Name: 単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ単粒子低温電子顕微鏡用の手動ブロット・プランジ凍結法。生体試料を効率的にガラス状氷に固定し、高分解能イメージングを可能にするコスト効果の高い試料調製技術を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、この原稿とビデオコンテンツについて批判的に考え、フィードバックを提供してくれたHerzikラボのメンバーに感謝します。M.A.H.Jr.はNIH R35 GM138206およびサール学者によってサポートされています。H.P.M.Nは分子生物物理学トレーニンググラント(NIH T32 GM008326)によってサポートされています。また、スクリプス研究所のビル・アンダーソン、チャールズ・ボウマン、ガブリエル・ランダー博士に感謝し、ビデオに示されている手動プランジャーの設計、組み立て、テストを支援したいと思います。

私たちは開示するものは何もありません。

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)によるイメージングのための生物学的標本のガラス化は、構造決定を成功させるための極めて重要なステップであり続ける。このプロトコルで説明されている手動のブロットとプランジ法は、クライオEMイメージング用の氷の薄膜中の生物学的サンプルを迅速に凍結するための費用対効果の高い、信頼性の高い、堅牢な方法を表します。原稿に記載されている方法を使用して、研究者は手動プランジャーを組み立てて操作し、フラッシュ凍結生物学的サンプルに適したクライオゲンを準備し、生物学的標本を含む手動でブロットとプランジEMグリッドを作成することができます。この方法は非常に堅牢ですが、この手順の重要な手順では、高解像度イメージングに最適な氷の厚さと品質を得るために注意する必要があります。以下に、これらの重要な手順のいくつかを概説し、これらの手順のトラブルシューティング方法に関する推奨事項を示します。
グリッドが突っ込んだ後に真鍮容器内の液体エタンの中心に位置することを確認するために、手動の突っ込みアームを適切に配置することが不可欠です。突っ込んだ腕の高さや位置が不適切で、ピンセットを...

単粒子低温電子顕微鏡(クライオエム)は、動的生物学的標本の構造を原子に近い分解能1,2,3,4に解決するために使用できる強力な構造技術です。実際、最近の直接電子検出器技術の進歩 4,5,6,7,8,9,10, 電子源の改善 4,11,12,13,14,電磁気レンズ安定性15と相まってデータ取得の継続的な発展16,17および分析ソフトウェアパッケージ18,19は、研究者が3 Å解像度またはより良い3Åに行き届いた標本の構造を日常的に決定することを可能にしました4,11,11,13,14,20,21,22,23.これらの改善された画像およびデータ処理機能にもかかわらず、cryoEMグリッドの準備は、高解像構造の決定を成功させるための最大の障害であり、しばしばEMワークフロー24、25、26、27においてかなりのボトルネックとなる。
CryoEMは、天然の生化学的状態を維持する「ガラス状」氷(ガラス化と呼ばれるプロセス)の薄膜を形成するために凍結された水溶液中の生物学的サンプルのイメージングに依存しています。クライオEM用の生物学的サンプルのガラス化は40年以上前までさかのぼり、このプロセスのために開発された多くの技術や機器は、当初の詳細なブロットとプランジ法に依存しています31,32,33,34,35 これは、過剰な溶液がブロッティング紙とのグリッドの物理的相互作用を使用して除去される前に、少量のサンプル(例えば、1〜5 μL)が特殊なEMグリッドに適用される。このプロセスのタイミングは、通常、氷のサンプルの重要な成分が膜膜の厚さであるように各標本について経験的に決定されます - 氷が厚すぎると、薄すぎる氷がタンパク質の配向を制限したり、グリッド箔の中心から粒子を除外することができますが、電子ビームの散乱の増加によりイメージング品質が劇的に悪化します36.単粒子クライオEMのための完璧な氷の厚さにこの依存は、ロボティクス37,38、マイクロ流体42、超音波または噴霧装置27,39,40,41,42,43,44を含むサンプルを凍結できる幅広い技術と機器につながっています。.近年、最も人気のあるサンプル調製装置のいくつかは、ブロットとプランジ技術45を使用してサンプルの自動凍結のためのロボット工学の使用に依存しています。これらのデバイスは、イメージング用の適切な氷の厚さを再現的に作成するように設計されていますが、個々のラボが購入して動作するには高価すぎることが多く、一般的にcryoEM施設内で使用のために毎時の料金で見られます。近年、オリジナルのマニュアルブロットアンドプランジ技術は、使用数が増加し、3,47,48,49,50,51,52に戻ってきました。実際、手動で操作されたブロットとプランジデバイスは、ロボットの対応するコストのほんの一部で高品質のクライオEMグリッドを実現できます。さらに、手動ブロッティングは、研究者がブロッティングの種類(すなわち、グリッドのバックブロット、グリッドのフロントブロッティングなど)、および個々のサンプルと研究の質問に基づいてブロット時間を調整できるため、より多くのユーザーがブロッティングを制御することができます。
本稿では、従来の手動ブロットとプランジガラス化装置を使用して、カスタム設計のデュワープラットフォーム53と組み合わせて生物学的サンプルを効果的に凍結する方法について詳しく説明します。クライオゲンの準備、グリッド処理、サンプルアプリケーション、ブロッティングなどのベストプラクティス、これらのハードルを克服する方法に関する一般的な落とし穴と推奨事項が提供されています。グリッド調製の間の氷の厚さを向上させる方法と、生物学的標本の種類に基づいてサンプルブロッティングを変更する方法についてのアドバイスが議論されています。この原稿に記載されている手動プランジャーの購入と操作に関連する低コストを考えると、世界中のラボは、コスト効率が良く再現可能な方法でcryoEMの生物学的標本を調製することができます。

<table><tbody><tr><td>4スロットグリッド収納ボックス</td><td>テッドペラ</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>14ゲージフラットメタルディスペンシングチップ</td><td>アマゾン</td><td>B07M7YWWLT</td><td></td></tr><tr><td>22x22 mm正方形ガラスカバースリップ</td><td>シグマ</td><td>C9802-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>60 mmガラスシャーレ グリッドを格納する</td><td>フィ</td><td>ッシャー08-747A</td><td></td></tr><tr><td>100 mmガラスシャーレ Whatman紙</td><td>フィ</td><td>ッシャー08-747D</td><td></td></tr><tr><td>Whatman紙</td><td>フィ</td><td>ッシャー08-747F</td><td></td></tr><tr><td>250ミリリットルビーカー</td>フィ<td>ッシャー02-555-25B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルー発泡スチロールデュワー</td><td>スピアラボ</td><td>FD-500</td><td></td></tr><tr><td>真鍮エタン容器</td><td>ラスコ</td><td>17-4075</td><td></td></tr><tr><td>クランプピンセット</td><td>テッドペラ</td><td>38825</td><td></td></tr><tr><td>繊細なタスクワイ</td><td>プフィッシャー</td><td>を保管する06-666</td><td></td></tr><tr><td>制御弁付きデュアルステージレギュレータ</td>ー <td>エアガス</td><td>Y12N245D580-AG</td><td></td></tr><tr><td>デュワー グリッド ベース</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタン プラットフォーム</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタン プロパン タンク</td><td>Praxair</td><td>ET PR50ZU-G</td><td>エタン (50%) : 高圧タンク内のプロパン (50%)</td></tr><tr><td>エタン タンク</td><td>Praxair</td><td>UN1035</td><td>エタン (100%)</td></tr><tr><td>フレキシブルアーム タスクライト</td><td>Amscope</td><td>LED-11CR</td><td></td></tr><tr><td>Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>Q325AR1.3</td><td></td></tr><tr><td>加湿器</td><td>ターゲット</td><td>719438</td><td></td></tr><tr><td>湿度計</td><td>ThermoPro</td><td>B01H1R0K68</td><td></td></tr><tr><td>白衣</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>液体窒素デュワー</td><td>ワーシントン</td><td>LD4</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素手袋</td>フィ<td>ッシャー19-059-925</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手動プランジャースタンド(黒スタンド+フットペダル)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マーク5(プランジプラットフォーム)</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>VWR</td><td>82026-424</td><td></td></tr><tr><td>P20ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>13-690-029PCR</td><td></td></tr><tr><td>チューブエ</td><td>ッペンドルフ</td><td></td><td></td>E0030124286</tr><tr><td>ピペットのヒントアイ</td><td>ビス科学</td><td>63300005</td><td></td></tr><tr><td>リングランプアマゾン</td><td></td><td>B07HMR4H8G</td><td></td></tr><tr><td>安全メガネ</td><td>UCSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>アマゾン</td><td>フィスカース01-004761J</td><td></td></tr><tr><td>ドライバー</td><td>アイアンサイド</td><td>354711</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td>フィ</td><td>ッシャー15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>グリッドボックスを転送するピンセット</td><td>アマゾン</td><td>LTS-3</td><td></td></tr>タイ<tr><td>ゴンチューブ</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-171-130</td><td></td></tr><tr><td>ワットマン吸い取り紙</td><td>フィ</td><td>ッシャー1001-090</td><td></td></tr></tbody></table>

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

単粒子極低温電子顕微鏡(cryoEM)による高解像構造決定のための電子を用いた生物学的標本のイメージングには、目的の生体分子を含む亜粒子の薄層が必要です。近年、単粒子cryoEMを構造生物学の最前線に押し上げた多くの技術進歩にもかかわらず、高解像イメージングのために標本をガラス化する方法は、しばしばレート制限ステップのままです。新しいサンプルサポートや革新的なガラス化計器の開発など、標本ガラス化中に頻繁に遭遇するハードルを克服するための多くの最近の努力が提供されていますが、従来の手動操作プランジャーは、購入コストが低く、操作が容易であるため、cryoEMコミュニティの定番のままです。ここでは、単粒子クライオEMによる高解像度イメージングのための生物学的標本のガラス化のための標準のギロチンスタイルの手動操作ブロットとプランジデバイスを使用するための詳細な方法を提供します。また、標準的な準備が適切な標本を得られなかった場合に関する一般的な問題とトラブルシューティングの推奨事項も説明します。

ここで説明するブロット・アンド・プランジプロトコルの実行に成功すると、電子顕微鏡下で観察できる六角形の氷、汚染物質、および使用できない氷の大きな勾配のない薄く均一な層のビトレウス氷が生じる(図3)。ブロッティング紙とグリッド表面との接触が一貫していない、ブロッティング紙を早期に取り外す、またはグリッド接触中にブロッティング紙を動かすと、バイトレウス氷の品質が低下し、EMグリッド全体で氷の厚みが一貫していない可能性があります(図4)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62765/62765fig01.jpg"> 図1:検体突っ込み室と必要な機器。A)この記事で概説されている伝統的なブロットとプランジデバイスを使用して、生...

この原稿は、単粒子低温電子顕微鏡用の生物学的標本を手動で凍結するブロット・アンド・プランジ法の概要を説明している。

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

ここで説明する手動突っ込み方法は、透過電子顕微鏡用サンプルを調製するための費用対効果の高い、信頼性の高い方法です。このビデオでは、手動プランジャーを設定し、クライオゲンを準備し、EMグリッドの手動ブロッティングと突っ込みを行う方法を紹介します。手動の突っ込み環境を準備します。この手順は、湿度が95%を超える摂氏40度に維持された冷たい部屋で行う必要があり、手動ブロッティングと突っ込みのためのオンラインプロトコルに記載されているように、ここに示されている材料を使用することをお勧めします。クライオゲンデュワーとマニュアルプランジャーを準備します。クライオゲンデュワーを組み立てるには、まず、それが平らでレベルであることを確認し、青い発泡スチロールデュワーの下部にプラットフォームベースをインストールします。次に、エタン容器ホルダーをプラットフォームベースの上に置き、真鍮エタン容器を挿入します。最後に、回転グリッドストレージプラットフォームを配置します。次に、マニュアルプランジャーのベースに突っ込んだデュワーを見つけます。突っ込んだ腕の下にエタン船を中心に、突っ込んだデュワーをベースに固定します。手動の突っ込み高さを設定するには、最初に突っ込んだ腕のベースに新鮮なテープを取り付けます。次に、突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。ピンセットを軽くタップしてしっかりと取り付けられるようにします。突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてピンセットを真鍮のエタン容器にゆっくりと下ろします。ピンセットが真鍮エタン容器の真ん中に位置するように、突っ込むデュワーの位置を調整します。ピンセットの先端は、ピンセットおよび手動プランジャーへの損傷を避けるために、真鍮エタン容器のサイズまたは底部に接触してはならない。位置を設定したら、手動の突っ込みアームをリセットします。クライオゲンを準備します。クライオゲンの準備は換気の良い部屋で行われるべきであり、適切な個人的な保護具は常に着用する必要があります。まず、液体窒素が急落したデュワーに直接入り、液体窒素レベルが真鍮エタン容器の上部に達すると停止します。液体窒素が激しく泡立つのを止めた後に進むのに十分な寒さでなければなりません。これには約5分かかります。エタンは圧縮ガスとして来て、凝縮する必要があります。最適なエタン凝縮のためにガスの流れを設定するには、エタンガスラインの先端を250ミルビーカーの水に挿入し、泡立ちを観察します。ガスの流れは、激しく水面を破壊しない気泡の安定した流れを生成する必要があります。エタンの凝縮を開始するには、真鍮エタン容器の底部にエタンガスラインの先端を置きます。金属チップをゆっくりとかき混ぜ、エタンの液化を開始します。エタンが冷え始めるとすぐに、それは聞こえる音を出すでしょう。真鍮のエタン容器を液体エタンでいっぱいの4分の3に満たします。液体窒素で急落したデュワーを上にして、真鍮のエタン容器に触れますが、それにこぼれないようにします。均一なエタン凍結には液体窒素の添加が必要である。青い突っ込みデュワーに泡のふたを置き、エタンが完全に固まるようにします。エタンガスの流れを再開し、気体ラインの先端を固体エタンに慎重に入れます。先端を容器の中に縦に置き、底部にエタンを分配することが重要です。金属チップをゆっくりとかき混ぜてエタンを溶かし、液体エタンのレベルを容器の上部に持ち上げます。蓋を約1分間閉じ、2~3ミリメートルの固体エタンが見えるまで、真鍮容器の縁の周りにエタンを固めます。エタンは現在、生物学的サンプルを凍結するのに理想的な温度に達しています。突っ込んだデュワーを手動プランジャーのベースに注意深く取り付けます。突っ込んだ腕とピンセットベースにテープをしっかりと巻き付けて、ピンセットを締めます。突っ込んだ腕を持ち、足のペダルを落としてゆっくりとピンセットを液体エタンに下げます。ピンセットが液体エタンの真ん中に位置し、固体エタンリングとの接触を避けるように、突っ込んだデュワーの位置を調整します。突っ込み素材とアクセサリーを準備します。各円形のフィルターペーパーを約1センチメートル幅のストリップに切って、ブロッティング紙を準備します。ブロッティング紙の中心に触れないようにし、小さな端部を捨てます。ブロッティング紙のストリップが乾燥し、清潔で、汚染物質がないことを確認することが重要です。突っ込む前に、グリッドボックスを突っ込んだデュワーに適切なスロットに入れます。グリッドが自由に回転できるようにしてください。プランジ凍結によりクライオエム標本を準備する。グリッドとグリッドの準備の多様性のために、親水性グリッドをレンダリングするための推奨プロトコルに従ってください。グリッドを適切に処理するには、クリーンで乾燥したクランプピンセットを使用して、外輪の親水性グリッドを拾います。プラスチック製クランプをスライドさせてグリッドを固定し、ピンセットを軽くタップしてグリッドが適切にクランプされていることを確認します。クランプピンセットに保持されているグリッドの前面にサンプルの3マイクロリットルを適用します。ピンセットベースにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットをしっかりと取り付けます。サンプルは、今すぐ消え、凍結急落する準備が整いました。人差し指と親指の間にきれいな紙の端を持ちます。安定した位置を確立するために、急激なデュワーの端に手を置きます。ブロッティング紙は、グリッドの表面から約1センチメートルでなければなりません。中央がグリッドに接触するまで、ブロッティングペーパーを曲げます。ブロッティング紙は、均一な接触を可能にし、グリッドの損傷を防ぐために、グリッド面に平行にすることが重要です。移動式液体フロントが広がらなくなったら、カウントを開始します。グリッドを5秒間ブロットします。指を離して、吸引紙を緊張させ、グリッドの表面から素早く取り除きます。同時に、フットペダルを押して手動突っ込みアームを解放し、グリッドを保持するピンセットを液体エタンに突っ込みます。液体エタンに新鮮な凍結グリッドを維持し、慎重に手動突っ込みアームからピンセットを取り外します。グリッドが取り外し可能になるようにピンセットを慎重に取り外します。エタンから液体窒素への素早い動きで、真鍮エタン容器の下の液体窒素貯蔵所にグリッドを移動します。グリッド ボックスにグリッドを配置します。代表結果。このビデオから、研究者は、高解像度イメージングのための亜真の氷の薄膜を含む多くの正方形で、このようなCryoEMグリッドを準備することができるはずです。サンプル濃度とブロッティング時間を調整して、粒子密度を最適化することができます。ここでは、ブロットとプランジ法を使用してCryoEMサンプルを凍結するための完全なワークフローを示します。きれいなクランプ用のトゥイザーを使用して、新鮮なグリッドを拾い、グリッドを所定の位置に固定します。グリッドの親水性側に3マイクロリットルのサンプルを塗布し、ピンセットハンドルにテープを巻いて手動突っ込みアームにピンセットを固定します。ブロッティングペーパーをグリッド表面に平行に配置し、ブロッティング紙をグリッドに向かってそっと曲げて、ブロッティングを開始します。所望の時間の後、突っ込んだ腕を解放するために足のペダルを押しながらグリッド表面から離れてスナップモーションでブロッティング紙を移動し、液体エタンにグリッドを突っ込みます。ピンセットと手動の突っ込み腕の周りから慎重にテープを巻き戻します。1つの迅速な動きで、すぐに液体窒素貯蔵所にエタン容器からグリッドを移す。グリッドストレージボックスにグリッドを置き、ピンセットをキムワイプでラップして乾燥させます。

manual-blot-plunge-freezing-biological-specimens-for-single-particle

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ネイティブに近い状態の細菌細胞の超微細構造を研究するために電子cryotomography（ECT）を使用する方法を私たちは、"高分子"（〜4...

細菌細胞の電子Cryotomography

我々は、電子顕微鏡写真で蛍光標識タンパク質をローカライズする方法について説明します。蛍光は、第一超薄切片に光活性化ローカライゼーション顕微鏡を使ってローカライズされます。これらの画像は、同じ断面の電子顕微鏡写真に整列されます。...

ナノFEM：写真活性化ローカライゼーション顕微鏡と電子顕微鏡を用いてタンパク質の局在

クライオ電子顕微鏡、走査型（SEM）のいずれか、または送信（TEM）は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム（FIB）は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。...

集束イオンビームを用いて低温電子顕微鏡標本の準備

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。...

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

楽器と透過型電子顕微鏡のためのナノリットル サイズ サンプル ボリュームの準備のためのメソッドが表示されます。これは蛋白質の大幅にサンプルの損失を削減し、単一細胞ライセート visual...

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM)...

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

ここでは、細菌、酵母、培養細胞、単離細胞、動物およびヒト組織、ウイルスを含む生物学的標本の迅速凍結にサンドイッチ凍結装置を使用する方法を示す。また、急速凍結後の超薄切片用試料の調製方法もご紹介します。...

電子顕微鏡での生体試料の良好な超構造保存のためのサンドイッチ凍結装置を用いた急速凍結

ここでは、クライオ電子線トモグラフィー用の細胞サンプルの調製をガイドするための3D相関集束イオンビームミリングのパイプラインを紹介します。目的の蛍光タグ付きタンパク質の3D位置は、まずクライオ蛍光顕微鏡で決定され、次にミリングの標的となります。このプロトコルは、哺乳類、酵母、および細菌細胞に適しています。...

高分解能クライオ電子線トモグラフィーのための3D相関集束イオンビームミリングによるサンプル調製

ピールブロット法は、多層および濃縮された生物学的サンプルを単層に分離して、厚さを減らし、サンプル濃度を高め、画像処理を容易にするクライオEMグリッド調製法です。...

ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法

ここでは、単分子膜のグラフェンを電子顕微鏡グリッドに塗布するためのプロトコールと、クライオ電子顕微鏡の構造決定に使用するための調製方法について説明します。...

クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

学ぶ単粒子低温電子顕微鏡用の手動ブロット・プランジ凍結法。生体試料を効率的にガラス状氷に固定し、高分解能イメージングを可能にするコスト効果の高い試料調製技術を習得できます。

単粒子低温電子顕微鏡用生体試料の手動ブロットとプランジ凍結

さらに動画を探す