大小眼の網膜機能を研究するための Ex Vivo 網膜電図のセットアップと条件の最適化
2022年6月27日
既存の多電極アレイまたはパッチクランプ装置の改造により、 ex vivo 網膜電図がより広く利用できるようになります。 生体外 光応答を記録および維持するための改善された方法は、健康な網膜、眼疾患の動物モデル、およびヒトドナー網膜における光受容体およびONバイポーラ細胞機能の研究を容易にします。
このプロトコルは、ex vivo ERG、特にONバイポーラ細胞によって産生される非常に感度の高いB波で網膜機能を維持するために必要な条件を示しています。ex vivo ERGを使用すると、薬理学的物質の導入を容易にしながら、高い信号対雑音比でさまざまな種類の網膜ニューロンの機能を測定することができます。この方法は、網膜機能および疾患に対する薬理学的物質の有効性を定量化するのに特に適している。
まず、ex vivo ERG試料ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続して、多電極アレイのセットアップを変換します。アンプは、多電極アレイシステムのインターフェースボードのアナログ入力に接続する必要があります。多電極アレイ用の記録ソフトウェアを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。
差動アンプのゲインを100に設定し、デジタイザの仕様に応じて10倍の電圧増幅を追加します。ローパスフィルターを100ヘルツに設定します。あるいは、パッチクランプのセットアップを変換するには、ex vivo ERG検体ホルダーをヘッドステージを介して差動アンプに接続し、差動アンプはパッチクランプアンプのヘッドステージに接続する必要があります。
パッチクランプシステムソフトウェアとデジタイザを使用して、ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。前に示したようにパラメータを設定します。適切な波長のLEDを顕微鏡に接続します。
光刺激を制御するには、デジタイザからのアナログ出力によって制御されるLEDドライバを使用します。光刺激のトリガーを可能にする記録ソフトウェアでLEDを制御します。次に、フォトダイオードを使用して、標本ホルダー内の網膜の位置でのLEDの光出力を校正します。
必要に応じて、減光フィルターを挿入して、光路の光の強度を暗くします。電極を準備するには、塩化銀ペレット電極をネジ付きルアーコネクタに挿入します。ルアーコネクターの内側をホットグルーで満たし、非ネジ側からホットグルーに2ミリのソケットを差し込みます。
EP-1電極の銀線を2ミリソケットにはんだ付けします。糸にOリングが付いた完成した電極をex vivoERG試料ホルダーの電極ポートにねじ込みます。人間のドナーの目を含む大きな目の場合は、残りの結合組織の地球をきれいにし、前部と水晶体を取り外します。
メスを使用して、リムバスから約3ミリメートルの切り込みを入れます。湾曲した解剖ハサミを切開部に挿入し、辺縁に沿って切断してレンズで目の前部を取り除きます。3〜6ミリメートルの使い捨て生検パンチでex vivo網膜電図用の網膜標本を入手します。
組織を検体ホルダーに取り付けるには、検体ホルダーの下半分を大きなペトリ皿に入れ、検体ホルダーのドームがちょうど水没するように酸素化エイムズ培地で満たします。細かい鉗子で網膜の端を注意深くつかみ、網膜をex vivo標本ホルダーのドームに移し、感光体側を上に向けています。標本ホルダーをエイムズの溶液から持ち上げ、網膜が所定の位置に留まるように注意します。
試料ホルダーのプレートを完全に乾燥させて、ノイズ、電気的クロストーク、信号シャントを最小限に抑えます。次に、試料ホルダーの両半分を4本のネジで組み立て、灌流ラインを接続します。試料ホルダーの下半分の電極を打ち込み、アノードケーブルを網膜内側に、カソードケーブルを感光体側に接続します。
検体ホルダーに少なくとも1ミリリットルの酸素化エイムズ培地を10〜20分間灌流して、光応答を安定させます。Ex vivo ERGは、マウス網膜からの光受容体およびONバイポーラ細胞光応答の記録を可能にしました。ヒトドナー網膜からの光受容体応答の記録は、核摘出の死後最大5時間の遅延と、ONバイポーラ細胞応答の20分未満の遅延で可能でした。
理想的な条件下では、両方の細胞タイプの応答振幅と動態は時間の経過とともに比較的安定していましたが、網膜が標本ホルダーに取り付けられてから40〜45分後にゆっくりと減少しました。試料ホルダー内の温度の低下は、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の動態を大幅に遅くしました。ただし、B波の振幅は減少しましたが、A波の振幅は減少しませんでした。
逆に、灌流速度を遅くすると、光受容体とONバイポーラ細胞の両方の応答の振幅が減少しましたが、A波またはB波の暗黙の時間には影響しませんでした。灌流を10分間停止した後、再灌流すると、光受容体応答が保存されたONバイポーラ細胞機能が完全に失われました。十分な灌流速度と生理学的温度は、特にex vivo ERGのONバイポーラ細胞から安定した応答を得るために重要です。
このプロトコルにより、ヒト黄斑と末梢における視受容体機能の違いを詳細に調査することができ、以前はヒト以外の霊長類でしか実行できなかった質問に答えることができます。
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概要
この研究は、網膜ニューロン機能を研究するためのex vivo電気網膜図（ERG）記録方法を向上させるプロトコルを提示します。このアプローチは、様々なセットアップを用いてON-双極細胞と光受容体の機能に焦点を当て、健康および病状における網膜への薬理学的効果についての洞察を提供します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 電気生理学
- 神経科学
- 網膜生物学
背景
- ex vivo環境での網膜機能の効果的な記録における課題。
- 網膜の健康と病気におけるON-双極細胞と光受容体の重要性。
- 薬理学的介入を定量化するための信頼性の高い方法の必要性。
- 既存の技術はしばしばアクセシビリティと精度に欠ける。
研究の目的
- 改良された機器を使用して網膜の光応答の記録を改善すること。
- 光受容体とON-双極細胞の機能性の分析を促進すること。
- 網膜細胞における薬理学的反応を評価すること。
使用された方法
- このプロトコルは、マルチ電極アレイまたはパッチクランプシステムを用いたex vivo ERGを採用しています。
- マウス網膜とヒトドナー網膜が生物学的モデルとして使用されています。
- 各セットアップには、正確な記録を確保するための増幅とフィルタリングの重要なパラメータが含まれています。
- 実験中の温度と灌流速度の維持の重要性が強調されています。
- 光出力のフォトダイオードを使用したキャリブレーションは、制御された刺激に不可欠です。
主な結果
- 改良された方法により、光受容体とON-双極細胞の両方からの安定な記録が可能になります。
- 応答は一貫性を保ち、長時間のマウント後にわずかな低下が見られます。
- 温度と灌流速度は応答の振幅、特にB波に大きく影響します。
- 結果は、ヒト網膜の異なる領域における光受容体の機能の違いを明確にしています。
結論
- この研究は、網膜ニューロン機能を探索するための信頼性の高い方法を示しています。
- 改善されたアクセシビリティにより、網膜の健康に関連する高度な薬理学的研究が可能になります。
- この結果は、神経機構と網膜疾患の潜在的な介入に対する理解を深めています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Optimizing ex vivo ERG conditions enables stable, high-fidelity recording of retinal neuronal responses, particularly from ON-bipolar cells and photoreceptors, supporting mechanistic de-risking in retinal target validation. The method allows quantitative assessment of pharmacological interventions in isolated tissue, reducing systemic variability and improving predictive confidence in preclinical models. This positions the technique as a translational bridge for evaluating retinal therapeutics across species, including human donor tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal neuronal cell-type-specific contributions to light responses, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates pharmacological agent introduction to quantify efficacy on retinal function, improving target de-risking.
- Predictive Value: Stabilized ON-bipolar cell B-wave recordings allow assessment of compound effects over time, supporting lead identification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Optimized perfusion speed and physiological temperature maximize response amplitude and stability, enabling reliable compound screening.
- Quantitative Output: Provides high signal-to-noise measurements of photoreceptor and ON-bipolar cell responses, supporting dose-response and kinetic analyses.
- Scalability: Adaptable to retina samples from small and large eyes, including human donor tissue, supporting cross-species assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables comparison of photoreceptor function between human macular and peripheral retina, supporting biomarker alignment.
- Disease-Relevant System: Maintains retinal function ex vivo for up to five hours postmortem, allowing evaluation of pathological changes and therapeutic interventions.
- Mechanistic De-risking: Isolates tissue-intrinsic retinal responses, minimizing confounding systemic influences in preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The optimized ex vivo ERG method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical evaluation, supporting data-driven go/no-go decisions in retinal therapeutic development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of retinal neuronal mechanisms and pathway-specific contributions to visual function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative light response readouts enabling reliable compound evaluation in retinal assays.
- Analytics: Generates kinetic and amplitude data (A and B waves) that allow comparison of treatment effects across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects findings from model systems to human donor retina, supporting preclinical-to-clinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for retinal functional assessment across discovery and preclinical teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic clarity on retinal cell-type-specific responses, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardized perfusion and temperature controls improve reproducibility and reduce variability in retinal function measurements.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by improving predictive confidence in retinal target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by de-risking mechanistic uncertainty in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retinal tissue dissection, electrophysiology, and pharmacological agent handling.
- Dependent on specialized equipment including differential amplifiers, LED drivers, photodiodes, and perfusion systems.
- Necessitates standardized protocols for tissue mounting, perfusion speed (at least 1 mL/min), and physiological temperature maintenance.
- Adaptation across model systems requires optimization of biopsy punch size and dissection techniques for varying eye dimensions.
- Practical limitations include gradual decline in response stability after 40–45 minutes post-mounting, necessitating timely experimental execution.
