Name: 慢性および急性イン ビボ 記録用炭素繊維微小電極アレイの構築と実装 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学ぶ 炭素繊維微小電極アレイの構築法。マウスやフェレットの脳における慢性・急性の神経活動記録に適用し、高品質な電気生理学的データを安定して取得する手法を解説します。

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グレッグ・ギッチュンツの電極設計と建設に関する指導と、研究室と施設を開放してくれたティム・ガードナーに感謝します。私たちは、16チャンネルのジグの初期バージョンを設計する際に、バイオインターフェイスとテクノロジーのコア施設とニール・リッター、ジョン・スパイレアス、デビッド・ランデスマンでのPDS使用に関する彼の支援をしてくれたクリスト・ミハスに感謝したいと思います。ハーバード大学ナノスケールシステムセンターでのSEMイメージングの支援に対するティム・キャバナウの支援に感謝します。

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著者らは金銭的な利益相反を宣言しない。

このプロトコルは、急性および慢性使用の両方に対して機能CFEAを構築するために必要な各ステップを記述する。説明されたプロセスは、研究者のニーズに合わせてカスタマイズ可能であり、数ヶ月にわたって単一のニューロンを監視するためのアクセス可能で安価なオプションとなっています。このプロトコルは、麻酔動物への移植から数分以内に堅牢な単一ユニット活性を記録し、目を覚まし、動物を振る舞い、これらのCFEAが神経応答の短期的および長期的な変化を研究する可能性を示す可能性を示す。
記述されたプロトコルのステップは、数ヶ月にわたって密かつ安定的に明確な単一ユニットを記録する機能を備えた、低限界コスト(<$100.00)で迅速に完了できる効率的な手順を実現するために、時間の経過とともに徹底的にテストされ、改善されました。建設ステップは1日未満で完了することができ、任意の主要な商業アレイに匹敵する電気生理学的信号を生成します。CFEAは、同様の商用アレイよりもはるかに小さなフットプリント(繊維の16チャネルバンドルは直径が〜26μm)を有し、その生体適合性は、それらを長期使用13に適している。重要なのは、同等のパフォーマンスを持つ機能する CFEA を生成するために従わなければならないいくつかの重要なステップと指示があることです。
炭素繊維の脆弱性のため、細心の注意を払って取り扱う必要があります。鋭利な鉗子や他の道具で取り扱うと、繊維が破損する可能性があります。また、繊維が吹き飛ばされないように、空気の動きが限られた空間にCFEAを構築することが重要です。繊維の背面部分を炎上する場合、ライターは約1 sの間、非常に短く前後の動きで移動する必要があります。絶縁のこの除去に続くステップは、作業チャネルを持つ電極を構築するために重要です。炎の先端は付加的な接触なしで治具に供給されるべきである。次に、洗面器を歯科用セメントで満たす場合、セメントを慎重に塗布し、チャネルと漏斗流域を完全に満たし、それらを充填せずに開口部を閉じることが重要です。歯科用セメントは、続行する前にUV光で完全に硬化する必要があります。これが完了したら、銀色の塗料は、完全に充填されたが、こぼれ落ちるまで、各チャネルに注入する必要があります。これはプロセスの中で最も可変的なステップです。オーバー充填は、チャネル間のクロストークを生成することができ、不十分な充填は、接続障害につながる可能性があります。25G針を使用して銀色の塗料を注入できない場合、溶液が粘性過多である可能性が高く、この場合、少量の塗料シンナーを添加してより流動的な溶液を作成することができます。すべてのチャネルが充填され、ヘッドステージコネクタが挿入されたら、歯科用セメントでコネクタを固定する前に、アレイが24時間硬化できるようにすることが重要です。そうしないと、接続されたチャンネルの数が減少することがわかりました。信号取得システムとの接続時にコネクタが切れないように、寛大な量の歯科用セメントを塗布することも重要です。それらが切り離された場合、銀色のペンキでチャンネルの繰り返し充填で再接続を試みることは可能ですが、ユーザーはCFEAのインピーダンス値をテストして、接続されたチャンネルの数を評価する必要があります。歯科用セメントを一晩硬化させることは、潜在的な剥離を防ぐのにも役立ちます。
電極のインピーダンスを測定すると、接続されたチャンネルの正確な推定が得られます。これは、地盤と参照線と炭素繊維先端をPBSに浸した後に行うことができます。高インピーダンス(>15 MΩ)は、開いた未接続のチャネルを示しています。電流と電気めっきを注入する前に、接続されたチャネルは、このプロセスで大幅に減少する必要があるインピーダンス値の範囲を持つことができます。16チャンネル電極あたりの接続チャネル数(電流インジェクション後のインピーダンス<4 MΩ)の平均は12.96±2.74(平均sD±。N = 48電極)。多数の電気めっき時間を試験し、30sが記録部位間で優れた信号絶縁を生み出した(図5)。PEDOT-pTS12、24、25、26およびPEDOT-TFB21が炭素繊維記録部位を準備するための信頼できるオプションを提供することは十分に確立されているが、我々は金でめっき、慢性注入のための電気めっき電極のための実証済みで信頼できる方法27、28を発見した。、移植の容易さを増加させ、電極先端が一緒に凝集するのを防いだ。この方法は、平均で0.2MΩ未満の最終インピーダンス値を生成する上で、PEDOT-TFB21およびPEDOT-pTS26を使用して達成された値に匹敵することを証明する。
マイクロ電極アレイを埋め込む際には、顕微鏡下での炭素繊維先端の挿入を視覚的に追うことが重要です。正常な挿入は、繊維の曲げなしで、明らかであるべきです。繊維が座屈しているように見える場合は、脳に正常に入る可能性は低いです。この場合、プローブの角度は 2 回目の試行に合わせて調整する必要があります。このプロセスは、プローブの挿入が成功するまで続行できます。電極が所望の深さになると、少なくとも30分待つと、プローブが最適な信号取得(急性記録)のために解決できることがわかりました。
CFEAは、小型フットプリントとバイオ互換性に加えて、建設の容易さと低コストのために、商用アレイに対して堅牢でカスタマイズ可能な代替手段を提供します。このプロトコルで詳細に説明されている CFEA の最大の制限は、そのスケーラビリティです。その構造の手動の性質のために、何百もの記録サイトを持つ設計にスケールアップすることは実用的ではないかもしれません。さらに、ナノテクノロジーを用いた微小電極アレイ製造の進歩により、ここで説明する方法よりも大規模な集団記録が可能になります。しかし、このプロトコルは、炭素繊維電極のベンチトップ製造に関心のあるラボにCFEAアクセシビリティを提供します。我々は、その時間スケールでの我々の観測の典型的な代表的な単一チャネルによって示されるように、120日間の慢性実験の間にスパイク振幅の安定性の損失または減少した堅牢性を観察しなかった(図6A-E)。さらに、CFEAは、マウスに移植してから11ヶ月後に4つの単一ユニットが識別可能であったため、持続的な単一ユニット活動の能力を示しています(図6G,H)。また、短期間での単一ニューロンの研究において、他の多くの市販電極に対して利点を提供する、安定した単一ユニットの記録を鋭く得ることができる(図7)。将来的には、このような柔軟で生体適合性の低いプローブの開発は、複雑なプロセスの研究を可能にします。これらのツールは、継続的で長期的な安定性を必要とする脳と機械のインターフェース(BM)でのアプリケーションを含む、神経技術の進歩に大きな有用性を提供します。

電極と電極アレイは、脳が神経レベルで情報を処理する方法を理解するための貴重なツールです。電気生理学的記録は2世紀以上にわたって達成されてきましたが、個々のニューロンのスパイクを捉えるために必要な空間的および時間的解像度で神経回路全体の活性を同時に測定することはまだ不可能です。脳波2、陽電子放射地形3、および機能的磁気共鳴画像4のような非侵襲的な方法は、脳全体の測定を可能にするが、それらは、神経回路2、5の活動を解決するために必要な空間的および時間的分解能を達成することができない。対照的に、電圧感受性色素や遺伝的にコード化されたカルシウム指標を用いた光学イメージング法は、単一単位の空間分解能を達成することができるが、低い時間的分解能と低い選択性3、4、5、6などの問題を引き起こす。電気録音は、これらの方法に代わる強力な方法です。記録電極は比類のない時間分解能を提供し、ユーザーが脳の任意の領域でスパイク時間の精度で測定を行うことを可能にする 7.さらに、慢性的に埋め込まれた多電極アレイ(MEA)は、大規模な(数十〜数百の細胞)、1つの細胞記録を、数日から8ヶ月にわたって動物を振る舞うことを可能にする。しかし、高密度で記録するシリコンプローブは、フットプリントが大きく、非常に侵襲性が高く、かつ慢性的に埋め込まれたアレイは炎症応答、組織カプセル化、および神経死10、11、12、13を生成することが多い。
既存の電極の限界は、安定した、高解像度、長期的な記録を可能にする最近の革新をもたらしました。典型的な電極は、タングステンや白金イリジウムなどの金属導体から成り、またはシリコンまたはポリマーベースである。金属ベースのマイクロワイヤアレイは、長期間、安定した録音を維持することができますが、10-200 μm14の範囲の単一のワイヤの直径で、はるかに大きなフットプリントを持っています。対照的に、シリコンベースの電極アレイは、高い空間分解能で記録を得るが、比較的堅い設計のために、それらは一般に、15ヶ月にわたって同じニューロンからの信号および記録を維持することができない。シリコン系アレイの最近の発展は、慢性的な記録を確実に行うことができる電極をもたらしたが、これらのアレイは、より大きな動物の深部脳領域からの記録に使用することができず、線形記録9を目的としている。ポリマーアレイの進歩により、単一ユニットの柔軟性と記録安定性が向上し、近い将来に高密度記録の可能性を提供しますが、現時点では可用性は限られています8,16,17.炭素繊維は、ここで説明する既製材料で高密度の記録を可能にします。
炭素繊維記録マイクロ電極は、ガラスマイクロピペットに挿入された単一の炭素繊維からなる最初の炭素繊維電極で、何十年も使用されてきました。これらの微小電極は、単一単位の細胞外記録に使用され、シグナル対ノイズ比は最高のタングステンガラス微小電極に匹敵するものであったが、柔軟性、低インピーダンス値、および18,19を製造する簡素さのために有利であった。炭素繊維のバイオセンシング能力により、炭素繊維電極アレイの開発が加速しました。生体適合性の増加と優れた電気伝導性に加えて、高温抵抗、低相対密度、高い引張強度、低屈曲剛性、高検出感度、および小さな断面積10、12を含むユニークな特性のセットを備えています。これらの特性のすべては、単一のニューロンの慢性的で安定した、高収率の記録を容易にする炭素繊維微小電極アレイ(CFEAs)の開発を動機づけています。このようなCFEAは、手で作製することができます20,21 (図 1), 数ヶ月にわたって単一のニューロンを保持することができる微小電極アレイを生成.ここに記載されているCFEAのアクセス可能な構築プロセスは、2つの種における個々のニューロンの急性および慢性の記録のために2つの方法で適応されている。

<table><tbody><tr><td>#10 メス刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-840-15</td><td>建築工具</td></tr><tr><td>16チャンネル CFEA ジ</td><td>グリアライズ株式会社</td><td></td><td>CFMAコンポーネント</td></tr><tr><td>16チャンネルOmneticsコネクタ</td><td>Omnetics</td><td>A79014-001</td><td>CFMAコンポーネント</td></tr><tr><td>25G針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-840-84</td><td>ビルディングツール-先端が鋭い</td></tr><tr><td>30Gニードル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-841-03</td><td>ビルディングツール</td></tr><tr><td>31 Gステンレス鋼304皮下丸チューブ</td><td>スモールパーツ株式会社</td><td>B000FMYN38</td><td>ガイドチューブ用</td></tr><tr><td>32chCFEA治具</td><td>株式会社リアライズ</td><td></td><td>CFMAコンポーネント</td></tr><tr><td>32チャンネルオムネティクスコネクタ</td><td>オムネティクス</td><td>A79022-001</td><td></td></tr><tr><td>綿チップアプリケーターの</td>CFMAコンポーネント6 フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-156</td><td>ビルディングツール</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A16P4</td><td>ビルディングツール</td></tr><tr><td>AutoCad 3Dプリントソフトウェア</td><td>オートデスク</td><td></td><td>コンピュータ支援設計ツール/3Dモデリングソフトウェア</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Computer-aided design tool/ 3D modeling software</td></tr><tr><td>BD disposable syringes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-30</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Carbon fibers</td><td>Good Fellow USA</td><td>C 005725</td><td>7 &mu;m エポキシサイズの</td></tr><tr><td>カセットとカセットホルダー</td><td></td><td></td><td>繊維のコーティング用</td></tr><tr><td>クリアテープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td>生繊維のコーティング用</td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td></td><td></td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td>生繊維のコーティング用</td></tr><tr><td>流動性 デンタルコンポジ</td>ット <td>ペントロン</td><td>Flow-It ALC</td><td>CFMAコンポーネント/ UV硬化歯科用セメント</td></tr><tr><td>金メッキ溶液</td><td>Sifco ASC</td><td>5355</td><td>10.0-20.0%グリセロール、1.0-5.0%エチレンジアミン、1.0-5.0%酢酸(エチレンジニトリロ)テトラ-、ジカリウム塩、5.0-10.0%ブタン酸、メルカプトモノゴールド(1+)ナトリウム塩、1.0&ndash;5.0% メタ重亜硫酸カリウム、55.0-82.0% 水</td></tr><tr><td>ジュエリークランプ</td><td>アマゾン</td><td>B00GRABH9K</td><td>構築ツール</td></tr><tr><td>JRClust</td><td></td><td></td><td>フェレットスパイク選別ソフトウェア</td></tr><tr><td>ライター</td><td>BIC</td><td>LCP62DC</td><td>構築ツール</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サイエンティフィカ</td><td>PS-7000C</td><td>ガイドチューブ用</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-953-1B</td><td>構築ツール</td></tr><tr><td>MountainSort</td><td></td><td></td><td>マウススパイク選別ソフト</td></tr><tr><td>NanoZ 16チャンネルアダプター</td><td>マルチチャンネルシステム</td><td>ADPT-nanoZ-NN-16</td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>NanoZ 32チャンネルアダプター</td><td>ホワイトマター</td><td>NZA-OMN-32 rev A</td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>NanoZ 多電極インピーダンステスター</td><td>ホワイトマター</td><td></td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャー ストックルーム</td><td>13-374-10</td><td>粘着特性を持つ半透明、柔軟なフィルム</td></tr><tr><td>パリレン「C」ダイマー</td><td>特殊コーティングシステム</td><td>980130-C-01LBE</td><td>原繊維のコーティング用</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>25322-68-3</td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>電気めっき部品</td></tr><tr><td>ポリイミドチューブ</td><td>マイクロルーメン</td><td>BRAUNI001</td><td>ガイドチューブ用</td></tr><tr><td>回転工具</td><td>ドレメル</td><td>300124</td><td>ガイドチューブ用</td></tr><tr><td>メスハンドル</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td>ビルディングツール</td></tr><tr><td>銀導電性コーティング</td><td>MGケミカル</td>ズ <td>842AR スーパーシールド</td><td>CFMAコンポーネント</td></tr><tr><td>レンジ6.7:1の実体顕微鏡</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>ビル工具</td></tr><tr><td>付箋</td><td>貼付</td><td></td>物 <td>建築工具</td></tr><tr><td>ティッシュペーパー</td><td>キムテックサイエンス</td><td>34155</td><td>製作工具</td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>A-Mシステムズ</td><td>797550</td><td>CFMA部品</td></tr><tr><td>UV硬化ワンド</td><td>キツツキ</td><td></td><td>製作工具</td></tr><tr><td>真空蒸着室</td><td>スペシャルティ・コーティング・システム</td><td></td>ズ <td>ラボコーター2(PDS 2010)</td></tr></tbody></table>

慢性および急性イン ビボ 記録用炭素繊維微小電極アレイの構築と実装

Construction and Implementation of Carbon Fiber Microelectrode Arrays for Chronic and Acute In Vivo Recordings

多チャンネル電極アレイは、働く脳に関する洞察を提供し、単一細胞および回路レベルで神経プロセスを解明するのに役立ちます。これらのツールの開発は、複雑な行動や認知を理解し、臨床応用を進めるために重要です。しかし、長期間にわたって細胞集団を安定的かつ継続的に記録することは依然として課題である。テトロードやシリコンアレイなどの多くの一般的な電極は、挿入時に損傷を引き起こす大きな交差直径を特徴とし、神経死に関連する慢性反応性組織応答を引き出し、安定した連続的な神経活動の記録を妨げる。さらに、ほとんどのワイヤバンドルはチャネル間の広い間隔を示し、小さな領域に集まった多数の細胞からの同時記録を排除する。このプロトコルに記載されている炭素繊維微小電極アレイは、これらの懸念に対するアクセス可能なソリューションを提供します。本研究は 、生体内の急性および慢性記録の両方に使用できる炭素繊維微小電極アレイを作製するための詳細な方法を提供する。これらの電極の物理的特性は、高いセル密度で安定した連続的な長期記録に最適であり、研究者は数ヶ月にわたって単一のユニットから堅牢で明確な録音を行うことを可能にします。

このプロトコルの完成により、単一ユニットのスパイク活動の安定した記録が可能になります。これらの微小電極アレイは、研究者のニーズに基づいて、材料、チャネル数、およびヘッドステージアダプターでカスタマイズ可能です。金の電気めっき繊維は、記録に適したインピーダンスの減少をもたらす(図4 および 図5)。ユーザーが慢性的に記録する場合は、動物が外科的処置から回復した後に測定を行うことができます。慢性的な手順は、少なくとも120日間、安定した単一ユニットの記録をもたらしました。図 6に代表的な記録を示す、自由に振る舞う成人雄マウスの後splenial皮質における安定な64チャネル電気生理活性を示す。急性の調製が意図されている場合、記録は、移植後すぐに開始することができます(〜30分)。これは、電極が脳に落ち着く時間を可能にします。 図7 は、成人雌フェレットの一次視覚皮質から取得した急性16チャネルCFEA記録の代表例を示す。マウスとフェレットでのスパイクソートは、スパイクソートソフトウェアで行いました( 資料表を参照)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig01.jpg"> 図1:16チャネルおよび32チャネルの炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の解剖学(A)32チャネル(上)および16チャンネル(下)CFEAの3つの異なる図からの回路図。16チャネルCFEAは処理を目的とした拡張設計を特徴としています。32チャネル設計は64チャネルCFEAのために2つのジグを結合することを可能にする平らな面を特色にする。どちらの図にも、ディメンションでラベル付けされた識別構造があります。コネクタの端点はコネクタ挿入の位置を示し、GND/REF チャネルは接地線が挿入される場所を示します。漏斗流域は、繊維がUV光硬化歯科セメントで重ね合わされる場所を指し、漏斗先端は繊維が治具から出る場所を意味する。じょうごチップは、繊維が一緒にしがみつき、損傷を引き起こし最小限に抑えるために、象限に分割されます。繊維は後で歯科用セメントの使用と単一の束に引っ張られる。ジグはSLA樹脂プリンターを使用して3Dプリントされています。図は、詳細を表示するために拡大されます。(B) CFEA を構築した。図には、ラベル付けされた識別構造があります。青い束の先端は記録測定を得るカーボン繊維の区分を表す。漏斗盆地内およびコネクタの周囲の灰色は、漏斗盆地に炭素繊維を保持し、ジグへのコネクタを固定するUV光硬化歯科セメントを示しています。紫色のワイヤーは接地線を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig02.jpg"> 図2:パリレンCコーティング用のカセットへの生炭素繊維のローディング(A)カーボンファイバーは、両面テープ(青)の2つのストリップを重ねたカートリッジに積み込まれます。各カセットには~25繊維が積まれています。(B)カセットは、パリレンCコーティングの準備としてレーザーカットホルダー(グレー)に積み込まれます。それぞれに10個のカセットが入っています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig03.jpg"> 図3:炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)束構造図:(A)16個体、被覆炭素繊維(黒)を32チャンネル3Dプリントジグ(グレー)に通す。(B)カーボンファイバーチップをマイクロハサミで切断し、余剰繊維を治具ベースの高さに等しく残し、治具ベースから伸びる。(C)標準のプラスチック製スパークホイールライターは、パリレンC絶縁体を除去するために、余分な繊維の上に素早く渡されます。右上の図は、12繊維のうち9本からパリレンを除去した図である。(D)繊維は、繊維の端部がベースと同じになるまで、治具に再挿入されます。右上の図は、治具ベースの内側に収納された非絶縁(灰色)繊維チップを持つ9本の繊維の再挿入を示しています。その後、ジグが反転し、ステップA-Dが逆の16チャンネルをスレッド化するために繰り返されます。(E) 治具は繊維を固定するために歯科用セメントで満たされている。銀のプリントは、治具ベースの各ウェルに注入されます。(F) オスコネクタが治具ベースに挿入される。(G)CFEAおよびメスは-20 °Cの冷凍庫で凍結される。配列の先端は望ましい長さに切り取り、32個の繊維を残す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig04.jpg"> 図4:先端処理と電気めっき(A)電極先端は、まず0.1MPBSに入れ、そこで電流が各電極を通過する。その後、チップをすすいで金メッキ溶液に移し、電流で電気メッキします。(B)調製炭素繊維のSEM画像は、先端に濃縮された金めっき液を示す。スケールバーは、最初の切断後の168チャンネルからの4μm(C)インピーダンス値を表します(紫色; 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ、中央値±SE、n = 168繊維、正の電流注入(ピンク;1.23 MΩ±0.36 MΩ、中央値±SE、n =168繊維)、および電気めっき(オレンジ;0.19 MΩ±0.15 MΩ、±中央値SE、n=16繊維)が各インプダンス値を減少させます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig05.jpg"> 図5:適度な金の電気めっき期間は炭素繊維束の先端に小さく、丸みを帯びた沈着物を作り出す。描かれている炭素繊維の先端はすべて異なるマイクロ電極アレイから、インピーダンス低減または金めっきのために注入された電流の異なる持続時間を反映しています。画像はさらに、炭素繊維を絶縁し、繊維の先端以外の場所からの信号の取得を防ぐパリレンCコーティングを示しています。(A)凍結後の炭素繊維先端の走査型電子顕微鏡画像を、カミソリの刃で1回カットした。スケールバーは10 μmを表しますが、その後10秒(C)Bに正の電流を注入した後、5秒(C)の金で電気メッキを行い、Bと同じですが、15s(E)の金で電気メッキを行いました。我々は、-0.05μAの電流で30sの電気めっきが電気生理学的記録に最適であることを発見した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig06.jpg"> 図6:炭素繊維微小電極アレイを用いたマウス後splenialの自由な振る舞いにおける慢性細胞外記録は、持続的で安定した神経活動を示す。(A)11個のバンド通過電圧トレースが同時に記録された。最初のチャンネル(上の行)から記録された後続のトレースは、時間の持続性を示すためにBにプロットされます。残りの 10 行は、記録品質の一貫性を示し、アレイ全体での堅牢なアクティビティを示します。各トレースの左側にあるスケールバーは、200 μVの電位を表します。(B) A の上部トレースと同じファイバーからのバンドパス データが拡張され、120 日間の連続記録での活動が安定して表示されます。(C) クラスタリングは、数ヶ月にわたって堅牢な単一ユニット検出を明らかにします。トレースは、120日間にわたって連続観測可能な代表単一ユニットの平均波形を表し、各時点でBでプロットされた繊維から抽出される。(D) C からの平均、正規化されていないスパイク波形は、時間の経過に関する一貫性を示すために積み重ねられます。(E)炭素繊維の記録は、何ヶ月もの間安定したノイズフロアを示します。Bのノイズフロアの標準偏差(トレース-スパイク活動)は、ノイズにプログレッシブ変化を示しません。バーは平均汚染を表します。誤差範囲は標準偏差を表します。(F)慢性的に埋め込まれたCFEAとヘッドステージを持つマウスのスケール描画。(G)埋め込み後11ヶ月の生電圧トレース(上)は、堅牢なLFPを示す。バンドパス電圧トレース(下)は、安定した神経活動を示します。(H)Cから繊維に記録されたニューロンの平均スパイク波形は、スパイク活性の最初の1,000の発生率によって下敷きである。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62760/62760fig07.jpg"> 図7:フェレット原型視皮質からの炭素繊維微小電極アレイ(CFEA)の記録 (A) 16チャンネルCFEAから記録されたスパイクソートされた単一ユニットの波形。単一ニューロンからの作用電位は、多くの場合、わずかに異なる振幅で複数のチャネルで明らかであった。(B)選択したニューロンからの方向調整曲線。色は Aの記録された単位に対応しています。矢印は刺激運動の方向を示す。スケール バーは応答率を示します。誤差範囲は、標準誤差を伴う平均応答を示します。水平破線は、空白スクリーンへの露出中の同じセルの自発的な発射率を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62760/62760fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルは、マウス(Mus musculus)およびフェレット(ムステラ・プトリウス・フロ)を複数の脳領域から慢性および急性の生体内電気生理学的記録に対して炭素繊維微小電極アレイを構築する手順を説明する。各ステップは、マイクロ電極アレイ移植に生炭素繊維を購入した後、微小電極アレイ構築に重点を置いて詳細に説明される。

Multichannel electrode arrays offer insight into the working brain and serve to elucidate neural processes at the single-cell and circuit levels. ...

ここで説明するベンチトップの構造は、ニューロンの密集したクラスターからの記録を可能にし、時間の経過とともにそれらのニューロンの多くを従う数少ない現在利用可能な電極技術の1つです。炭素繊維マイクロ電極アレイは、構築するために安価です。彼らは小さく、生体適合性があり、脳と一緒に移動し、健康で安定した録音を可能にします。炭素繊維は非常に薄く、最初は見るのが非常に難しいです。しかし、彼らと一緒に働いて数日後、彼らは操作しやすくなります。まず、カセットの2つの長い側面に両面テープを敷き、テープの端をカセットの内側の端に合わせます。炭素繊維操作ツールを準備するには、30ゲージ針の周りに接着剤フィルムの小片を包み、フィルムと鋭いが柔軟なポイントを形成します。次に、個々の繊維を焼いた束から分離し、2〜3ミリメートルの距離を保つカセットの短い側と平行に置きます。各カセットに20~30本の繊維を取り付けた後、二重棒テープの上に透明なテープを敷いて所定の位置に繊維を密封し、充填されたカセットをカセットホルダーに入れる。炭素繊維マイクロ電極アレイを組み立てるには、各接地線をジグのコネクタ端の適切なチャネルを通して給電を開始し、両端が等しい長さになるまで続けます。その後、ジグ上でそれらを確保するために一緒にそれらをねじる。UV硬化した歯科用セメントを適用してワイヤを固定し、ワイヤが供給される場所から開水路内で歯科用セメントを取得しないようにします。UV硬化杖を使用して、20秒間歯科用セメントを硬化させ、コネクタの端、洗面器、漏斗先端が見えるように治具と悪徳を揃えます。次に、じょうごがユーザーから離れ、コネクタがユーザーに向かって終了するように、ジグの向きを設定します。次に、25ゲージの針先を潜在的な繊維除去部位のカセットに対してスライドさせ、カセットから単一の炭素繊維を切断します。炭素繊維工具を使用して繊維の切り込み自由端を保持し、針を使用して、カセットから繊維のもう一方の端を切り取ります。その後、再び炭素繊維ツールを使用して、一方の端がツールから約1センチメートルの長さになるように炭素繊維を拾います。繊維付属の炭素繊維工具を使用して、ジグの中央流域から漏斗片を通して繊維の短い端を供給します。繊維の長さの大部分が通るまで、ジグ漏斗を通して繊維を供給し続けます。炭素繊維ツールを使用して、利用可能なチャネルを通してファイバーの背面部分を供給します。約5ミリメートルの繊維が突き出るまで背中を通して供給し続けるか、必要に応じてサイズにカットします。コネクタ端の絶縁を取り外すために、露出した繊維の上に炎を渡すために、標準的なスパークホイールライターを使用し、その後、炎の繊維部分が今、ジグの背面から突き出ないようにしながら、チャネル内に炎の繊維部分が供給されます。海口と漏斗の開口部をカバーし、全体の流域を埋めるために、治具の洗面体繊維にUV硬化歯科セメントを適用します。副から治具を取り外し、漏斗が下向きになるように治具を配った後、コネクタの端点を上に向けて治具を固定します。針に銀のプリントを充填し、歯科用セメントで止まるまで針を1つのチャネルに慎重に挿入します。チャネルを塗料で満たすには、チャネルから針を取り外しながらゆっくりと注射器を押し下げ、綿の先端アプリケーターを塗料シンナーに浸し、任意の塗料のジグ表面のベースをきれいにします。次に、ピンをチャンネルに合わせて適切な方向にヘッドステージコネクタを挿入します。ヘッドステージコネクタがまっすぐ直立し、可能な限り治具に流され、ヘッドステージコネクタが治具と出会うエッジに沿って歯科用セメントを塗布し、20秒間UV硬化して、ジグにヘッドステージコネクタを固定します。電極先端を所望の長さに切断するために、漏斗先端が完全に水没し、表面に正常に保持されるまで、電極を脱イオンまたは蒸留水のビーカーに下げます。次に、水から電極を取り除くことによって、個々の炭素繊維を一緒に持って来ます。繊維がガイド面にフラッシュして、繊維を回転運動でメスで所望の長さに切断し、適切なアダプターを使用して電極を多電極インピーダンステスターに取り付け、インピーダンスをテストするように電極を置きます。電極先端を0.1モルPBSのマイクロ遠心分離管に約2ミリメートル下げ、マイクロ遠心分離管に接地線を挿入します。電極先端のインピーダンスを低減するには、選択した振幅と持続時間で正の電流を注入し、脱イオンまたは蒸留水で繊維を洗浄して洗浄します。次に、金めっき液中で電気めっきを行い、電極束先端をめっき混合物中のマイクロ遠心チューブに約2ミリメートル下げ、接地線をマイクロ遠心チューブに挿入する。次に、電気めっきに適切なパラメータを設定します。電気めっき後に脱イオンまたは蒸留水で繊維を十分に洗い流してください。調製した炭素繊維の代表的なSEM画像は、先端に濃縮された金めっき液を示した。金での繊維電気めっきは、記録に適したインピーダンスの減少をもたらした。初期切断後の300チャンネルからのインピーダンス値、正電流注入、および電気めっきは、各処理工程後のインピーダンス値の低下を示した。適度な金の電気めっき期間は炭素繊維束の先端に小さく、丸みを帯びた沈着物を作り出した。また、成人マウスの雄マウスを自由に振る舞う後足皮質における安定な64チャネル電気生理活性を解析した。この結果は、記録品質、堅牢な単一ユニット検出、正規化されていないスパイク波形による経常的な一貫性、および安定したノイズフロアの一貫性を実証しました。また、移植後11ヶ月経った生電圧は、堅牢な局所電界電位を示した。成人雌フェレットの一次視覚皮質から取得した急性16チャネル炭素繊維微小電極アレイ記録の代表例もここに示す。炭素繊維微小電極アレイは、脳内の近くのニューロンを長期間にわたって短期間または慢性的に記録することを可能にし、神経回路を理解するために不可欠です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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