ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置
August 2nd, 2021
細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。
この技術は、異所性シグナル伝達源を移植することにより、胚発生時のシグナル伝達分子の機能と範囲を研究することを可能にする。また、生殖細胞系列変異体の効率的な生成を容易にする。このプロトコルは、ブラストラステージゼブラフィッシュおよびメダカ胚に適用することができ、おそらく他の胚段階およびTDO種にも適用することができる。
移植装置を組み立てるには、ルアーロックフィッティングを使用して、25マイクロリットルガスタイトシリンジをマイクロピペットホルダーに接続します。次に、デバイスを手動マイクロマニピュレータに直接取り付けます。移植装置を使用するには、組み立てられた装置を持つマイクロマニピュレータをステレオ顕微鏡の隣に置きます。
その後、プランジャーを取り外し、移植針を挿入します。針の先端が浸るまで、リンガーの溶液を45度の角度で満たした皿に針を下ろします。プランジャーを約半分に挿入してリンガーの溶液を洗い流し、針の細いテーパー部分に少量の水しか残さずに入れます。
移植用針を初めて使用する場合は、犠牲胚からヨークを引き出し、ヨーク材料を完全に排出して、針の内側をコーティングします。次に、移植針を使用して、ドナー胚を穏やかに配置し、次に、針開きの胚表面に直交する針を配置し、慎重にプランジャーを引き出して細胞を針に引き込む。所望の数の細胞が引き込まれたら、プランジャーを軽く押し下げて吸引を止め、短く迅速な動きで針を横にぎくしゃくして胚から針を取り除きます。
細胞を針の先細り端に制限することで、リンガーの溶液を細胞列の両側に残します。プランジャーを上下にゆっくりと動かし、リンガーの溶液で細胞を洗うことによって、残りの黄身または細胞の破片を取り除きます。次に、非支配的な手で移植皿を動かし、宿主胚の表面に直交する針を位置づける。
慎重に壁に絞ることによって、胚にわずかな圧力を適用します。その後、迅速な鋭い動きで、針で黄身を傷つけないように注意して宿主胚の包み込み層を突き刺す。針が中に入ったら、プランジャーを軽く押して細胞の柱を胚に押し出し、針を同時にゆっくりと引き込みます。
生殖細胞の移植のために、リンガーの溶液で移植皿を充填し、その後、デコリオ化された球体をドームステージ胚を移植皿に移し、宿主およびドナー胚を交互の柱に配置し、1つのドナー胚から6つの異なる宿主胚に細胞を移植する。移植を行うために、移植針に向けてマージンを持つ胚を向ける。生殖細胞移植の場合、ソース細胞をマージンから取り出し、宿主胚の同じ場所に沈着させる。
移植が完了したら、胚がリンガーの溶液中で30分から1時間回復することを可能にする。次に蛍光ステレオ顕微鏡を用いて、移植した細胞を調べる。次に、同じドナーから細胞を受け取ったすべての宿主胚を同じウェルにグループ化した胚培地を有する24の十分なアガロースコーティングプレートに胚を移す。
その後、次の日まで摂氏28度で胚をインキュベートします。必要に応じて、ドナー胚を標識PCRストリップに移してジェノタイピングを行います。受精後30時間、蛍光ステレオ顕微鏡下で生殖細胞移植を成功させるために宿主胚をスクリーニングする。
胚芽細胞は、卵黄の伸びの上の溝に存在するべきである。正常に移植された幼虫を成人フードに成長させる。移植に成功すると、胚は胚芽胚に大きな涙を流すことなく、移植されていない胚に正常で形と黄身の透明度が似ています。
対照的に、移植中に胚が目に見えて損傷した場合、正常に発達しない。この移植装置は主に胚芽期のゼブラフィッシュ胚に用いられてきたが、移植や細胞駆出は、日本の米魚メダカのデコリオネート胚期胚でも行うことができる。生殖細胞系列移植の特定の場合、良好な移植は、卵黄のマージンの真上に細胞の長い水平列を持つ胚をもたらす。
しかし、この処置の成功は、生殖細胞が体細胞との蛍光で区別される場合にのみ、受精の24〜30時間後に評価することができる。原始胚芽細胞は、黄身の伸びの真上の溝に小さな蛍光球として現れます。正しい場所でのこれらの生殖細胞の存在は、生殖細胞移植に成功したことを示す。
移植の失敗例をここに示す。最初の例では、胚細胞が性腺中胚に達しているが、宿主胚が重度に変形するにつれて、正常に発達しない。第2の例では、蛍光細胞は溝の外側でのみ検出される。
これらの細胞は、正しく移行できなかった体細胞または生殖細胞のいずれかです。そして、両方の細胞タイプは、胚の生殖細胞株に寄与しません。移植細胞および宿主胚への損傷を避けるために重要である。
細胞はゆっくりと描かれ、残りの黄身を取り除き、慎重に挿入する必要があります。この方法は、ゼブラフィッシュ胚の細胞を移植する簡単な方法を提供し、異所性源および生殖細胞系変異体を生成するのに有用であろう。この装置の主な利点は、それは低コストであり、多く、使用しています。
概要
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚における胚発生操作を行うためのシンプルで効果的な移植デバイスについて説明しています。これは、胚発生中のシグナル分子の研究を可能にし、生殖系変異体の生成を容易にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 胚発生学
- 発生生物学
- ゼブラフィッシュ研究
背景
- 胚発生操作は、初期の発達を理解するために重要です。
- 移植技術により、細胞シグナリングと生殖系変異体の研究が可能になります。
- ゼブラフィッシュとメダカの胚は、これらの研究でよく使用されるモデルです。
- 移植デバイスは、使いやすさと効率性を考慮して設計されています。
研究の目的
- ゼブラフィッシュ胚における細胞移植のプロトコルを提供すること。
- 胚発生中の異所性のシグナリング源の研究を可能にすること。
- 研究目的のための生殖系変異体の生成を容易にすること。
使用された方法
- 注射器とマイクロピペットホルダーを使用して移植デバイスを組み立てること。
- ドナー胚から宿主胚への細胞の移植。
- 手順中の胚の生存性を維持するためにリンガー溶液を使用すること。
- 正常な生殖系移植のスクリーニングに蛍光顕微鏡を使用すること。
主な結果
- 成功した移植は、明確な生殖細胞を持つ正常な外見の胚をもたらします。
- 正常な生殖系移植を示す胚は、正しい位置に蛍光を示します。
- 不適切な技術は、胚の損傷と移植の失敗につながる可能性があります。
- この方法は、さまざまな胚発生段階と種に適用可能です。
結論
- 移植デバイスは、胚発生学的研究のための低コストで効果的なツールです。
- 慎重な技術は、胚の損傷を避け、成功を確実にするために重要です。
- この方法は、ゼブラフィッシュや他の種における発達プロセスの研究能力を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient embryological manipulation tools are essential for dissecting developmental pathways and validating biological targets in early discovery. This economical zebrafish transplantation device enables precise cell transplantation and extirpation, supporting mechanistic de-risking and functional validation in disease-relevant models. Its simplicity and adaptability streamline workflows at critical inflection points in preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of signaling molecule function and range during embryogenesis.
- Supports generation of maternal-zygotic mutants for pathway clarification.
- Facilitates removal or transplantation of cells to test developmental hypotheses.
- Provides a platform for functional target validation in transparent, tractable models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated embryonic systems for downstream phenotypic screening.
- Standardizes cell transplantation and extirpation for reproducible assay outputs.
- Enables quantitative assessment of cell fate and signaling dispersal.
- Supports scalable manipulation across multiple embryos and conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant developmental models for translational continuity.
- Enables generation of germline mutants to model genetic diseases.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying developmental mechanisms.
- Facilitates cross-species application, broadening translational relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This device integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and mechanistic de-risking in zebrafish and medaka models.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing by enabling precise cell removal and transplantation to interrogate developmental pathways.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for comparing signaling effects and cell fate across conditions.
- Analytics: Facilitates fluorescence-based measurement of germline integration and ectopic clone formation.
- Translational Research: Enables generation of maternal-zygotic mutants and disease-relevant phenotypes for preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Adaptable for use in multiple species and developmental stages, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable embryological manipulations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying biological mechanisms early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological manipulation and microinjection techniques.
- Needs access to stereo and fluorescence microscopy for screening and analysis.
- Demands cross-team standardization of transplantation and extirpation protocols.
- Adaptable to various model systems with minor procedural adjustments.
- Success depends on careful handling to avoid embryo or cell damage, as supported by source material.
