥した細胞から直接、ライセートを調製する。<ol>
<li>1.1 から 3.7 までのすべてのステップを実行します。</li>
		<li>プレミックスの8.9 μLとセル懸濁液の8 μLを混合します。</li>
		<li>プラスミドDNA(必要に応じて)、他のカスタム試薬、水を加え、最終容積20μLに到達します。</li>
		<li>反応を384ウェルマイクロプレートに移し、凍結乾燥させます。 注:凍結乾燥サンプルは、最大1週間、場合によっては長く保存することができます。</li>
		<li>反応を開始するには、所望のDNAまたは他の試薬で補われた18μLの脱イオン水で再水和します。</li>
		<li>プレートリーダーの蛍光ダイナミクスに従ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>注1:細胞を自動調整することは凍結融解サイクルでの凍結を起用するように設計されているので、冷凍ストックを作るときには凍結保護剤を使用することが特に重要です。24%の質量/体積グリセロールで在庫を凍結し、-80°Cで保存しました。
注2:マグネシウムイオンとPEG 8000は、ライセート性能に不可欠です。塩基2.5xプレミックスは、以前に公開されたデータに基づいて、6 mMのグルタミン酸マグネシウムおよび4.8%のwt/vol PEG 8000を含み、最終的な反応でそれぞれ2.4mMおよび1.9%になる。ここでプロトコルで調製された自動調整物は、通常、最終反応で追加の5 mM Mg-グルタミン酸および1.5%PEG 8000で最高のパフォーマンスを発揮する。しかし、これは、追加の0-10 mM Mgグルタミン酸および追加の0〜3%PEG 8000(ベースプレミックスと比較して)の範囲で最適化することができる。推奨される追加の5 mM Mg-グルタミン酸と1.5%のPEG 8000(最終濃度)を用いてプレミックスを調製するには、1 Mで4.75 μLのグルタミン酸マグネシウムと40%の重量/体積で36.1 μLのプレミックスを混合します。

<ol><li>Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+metabolic+engineering%3A+biomanufacturing+beyond+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell.</a> Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).</li>
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<li>Fujiwara, K., Doi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+preparation+of+cell+extract+for+cell-free+protein+synthesis+without+physical+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption.</a> PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).</li>
</ol>

J.H.は、がん治療薬に焦点を当てたGenCirq Inc.の共同創設者です。彼は取締役会に在り、GenCirqに株式を持っています。

ここで説明するプロトコルは、無細胞遺伝子発現に対して非常に活性な細菌ライセートを生み出す。鍵は、細胞内に内反するラムダファージを発現するプラスミドpAD-LyseRを運ぶ細胞を使用することです。これらの細胞は、内膜の透過化時に自分自身を溶分解するように増強され、単純な凍結融解サイクルを通じて得られた細胞壁への内層リンアクセスを可能にする。細胞は効果的に自分自身をライスするので、製品は自動調整と呼ばれます。細胞がリジングされた後、残りの唯一のステップは、細胞の破片の自己起量をクリアするためにインキュベーションと遠心分離です。
細菌のライセートを製造するための他の方法と比較して、このアプローチは、特に単純かつ迅速であるが、それは、まだそれは、ライセートの品質を犠牲にしません。このプロトコルは、生産文化を接種した後、わずか1〜2時間の実習で完了することができます。分子生物学の実験室のための完全に標準ではない装置の唯一の推奨部分は30,000×gを達成することができる遠心分離機 である。しかし、同等の品質の自動調整は、低速遠心分離機(<strong class="xfig...

無細胞ライセートにおける遺伝子発現は、生細胞1、2、3、4を使用する上で、いくつかの利点がある。ライセートは生化学的に簡単に改変でき、生細胞で達成することが有害または不可能な条件で使用することができます。遺伝子発現回路は、ホスト生物学的プロセスと競合したり、競合したりする必要は一つではなく、新しい遺伝子回路のテストはDNAを追加するのと同じくらい簡単です。これらの理由から、無細胞遺伝子発現は、バイオセンサー5、6から合成遺伝子回路7、8の迅速なプロトタイピング、人工細胞9の開発まで、様々な応用を見つけた。ほとんどの無細胞遺伝子発現は、高度に処理された細胞ライセートを利用し、一般的に長く複雑なプロトコル、特殊な装置、および/または感受性の高いステップを必要とし、ユーザとバッチ10,11の間で大きな変動を引き起こす可能性がある。
この論文では、最小限の処理と専門知識を必要とする無細胞ライセートを製造するためのシンプルで効率的な方法について説明します(図1A)12。この方法は、単純な凍結融解サイクルに従ってライスするように設計された大腸菌細胞に依存する。細胞は、細胞壁を分解するファージラムダから内層分解物を発現する。細胞が成長するにつれて、この内層は細胞質に残り、細胞壁から隔離される。しかし、単純な凍結融解サイクルは細胞質膜を破壊し、子宮内膜を細胞壁を分解する周辺に放出し、細胞の分解を引き起こし、細胞の分解を迅速に生じる。このプロトコルは、わずか数時間の実践的な作業で完了することができ、冷凍庫、30,000×g(最適な結果のために;ペレットを乱さないより注意して低速を使用できる)、渦ミキサー、および簡単なバッファソリューションのみを必要とします。機能性ライセートは、細胞を凍結乾燥させてその現場で再水和することによっても生成することができる。しかし、この方法は、おそらく残りの細胞の破片のために、より低い活性を有するライセートを生成する。
ライゼートは無細胞遺伝子発現に対して非常に活性であり、最終的な使用に応じて様々な方法で増強することができる。タンパク質合成の速度は、標準的なスピン濃縮器を使用してライセートを濃縮することによってさらに増加させることができる。リニアDNAは、精製GamSタンパク質を添加することで分解から保護することができます。タンパク質分解は、振動などのより複雑な回路ダイナミクスに必要であり、自動分解物生成株13においてClpXヘキサマーを共発現させることによって達成できる。最後に、LacZ ベースのビジュアル読み出しは 、lacZを欠いている自動分解歪みを使用して有効になります。全体的に、この方法は、幅広い用途に適した高活性細胞フリーのライセートを生成する。

<table><tbody><tr><td>2xYTメディア</td><td>EMD Millipore</td><td>4.85008</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P8877または</td><td>同等の</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15遠心フィルターユニット、3 kDaカットオフ</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC900308</td><td>オプション、ライセートの濃縮に使用でき、</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>を濃縮する容量に適した濃縮器容量を選択できますA0166-5G</td><td>またはカルベニシリン、より安定したバリアント</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8937</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9501</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4282</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>CTP</td><td>United States Biosciences</td><td>14121</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>D-グルコース(デキストロース)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1749603</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>大腸菌BL21-ゴールド(DE3)は、pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99244</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21-Gold(DE3)およびDeltaを保有する。lacZ 搭載 pAD-LyseR</td><td>Addgene</td><td>99245</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7878</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>GTP</td><td>United States Biosciences</td><td>16800</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>LB 培地</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446075</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>マグネシウムSigma Aldrich</td><td>49605-250G</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6522</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>グルタミン酸カリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1501-100G</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-25G</td><td>pHを調整するための</td></tr>リン酸<tr><td>カリウム二塩基</td>性 <td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td>または同等品</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性</td><td>、Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>、または同等の</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>、Sigma、Aldrich</td><td>85558</td><td>、または同等の</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>、Fisher Scientific</td><td>9310500GM</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>tRNAミックス</td>、<td>Roche</td><td>10109541001</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>UTP</td><td>、United States Biosciences</td><td>23160</td><td>、または同等</td></tr></tbody></table>

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

Rapid, Affordable, and Uncomplicated Production of Bacterial Cell-free Lysate

無細胞遺伝子発現は、生物の合併症を伴わない生物学の力を提供する。このような遺伝子発現システムの多くは存在しますが、ほとんどは購入に非常に高価であり、また/または、効果的に生産するために特別な機器と細かく磨かれた専門知識を必要とします。このプロトコルは、標準的な実験室装置のみを使用し、最小限の処理を必要とする高レベルの遺伝子発現をサポートする細菌無細胞ライセートを生成する方法を記述する。この方法は、成長に影響を与えないが、簡単な凍結融解サイクルに続いて収穫された細胞ペレットを効率的に融解する内生リンジンを産生する大腸菌株を使用する。必要な唯一のさらなる処理は、細胞の破片の自己起質をクリアするために遠心分離に続く短いインキュベーションです。動的遺伝子回路は、収穫前に細胞内のClpXプロテアーゼの異種発現によって達成することができる。lacZ遺伝子を欠いた大腸菌株は、着色または蛍光読み出しを使用して高感度、無細胞バイオセンシングアプリケーションに使用できます。プロトコル全体は8-9時間しか必要としませんが、接種から完了までの実習作業は1〜2時間です。無細胞のライセートを得るためのコストと時間を削減することによって、この方法は、様々なアプリケーションのための無細胞遺伝子発現の手頃な価格を高める必要があります。

代表的な結果は、構成的に発現するプラスミドからGFPを発現するために自己分解物を用いることによって観察され得る、ここでpBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500、およびGFP蛍光の時間経過をプレートリーダーに記録する(図1B)。プラスミドDNAの希釈系列は、1nM DNAでも強い発現を発見した。市販のライセートと比較して、オートリセートは、GFP時間経過の時間誘導体として計算された、より大きな総収率を生成し、より大きな最大生産率を達成することができる(図1C、D)。この方法を使用したその他の結果については、Didovykら12を参照してください。このプロトコルの障害ポイントは比較的少ないです。しかし、自己増殖物が細胞デブリを十分にクリアしないと、最適でない結果が得られる。最適な結果は、LYSATの各バッチに対してPEG-8000およびMg2+の濃度を最適化する必要があります(注2参照)。...

このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌 の設計された株を使用し、標準的な実験装置のみを必要とする、無細胞遺伝子発現のための細菌リセートを生成するための迅速かつ簡単な方法を記述する。

Cell-free gene expression offers the power of biology without the complications of a living organism. Although many such gene expression systems exist, ...

このプロトコルを使用すると、高品質の細菌細胞ライセートは、広く利用可能な一般的な実験室装置のみを使用して製造することができ、ほとんどの研究者が無細胞遺伝子発現を容易に利用できるようにします。プログラムの細胞の自己起液を凍結融解または凍結乾燥サイクルと組み合わせることで、無細胞遺伝子発現のための細菌のライセートを迅速に生産するための実用的で手間と費用対効果の高いアプローチを作成できます。接種ループを使用して、自己融解大腸菌株の細胞を1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを含むLB寒天プレートにストリークし、一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、ピペットチップを使用して、寒天プレートから単一のコロニーを選び、アンピシリンを含むLB培地を含む培養管に加える。このスターターカルチャーを一晩で摂氏37度で育ててください。翌日、400マイクロリットルのスターター培養液を1リットルのエルレンマイヤーフラスコに加え、2xYTPG培地の400ミリリットルを含み、ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラムを添加する。300 RPMで振ると37°Cで培養します。分光光度計と1センチメートルのパス長を持つ光学キュベットを使用して、600ナノメートルで培養物の光学密度を定期的に測定します。光学密度が1を超えた場合、測定前に培養物を5倍希釈し、測定が典型的な実験室分光光度計の線形範囲内に留まることを確認します。5倍希釈培養の光学濃度が0.3に達したら、培養器からフラスコを取り出し、リセートの調製に進みます。ライセートを調製するために、1,800xgで遠心分離により細胞を室温で15分間収穫する。上清を注ぎ、ピペットを使用して残りの液体を取り除きます。45ミリリットルの冷たいS30Aバッファーをペレットに加え、渦によってペレットを再懸濁する。次いで、細胞をチューブに移す前に、空の50ミリリットル遠心管を秤量する。再び細胞を遠心分離し、上清を捨てます。ピペットを使用して残りの上清を吸引する。チューブの重量を再測定し、表示された重量から空のチューブの重量を差し引いてペレットの重量を得ます。細胞ペレットの1ミリグラムごとに, 2 ミリモルジチオトレイトールを補った冷たい S30A バッファーの 2 マイクロリットルを追加します。.次に、激しい渦を流して細胞を再懸濁する。次に、ペレットが完全に凍結するまでマイナス20度またはマイナス80度の冷凍庫に入れて細胞を凍結し、室温の水浴で細胞を解凍し、2〜3分間激しく渦を抜けます。300 RPMで揺れで45分間摂氏37度で細胞をインキュベートし、透明遠心管で30,000 x gの遠心分離機で45分摂氏4度で重い細胞の破片のサンプルを取り除きます。慎重にペレットを乱さないよう注意して、ピペットで新しいチューブに上清を転送します。移管された上清がペレットからの材料で汚染されている場合は、遠心分離を繰り返します。上清を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。そして、遠心分離機は21、000 x gまたは5分間卓上遠心分離機の最高速度でもう一度。アリコートクリアされた自動調整は、所望のボリュームにし、使用するまでマイナス80度で保存します。自己駆処理を用いた無細胞遺伝子発現の場合、8マイクロリットルの自己自動処理物と8.9マイクロリットルのプレミックスを氷上に混合します。DNAを8ナノモルの最終濃度に加え、他の必要な試薬と水を加え、20マイクロリットルの最終体積を得る。384ウェルマイクロプレートに反応を加え、プレートリーダーを使用して蛍光時間の経過およびエンドポイントを測定します。血漿DNAの希釈系列を用いた自己溶解物を用いたGFP発現は、ナノモルDNAを1個でも強く発現する。市販のライセートとオートリセートの間でGFP発現を比較すると、オートリセートは同等のレベルのGFPを産生した。異なる研究者によって2つの異なる実験室で作製されたライセートのバッチ間の変動は、約2倍以内であった。3つの最も重要な変数は、細胞ペレット対緩衝比であり、デブリを含まない上清を移動し、最終的な反応で最適なPEGおよびマグネシウム濃度を使用します。抽出が準備されると、ClpXP媒介劣化やAHL媒介クォーラムセンシングなど、大腸菌細胞フリー発現システム用に開発された既存のプロトコルの大規模な兵器を使用できます。

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生物学

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

出典: Wiegand、DJ、 et al。 急速に増殖する細菌ビ ブリオナトリゲンを用いた無細胞タンパク質の発現。 J. Vis. Exp. (2019)。このビデオでは、 Vibrio natriegens 粗ライセートに基づく細菌の無細胞タンパク質発現システムを使用して、in...

細菌粗細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質発現

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in...

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

無細胞発現系は、ハイスループット合成と重要なタンパク質のスクリーニングのための強力かつコスト効率の高いツールです。ここで、mRNA のテンプレート、線形 DNA プラスミド DNA を使用して急速な蛋白質の生産のビブリオ...

無細胞タンパク質式を使って急速に成長している細菌ビブリオ natriegens

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。...

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

標準的な実験装置を用いて組換え純粋な無細胞TX-TLシステムを製造するための迅速かつ費用対効果の高い方法を提示します。...

ワンポット純粋な無細胞システム

この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。...

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。...

無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

Leishmania Translational Extract(LTE)は、単細胞寄生虫である Leishmania...

リーシュマニアタレントラエ由来の無細胞タンパク質発現システムであるLTEの作製と最適化

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

我々は、バッチ間のばらつきを最小限に抑えるために細胞増殖を制御することに焦点を当て、OnePot「組換え要素を使用したタンパク質合成」(PURE)システムおよび無細胞タンパク質合成用の粗リボソームを生産するための最新のプロトコルを提示します。...

再現性のある無細胞タンパク質合成のためのOnePot PUREおよび粗リボソーム生産の精製

学ぼう、細菌無細胞リザートの迅速かつ低コストな生産法。Escherichia coliを用いてGFP発現を確認し、バッチ間変動が2倍以内の再現性を実現。標準的な研究室で容易に実施可能な手法です。

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

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