Name: ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚の細胞移植法。シンプルな装置を用いて胚形成期のシグナル分子の機能と範囲を研究し、生殖系列突然変異体の効率的な作出を可能にする低コストな手法です。

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このプロジェクトはマックスプランク協会の支援を受け、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(補助金契約第637840(QUANTPATTERN)および863952第1 863952(ACE-OF-SPACE))の下で欧州研究評議会(ERC)から資金を受け取りました。

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著者は宣言する利害の対立を持っていません。

移植実験の成功は、実験者の細かい運動能力に強く依存しています。手続きを正常に行うためには、練習が必要です。しかし、ここで紹介する器械は市場の他の人と比較して学び、使用することは比較的容易であり、そして、一般的に、練習の数日しか必要とされる。
移植手順の成功は、いくつかの予防措置を取ることによって強化することができます。1つのステップは、マイクロマニピュレータが良質で、円滑な操作が可能であることを保証することです。立体顕微鏡に高い倍率を持つ眼を加えることは、胚に対して正確に針を配置するのに役立ちます。よく繁殖するゼブラフィッシュやメダカを使用して健康な胚を獲得し、取り扱い中(特にデコールリオネーションステップ中および後)に胚に損傷を与えないことに注意を払って、成功率も向上します。
遅延毒性の問題は、トラブルシューティングが難しくなることがあります。胚が数時間後に死んだが、移植直後ではない場合、黄身は針によって損傷を受けた(例えば、胚に深く入り込むなど)か、細胞があまりにも強引に放出された可能性がある。遅延毒性と胚死はまた、ドナー細胞と一緒に注入された黄身または細胞の破片から生じる可能性があります。別の原因は、リンガーの溶液中のHEPESバッファーを劣化させることがある。これらの問題は、細胞を洗浄することによって(ステップ1.3.8を参照)、または単にバッファーの新鮮なバッチを使用することによって、それぞれ克服することができます。さらに、生殖細胞移植実験における奇形宿胚は、過剰に高いモルフォリノ濃度から生じる可能性がある。宿主の野生型生殖細胞を完全にアブライズし、それによってこれらの細胞が子孫に寄与するのを防ぐのに十分なモルフォリノを使用することが重要であるが、同時に、過度に高いモルフォリノール濃度を避ける必要がある。したがって、注射されたすべての宿主胚(典型的な実験では数百個)にわたる一貫したモルフォリノ量が生殖細胞系列移植の成功の鍵となる。これは、すべての胚が同じ注入量を受け取ることを確実にするために蛍光体型顕微鏡で追跡することができる容易に目に見えるトレーサーdye14でモルフォリノ注入ミックスを補うことによって助けることができる。
このプロトコルで説明されている手順は、ブラスタステージゼブラフィッシュまたはメダカ胚の細胞の操作のみを含むが、将来的には、移植針の直径と形状を変更することによって、異なる段階や種にデバイスを適応させることができる可能性が高い。

胚軸1の形成を指示する主催者の存在を実証したマンゴールドとスペマンの古典的な実験から、胚間の細胞移植は胚発生を研究するための確立された技術となっている2,3,4,5,6,7,8,90 .移植に一般的に使用されるセットアップは、柔軟なチューブを介してマイクロピペットホルダーに接続されたマイクロメーター駆動制御ガスタイトシリンジと鉱物油で満たされた貯水池12,13で構成されています12,13。この設定では、シリンジのプランジャーがねじを通って移動します。この方法で発生する圧力は、マイクロピペットに移され、ある胚から細胞を引き出し、別の胚に堆積させるために使用される。しかし、この油圧式装置は多くの部品から成り、最初から組み立てるのは面倒である。同様のデバイスは、通常は手動マイクロインジェクターとして販売される完全なワーキングセットとして購入することができ、これらの商用バージョンは通常1500米ドル以上の費用がかかります。自家製と市販の両方のバージョンでは、胚操作用のマイクロピペットは、油で満たされたチューブを介して圧力発生装置(気密注射器)から分離されます。したがって、マイクロピペットの操作とプランジャーの動きは、異なる手で別々に操作する必要があり、スループットと有用性を低下させます。さらに、チューブは気泡の形成を避けながら油で慎重に充填する必要があるため、移植の準備には手間がかかります。ここでは、安価で組み立てやすく、使いやすい細胞の除去および移植のための代替空気圧操作装置について説明する。
ここに示す装置はマイクロピペットのホールダーが付く25 μLのガスタイトなシリンジから成り、費用は80米ドル以下である。装置はLuerロックの付属品によってシリンジにマイクロピペットのホールダーを挿入することによって容易に組み立てられる(図1A)。その後、デバイスをマイクロマニピュレーターに直接取り付け、ユーザーはマイクロマニピュレータで直接片手で位置と吸引の両方を制御することができます。これは、ドナーおよび宿主胚を含む移植皿を安定させ、移動させるために他方の手を自由に残すのが便利である。装置は空気と直接吸引によって働き、鉱物油で満たされる必要はない。水とガラス針の壁の間の魅力的な力のために、水位がガラス針の先細り端にある限り、注射器のプランジャーの大きな動きは、針内の水位の小さな動きに変換されます。これにより、吸引細胞の数とその挿入位置を正確に制御できます。
この装置の有用性を実証するために、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)胚に3つの応用を提示する。まず、分泌されたシグナル伝達分子の局所的な発生源を生成する方法を示し、この分子を用いて、勾配形成の研究に使用できる2,4,6を示す。ここで、ドナー胚は、蛍光標識されたシグナル伝達分子をコードするmRNAを注入する。蛍光標識ドナー細胞は、次いで野生型宿主胚に移植され、シグナル勾配の形成を画像化して分析することができる。次に、この装置を使用して、サイズ縮小胚5,13を生成するために駆除によって細胞を除去する方法を説明する。最後に、胚芽がアブラジレートされた宿主胚に原始胚細胞レポーターを運ぶ細胞を移植することによって、母体-接合体突然変異体を強固に産生する方法を示す。将来的には、ここで説明する移植装置は、細胞の除去または移植を必要とする他の胚学的操作に容易に適応することができる。

<table><tbody><tr><td>1.0mmのガラスキャピラリー、端部はフィラメント</td><td></td><td></td>なしでカット <td>移植針を作るには</td></tr><tr><td>1.0mmのガラスキャピラリー、端部をフィラメント</td><td></td><td></td>でカット <td>注射針を作るには</td></tr><tr><td>200mLのガラスビーカー</td><td></td><td></td><td>胚のデコレーション用</td></tr><tr><td>24ウェルプラスチックプレート</td><td></td><td></td><td>胚をインキュベート</td></tr><tr><td>するためにアガロースでコーティングする直径5cmのガラスシャーレ</td><td></td><td></td><td>胚のデコレーション用</td></tr><tr><td>6ウェルプラスチックプレート</td><td></td><td></td><td>胚をインキュベートするためにアガロースでコーティングする</td></tr><tr><td>アガロース</td><td></td><td></td>をコーティング<td>する プラスチック皿をコーティングするには</td></tr><tr><td>dnd1 モルフォリノ</td><td>遺伝子ツール</td><td></td><td>配列:GCTGGGCATCCATGTCTCCGAC CAT</td></tr><tr><td>胚培地</td><td></td><td></td><td>250 mg/L インスタント オーシャン ソルト、1 mg/L メチレン ブルー、逆浸透水、NaHCO3</td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡、GFP/RFP フィルターと光源</td><td></td><td></td>付き <td>YSL 注射と生殖細胞系移植を評価するには</td></tr><tr><td>ガラス製マイクロピペット プーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td>移植針を作るには</td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>胚のピペッティング用; 先端を炎状にしてエッジ</td></tr>インキュベーターを滑らかにすることができます <tr><td>28 °;C</td><td></td><td></td><td>ゼブラフィッシュ胚の孵化用</td></tr><tr><td>Luer tip 25 &mu;L ハミルトンシリンジ 1700シリーズ</td><td>ハミルトン</td><td>Ref:80201</td><td>移植装置の一部</td></tr><tr><td>3軸の動きを持つ手動マイクロマニピュレーター</td><td>成茂</td><td>M-152</td><td>移植装置制御用</td></tr><tr><td>手動ピペッティングポンプ</td><td>Bio-Tek</td><td>Cat. # 641</td><td>胚移植用ガラスピペット用</td></tr><tr><td>金属解剖プローブ</td><td></td><td></td><td>移動・回転用ゼブラフィッシュ胚</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>成重</td><td>MF2</td><td>移植針を作るには</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション装置</td><td></td><td></td><td>胚へのmRNAとモルフォリノの注入用</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションモールド、三角形の溝</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>アガロースマイクロ</td></tr><tr><td>インジェクションモールド、シングルウェル</td>でマイクロインジェクションプレートを調製するには 適応<td>科学ツール</td><td>PT-1</td><td>アガロースマイクロ</td></tr><tr><td>ピペットホルダー付きルアーフィッティング付き1.0mmガラスキャピラリー用移植</td>プレートの作製 <td>ワールド精密機器</td><td>MPH6S10</td><td>移植装置の一部</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 転写キット</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>AM1340M</td><td>胚に注入するキャップ付きmRNAを作製</td></tr><tr><td>プラスミド with GFP-nos1 3'UTR</td><td></td><td></td><td>nos1プラスチックシャーレ100mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>の3'UTRでGFPをコードするmRNAを生成するために転写できるプラスミド <td>注射および移植皿を作るためにアガロースでコーティングされる</td></tr><tr><td>Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td>からのプロテアーゼ <td>胚のデコレーション用: 5 mg/mLのストックを調製し、1 mg/mLで使用して胚</td></tr><tr>Ringer'をデコレーションします<td>。</td><td></td><td></td><td>1 Lの場合:NaCl 6.78 g、KCl 0.22 g、CaCl2 0.26 g、HEPES 1.19 gを加え、1 Lまで充填し、pH を 7.2 に調整し、ろ過で滅菌します</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td>注射および移植用</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚の簡易かつ効果的な移植装置

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

細胞の除去や胚の内外への細胞移植などの古典的な胚学的操作は、複雑な発達過程を研究するための強力な技術です。ゼブラフィッシュ胚は、簡単にアクセスでき、サイズが比較的大きく、透明であるため、これらの操作に理想的です。しかし、以前に開発された細胞の除去および移植のための装置は、使用するのが面倒であるか、購入するのに高価である。対照的に、ここで提示される移植装置は経済的で、組み立てやすく、使いやすい。本プロトコルでは、まず、移植装置の取り扱いならびにその組み立てについて、市販品や広く入手可能な部品から紹介する。次に、局所的な供給源からのシグナル分散を研究するための異所性クローンの生成、サイズ縮小胚を生成するための細胞の駆除、および母体ザイゴティック変異体を生成するための生殖細胞移植の3つの用途を提示する。最後に、このツールは、日本の米魚メダカなどの他の種の発生操作にも使用できることを示しています。

上記3つの用途に対する移植装置の使用における成功及び失敗は、実体顕微鏡下での目視検査によって容易に評価することができる。移植に成功した場合、胚は胚芽に大きな涙を流すことなく、移植されていない胚と形と黄身の透明度が正常で似ているはずです。胚が目に見えて損傷している場合(図4B)、正常に発達しない。理想的には、蛍光マーカーを発現する移植細胞は、蛍光体顕微鏡下で見たときに連続カラムとして現れるべきである(図2A、 図4A)。カラムが断片化している場合、これは細胞が移植針への吸引によって切断されたか、細胞の沈着があまりにも激しく行われたことを示している。これは、プランジャーをよりゆっくりと穏やかに動かすことで防止できます。
移植装置は主に胚芽期5,6のゼブラフィッシュ胚に用いられているが、日本の米魚メダカのデコリオネート胚(オリジアス・ラティプ)の移植および細胞駆出作業も同様に行われている(図2B)。ポラジンスキー、S.R.ら17によって記述されている胚のデコール化とは別に、上記と同様の手順に従うことができる。
生殖細胞系列移植の特定の場合、良好な移植は、卵黄のマージンの真上に細胞の長い水平列を有する胚をもたらす(図4A)。しかし、胚芽期におけるGFPの背景発現に起因して、胚細胞が正常に移植されたかどうかは、翌日(図4C-F)にのみ評価できる(図1F)。原始胚芽細胞は、卵黄の伸長のすぐ上の溝に小さな蛍光球として現れます(図4C-E)。正しい場所にこれらの細胞が存在すると、生殖細胞の移植に成功したことを示しています。異なる形状を有する細胞は生殖細胞ではない(例えば、細長い細胞は典型的には筋細胞、図4F)。また、原始胚細胞が溝の外に見つかった場合、これは正常に移行できなかったことを意味し、胚の生殖細胞に寄与することはできません。最後に、移植された胚の一般的な形態は、移植されていない胚に似ているように見えるはずです(図4D)。尾を変形させず、頭を縮めたり、目を見失ったりしてはならない(図4E)。これらの欠陥は、一般的に、過剰に高いモルフォリノ濃度または移植中の胚損傷から生じる。ここで説明する生殖細胞移植実験は、実験者の経験に応じて、通常、ドナー胚の60%〜80%に対して正常に移植された胚6個中1〜2個をもたらす。したがって、40〜50個のホモ接合性ドナー胚の細胞を200〜300個の宿主胚に移植し、突然変異生殖細胞を有する約30個体を飼育する必要がある。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig01.jpg"> 図1:移植装置の組み立てと使用法. (A)移植装置は、Luerロックフィッティングを介してマイクロピペットホルダーとガス密閉シリンジを接続することによって組み立てられる。移植のためのガラス針は、その後、マイクロピペットホルダーに挿入されます。(B)マイクロマニピュレーターに取り付けられた組み立て移植装置の写真(背景とラベルが画像から取り除かれたことに注意してください)。(C)移植装置を使用する場合、移植針の水位がテーパーエンドに残っていることを確認することが重要である。(D)この装置は、移植皿の個々の井戸に入れられたテレオスト胚から細胞を引き出し、挿入するために実体顕微鏡で使用される。(e)異所源の生成のために、細胞はドナー胚(i-ii)の動物極から採取され、宿主胚(iii-vi)の動物極に移される。(f) 生殖細胞移植の場合、生殖細胞が位置するドナー胚(i-ii)の余白から、より多くの細胞が採取される。次に、細胞は宿主胚(iii-vi)のマージンに移される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig02.jpg"> 図2:細胞移植によるクローンの生成.(A)ゼブラフィッシュドナーからゼブラフィッシュ宿主胚への蛍光細胞(緑色)の順次移植によって生成される二重クローンの例。単一クローンと二重クローンを用いて、分泌されたシグナル伝達分子が、どのように時空間的勾配を形成するかを研究することができます2,4,5,6.(B)トランスジェニックeGFP発現メダカドナー(ウィンブルドン)17から野生型メダカ宿主体に細胞を移植して生成した単一クローンの例。スケールバーは100 μmを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig02large.jpg" target="_blank">します</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig03.jpg"> 図3:細胞駆出によってサイズ縮小胚を生成する(A)駆除によって細胞を除去する前に、YSLをYSLの2つの反対側に蛍光色素を注入することによって標識することができる。(B)YSL注射後の胚の例。(C)サイズ縮小胚を生成するために、動物の極から細胞が駆除5によって除去される。(D)細胞駆出後の胚の例。YSL はそのまま残ります。スケールバーは100 μmを表<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig03large.jpg" target="_blank">します</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62767/62767fig04.jpg"> 図4:生殖細胞移植(A)宿主の周辺領域へのドナー細胞(緑色)の移植に成功した例。(B) 移植失敗の例宿主胚の黄身はひどく損傷し、胚は正常に発達することができない。(C)30hpfで、正常に移植された胚芽細胞は、黄身拡張の前領域の性腺中胚葉のみに見られる。(D)いくつかのGFP標識ドナー生殖細胞が宿主の将来の生殖腺に住む移植に成功した例。(E) 移植失敗の例生殖細胞は性腺中胚に達しているが、宿主胚は重度に変形し、正常に発達しない。(F) 移植失敗の例。正しい場所に移行できなかった蛍光生殖細胞は、生殖腺を再移植しません。スケールバーは100 μmを表します。D-Fの画像は、約50倍の総倍率で撮影<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62767/62767fig04large.jpg" target="_blank">されました。</a>

細胞の駆出や移植などの発生学的操作は、早期の発達を研究するための重要なツールです。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚でこれらの操作を行う簡単で効果的な移植装置を記述する。

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

この技術は、異所性シグナル伝達源を移植することにより、胚発生時のシグナル伝達分子の機能と範囲を研究することを可能にする。また、生殖細胞系列変異体の効率的な生成を容易にする。このプロトコルは、ブラストラステージゼブラフィッシュおよびメダカ胚に適用することができ、おそらく他の胚段階およびTDO種にも適用することができる。移植装置を組み立てるには、ルアーロックフィッティングを使用して、25マイクロリットルガスタイトシリンジをマイクロピペットホルダーに接続します。次に、デバイスを手動マイクロマニピュレータに直接取り付けます。移植装置を使用するには、組み立てられた装置を持つマイクロマニピュレータをステレオ顕微鏡の隣に置きます。その後、プランジャーを取り外し、移植針を挿入します。針の先端が浸るまで、リンガーの溶液を45度の角度で満たした皿に針を下ろします。プランジャーを約半分に挿入してリンガーの溶液を洗い流し、針の細いテーパー部分に少量の水しか残さずに入れます。移植用針を初めて使用する場合は、犠牲胚からヨークを引き出し、ヨーク材料を完全に排出して、針の内側をコーティングします。次に、移植針を使用して、ドナー胚を穏やかに配置し、次に、針開きの胚表面に直交する針を配置し、慎重にプランジャーを引き出して細胞を針に引き込む。所望の数の細胞が引き込まれたら、プランジャーを軽く押し下げて吸引を止め、短く迅速な動きで針を横にぎくしゃくして胚から針を取り除きます。細胞を針の先細り端に制限することで、リンガーの溶液を細胞列の両側に残します。プランジャーを上下にゆっくりと動かし、リンガーの溶液で細胞を洗うことによって、残りの黄身または細胞の破片を取り除きます。次に、非支配的な手で移植皿を動かし、宿主胚の表面に直交する針を位置づける。慎重に壁に絞ることによって、胚にわずかな圧力を適用します。その後、迅速な鋭い動きで、針で黄身を傷つけないように注意して宿主胚の包み込み層を突き刺す。針が中に入ったら、プランジャーを軽く押して細胞の柱を胚に押し出し、針を同時にゆっくりと引き込みます。生殖細胞の移植のために、リンガーの溶液で移植皿を充填し、その後、デコリオ化された球体をドームステージ胚を移植皿に移し、宿主およびドナー胚を交互の柱に配置し、1つのドナー胚から6つの異なる宿主胚に細胞を移植する。移植を行うために、移植針に向けてマージンを持つ胚を向ける。生殖細胞移植の場合、ソース細胞をマージンから取り出し、宿主胚の同じ場所に沈着させる。移植が完了したら、胚がリンガーの溶液中で30分から1時間回復することを可能にする。次に蛍光ステレオ顕微鏡を用いて、移植した細胞を調べる。次に、同じドナーから細胞を受け取ったすべての宿主胚を同じウェルにグループ化した胚培地を有する24の十分なアガロースコーティングプレートに胚を移す。その後、次の日まで摂氏28度で胚をインキュベートします。必要に応じて、ドナー胚を標識PCRストリップに移してジェノタイピングを行います。受精後30時間、蛍光ステレオ顕微鏡下で生殖細胞移植を成功させるために宿主胚をスクリーニングする。胚芽細胞は、卵黄の伸びの上の溝に存在するべきである。正常に移植された幼虫を成人フードに成長させる。移植に成功すると、胚は胚芽胚に大きな涙を流すことなく、移植されていない胚に正常で形と黄身の透明度が似ています。対照的に、移植中に胚が目に見えて損傷した場合、正常に発達しない。この移植装置は主に胚芽期のゼブラフィッシュ胚に用いられてきたが、移植や細胞駆出は、日本の米魚メダカのデコリオネート胚期胚でも行うことができる。生殖細胞系列移植の特定の場合、良好な移植は、卵黄のマージンの真上に細胞の長い水平列を持つ胚をもたらす。しかし、この処置の成功は、生殖細胞が体細胞との蛍光で区別される場合にのみ、受精の24〜30時間後に評価することができる。原始胚芽細胞は、黄身の伸びの真上の溝に小さな蛍光球として現れます。正しい場所でのこれらの生殖細胞の存在は、生殖細胞移植に成功したことを示す。移植の失敗例をここに示す。最初の例では、胚細胞が性腺中胚に達しているが、宿主胚が重度に変形するにつれて、正常に発達しない。第2の例では、蛍光細胞は溝の外側でのみ検出される。これらの細胞は、正しく移行できなかった体細胞または生殖細胞のいずれかです。そして、両方の細胞タイプは、胚の生殖細胞株に寄与しません。移植細胞および宿主胚への損傷を避けるために重要である。細胞はゆっくりと描かれ、残りの黄身を取り除き、慎重に挿入する必要があります。この方法は、ゼブラフィッシュ胚の細胞を移植する簡単な方法を提供し、異所性源および生殖細胞系変異体を生成するのに有用であろう。この装置の主な利点は、それは低コストであり、多く、使用しています。

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Research

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