Name: 組換えCa2+-ATPaseNドメインにおけるトリプトファン残基の化学修飾 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学ぶトリプトファン残基の化学修飾と蛍光分光法によるANS結合解析。組換えCa²⁺-ATPase Nドメインを用いて、FRET様エネルギー移動とタンパク質動態の関係を解明する生化学的手法です。

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この作品は、FAI-UASLP助成金番号C19-FAI-05-89.89およびCONACYT助成金番号316463(アポヨス・ア・ラ・シエンシア・デ・フロンテーラ:フォルタレシミエント・イ・マンテニミエント・デ・インシュタエンストラス・デ・インベスティガシオン・デ・ウソ・コンン・イ・カパシタシオン・テクニツァン)によって部分的に資金提供されました。著者らは、ビデオ版でジュリアン・E・マタ・モラレスの技術的支援に感謝しています。

1. ANSとSERCA Nドメイン相互作用の決定(インシリコで)
<ol><li>好ましいタンパク質モデリングソフトウェア50を用いて分子モデリングによりタンパク質の3次元(3D)構造を生成する。</li>
	<li>好ましい分子構造ソフトウェア51を用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、ArgおよびLys残基35の存在を決定する。これらは、ANS結合および蛍光強度(量子収率)を増加させるために必要とされる。</li>
	<li>分子ドッキング(好ましいドッキングソフトウェアを使用して)52、53、54を用いてATP、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(ヌクレオチド結合部位を標識するLys515との共有結合を形成する)と、ヌクレオチド結合部位におけるアミノ酸残基を有するANSとの相互作用を決定する(図1)。</li>
	<li>好ましいソフトウェアの測定ツールを使用して、Trp残基と結合ANSの間の分子距離(Å)を計算します。</li>
	<li>ANS-N-ドメイン複合体の分子動力学シミュレーションを行い、相互作用の安定性を決定する52,54.次いで、複合体の安定性が確認された場合にインビトロ実験を行う。</li>
</ol>2. 組換えNドメインの発現と精製
<ol><li>N-ドメイン40の遺伝子コードを合成する。</li>
	<li>N-ドメイン40をコードする合成遺伝子を含むプラスミドを設計し、構築する。</li>
	<li>アフィニティークロマトグラフィー(Ni-NTA)によって発現精製し、組換えN-ドメインを設計した。精製したタンパク質のSDS-PAGEを行い、純度を決定する(図2)40。</li>
	<li>N-ドメインの消滅係数(ε= 11,960 M-1・cm-1)40で280nmのλでの吸光度を調べてタンパク質濃度を決定する。</li>
</ol>3. ANSとN-ドメインの蛍光強度変化に基づいて、ANS-N-ドメイン複合体の形成を監視します。
<ol><li>N、N-ジメチルホルムアミドでANSストック溶液を調製する。<ol>
<li>少量(1〜5mg)のANSを秤量し、最終体積のN、N-ジメチルホルムアミド、例えば3.2mg(10.69mM最終濃度)の1mLに溶解する。</li>
		<li>N、N-ジメチルフォルマミド、例えばpH 8.0の990.6 μLの50 mMリン酸緩衝液に10.69 mM ANS溶液の9.4 μLを加えて、100μM ANS水溶液を調製し、最終体積1mLを得る。</li>
		<li>15 sの場合は3~5回のボルテックスで溶液を混ぜます。 注: 次の実験では、ANS 水溶液溶液のみを使用します。実験を開始する前に、ANS水性ストック溶液を新たに調製してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>NBSストック溶液をN,N-ジメチルホルムアミドで調製する。 <ol>
<li>少量(1〜5mg)のNBSを秤量し、それを1mLのN、N-ジメチルホルムアミド、例えば1mL(29.78 mM最終濃度)で5.3mgに溶解する。 </li>
		<li>N、N-ジメチルフォルマミド、例えば、pH 8.0の90.64 μLの90mリン酸緩衝液に29.78 mM NBS溶液の3.36 μLを加えて、最終容積0.1mLを得るために、N、N-ジメチルフォルマミドのNBS溶液を使用して1 mM NBS水性ストック溶液を調製します。 </li>
		<li>15 sの場合は3~5回のボルテックスで溶液を混ぜます。 注:実験を開始する前に、NBS水溶液を新たに準備してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>N-ドメインをANSで評価し、25°Cでλ=295nmで励起して蛍光スペクトルを記録する。<ol>
<li>蛍光スペクトルベースラインを取得する。<ol>
<li>1 mL の蛍光クオーツ キュベットに pH 8.0 と 50 mM リン酸バッファーの 1 mL を入れます。</li>
			<li>分光フルオロメーターの熱述式セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。</li>
			<li>蛍光スペクトル(305-550nm)を記録する。 注: pH 8.0 の 50 mM リン酸バッファーの蛍光スペクトルは、pH 8.0 で、得られたすべての蛍光スペクトルから差し引かれます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nドメインの本来の蛍光スペクトルを取得する。<ol>
<li>蛍光クォーツキュベットにpH 8.0の50 mMリン酸バッファーの900 μLを入れます。</li>
			<li>N-ドメイン(10 μM)のサスペンションを100 μL加えて、1 mL最終ボリュームに1μM Nドメイン最終濃度を得ます。</li>
			<li>溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。 注:タンパク質は、高品質の固有蛍光スペクトルを得るために精製されたばかりで、例えば、精製組換えNドメインは、精製後1週間だけ使用することができる。</li>
			<li>分光フルオロメーターの熱述式セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。</li>
			<li>Nドメイン固有蛍光スペクトル(305〜550nm)を記録する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ANSを追加し、λ=295 nmで励起して蛍光スペクトルを得る。<ol>
<li>100 μM ANS水系ストック溶液の2 μL アリコートを、懸濁 N ドメイン(1 μM)に加え、0.2 μM ANS 最終濃度を得ます。</li>
			<li>溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。</li>
			<li>分光フルオロメーターの熱安定セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。</li>
			<li>蛍光スペクトル(305-550 nm)を記録する。</li>
			<li>ANSの追加と蛍光スペクトル記録を1:1モル関係ANS:Nドメイン以上に繰り返します。</li>
			<li>適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。</li>
			<li>すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。</li>
			<li>スペクトルがFRETのようなパターンを形成しているかどうかを判断します。ANS-N-ドメイン蛍光スペクトルは、FRET様パターンを形成する(図3A)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. N-ドメイン内の蛍光の組み込み Trp 化学修飾による NBS.
<ol><li>ステップ 3.3.1 と 3.3.2 を繰り返します。</li>
	<li>1 mM NBS水性ストック溶液の1 μLアリコートを懸濁Nドメイン(1 μM)に加え、1 μM NBSの最終濃度を得ます。</li>
	<li>溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを20回使用して穏やかに均質化する。</li>
	<li>分光フルオロメーターの熱安定セルチャンバー(25°C)にセルを配置し、励起λを295nmに設定します。</li>
	<li>蛍光スペクトル(305-550 nm)を記録する(図3B)。</li>
	<li>N-domain固有蛍光クエンチが40を観察するまで、NBS付加および蛍光スペクトル記録を繰り返す。N ドメインでは、通常、この現象は 5-6 NBS/N ドメイン40のモル比で発生します。 注:NBSは急速に(<5 s)Nドメインの内在蛍光をクエンチ;蛍光強度の低下が観察される。NBSが他のアミノ酸残基47と反応し得るように、直ちに次のステップに進む。</li>
	<li>適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。</li>
	<li>すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3B)。</li>
</ol>5. 蛍光スペクトルを25°Cで記録することにより、NBS修飾NドメインをANSで活性化する。
<ol><li>ステップ 4 で生成された NBS 変更 N ドメインを使用して、ステップ 3.3.3 を実行します。</li>
	<li>適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。</li>
	<li>すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3C)。</li>
	<li>生成された蛍光スペクトル(図3C)は、FRETの発生を支持または反論する、すなわち、FRETが発生した場合、ANS蛍光は増加しないし、その逆もまた同様である。</li>
</ol>6. λ=370 nmでの励起により化学修飾NドメインにANS結合の証拠。
<ol><li>ステップ 4 で生成された NBS 修正 N ドメインを使用してステップ 3.3.3 を実行しますが、励起 λを 370 nm に変更します。</li>
	<li>適切なソフトウェアを使用して、各スペクトルからブランクスペクトルを差し引きます。</li>
	<li>すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします (図 3D)。</li>
	<li>ANS蛍光強度の増加を観察することにより、Nドメインに結合するANSを確認する。Nドメインに結合するANSは、λ=370nmで励起されると蛍光増加を示す(図3D)。対照として、pH 8.0を有する50mMリン酸緩衝液中のANS(単独)の蛍光スペクトルは、λ295および370nmでエキサイティングな取得された(図4、ビデオには示されていない)。 注:化学修飾に必要なNBS:Trpの化学論的関係は、研究46、47、55、56の下でタンパク質中のTrp残基の埋め込みの程度に依存します。したがって、事前にNBS:タンパク質/(Trp)モル比を決定することをお勧めします。</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された場合にFRET様パターンを表示し、一方、Trp残基とANSとの間の分子距離(20Å)はFRETの発生を支持しているようだ(図1)。NBSによるTrp化学修飾は、蛍光Nドメインの低下をもたらす(図3B、スペクトラムf)。したがって、エネルギー転送は不可能です。ANS蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された非修飾Nドメインのスペクトルと類似している(図3A及びC)。
したがって、295nmのλでのANSの直接励起は、ATP結合部位(図3C)に結合する際のANS蛍光の主な供給源であり、これは他の著者28によって提案されたメカニズムと一致している。したがって、Trp残基から結合ANSへのFRETは、N...

フェスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質構造および機能研究1、2、3、4における結合または相互作用後の分子構造間の距離を決定するための標準的な技術となっている。P型ATPAでは、FRETはサルコ・エンデュラム・Ca2+-ATPase(SERCA)2、5、6、7、8、例えば、FRET7によってタンパク質全体の構造と機能を調べるのに用いられている。
FRETドナーは多様であり、小さな蛍光(外因性)分子から蛍光タンパク質9,10まで多岐にわたります。トリプトファン(Trp)残基(蛍光による)は、タンパク質アミノ酸配列11,12の構造変化を同定するのに有用である。Trpの蛍光強度は、周囲の環境13,14の極性に大きく依存する。リガンド結合は通常、タンパク質/酵素15,16において構造的な再配置を生じさせる。Trpがタンパク質結合部位に存在するか、または近くに位置する場合、構造変動は水性媒体13、14へのTrp曝露の程度にしばしば影響を及ぼす。したがって、極性の変化は、Trp蛍光強度13、14の焼入れをもたらす。したがって、Trpの蛍光特性は、酵素のリガンド結合研究を行う上で有用である。他の物理現象は、Trp蛍光17、18、19、20、例えば、FRETおよび中極性の変化を導く可能性がある。Trpの励起状態からフルオロフォアへのエネルギー伝達も潜在的な用途を有し、例えば、タンパク質21における小さなリガンドの親和性決定も可能である。実際、Trpは主にタンパク質22、23、24、例えばテルビウム(Tb3+)FRET研究においてFRET研究において蛍光ドナーとして使用されてきたが、Trp残基はTb3+25、26、27へのエネルギー伝達のためのアンテナとして頻繁に使用されている。Trpは、タンパク質構造におけるその固有の構成的特徴に起因する他のFRETドナーに対して様々な利点を示し、研究したタンパク質24の機能/構造に影響を与える可能性のある予備プロセスの必要性を排除する。したがって、放射崩壊の同定(エネルギー移動およびタンパク質構造再構成によって誘導される中極性の変化)は、タンパク質構造研究13、14、19、28におけるリガンド結合に関する正確な結論を導き出す上で重要である。
タンパク質構造研究において、外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、タンパク質のフォールディング/展開28,29に関連する実験に主に使用されてきた。ANSは、天然の状態でタンパク質/酵素に結合します, 通常、基質の結合部位で 31,32,33;ANS蛍光量子収量(ΦF)の増加(すなわち、蛍光強度の増加)は、疎水性ポケット内のArgおよびHis残基とのANSの適切な相互作用が34、35、36、37に生じたときにλ=370nmでタンパク質を励起することによって誘導される。様々な研究では、Trp残基(ドナー)とANS(アクセプター)の間のFRET(280-295 nm以内のλでエキサイティングな場合)の発生が報告されており、これは以下に基づいている:1)Trpの蛍光発光スペクトルとANSの励起スペクトルの重複、2)1つ以上のTrp残基(s)とANSの間の適切な距離の同定 3)タンパク質ポケットに結合したときの高いANS量子収率、および4)ANS3、17、27、37、38の存在下でタンパク質の蛍光スペクトルにおける特徴的なFRETパターン。
最近、SERCAおよび他のP型ATPasesにおけるヌクレオチド結合ドメイン(Nドメイン)へのリガンド結合は、40、41、42、43、44、45、46の組換え組換えNドメインを用いて検討されている。SERCA Nドメインの分子工学は、唯一のTrp残基(Trp552Leu)をヌクレオチド結合部位に近いより動的な構造(Tyr587Trp)に移動するために使用され、そこでは、リガンド結合時の構造変化(クエンチング)を使用して、リガンド結合時の構造変化を監視することができる。実験結果は、ANSが精製組換えSERCA N-domain34中のヌクレオチド結合部位に(ATPとして)結合することを実証した。興味深いことに、ANS蛍光は295nmのλで励起時にNドメインに結合すると増加し、Nドメインの固有蛍光は34を減少させ、それによってTrp-ANS FRETペアの形成を示唆するFRETパターンを産生する。
NBSの使用は、改変タンパク質の吸光度アッセイによりタンパク質47中のTrp残基の含有量を決定するために提案されている。NBSは、Trpの吸収性の高いインドール基を、吸収性の低いオキシインドール47、48に変更する。これは、Trp蛍光性40の損失(クエンチング)をもたらす。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、FRETが仮説を立てられたときのTrp(ドナーとしての)役割を定義するアッセイとして使用され得る。
このプロトコルは、タンパク質モデルとしてSERCAの組換えN-ドメインを設計したN-ドメインにおけるNBSによる唯一のTrp残基の化学修飾を記述する。実験結果は、ANS蛍光強度が、本質的な蛍光を欠いている化学的にNBS修飾Nドメイン34において依然として増加することを示す。したがって、このアッセイは、N-ドメイン34、40、49に結合した場合にTrp残基とANSの間にFRETの欠如を実証するのに有用である。したがって、このアッセイ(TRPのNBS化学修飾)は、タンパク質中のTrp-ANS FRETペアの存在を証明するのに有用である。

<table><tbody><tr><td>アクリルアミド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610107</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610700</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A1028</td><td>フルオロフォア</td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1610125</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>N-ブロモスクシンイミド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>B81255</td><td>化学薬品修飾</td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>J.T. Baker</td><td>9213-12</td><td>原液調製</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>化学蛍光ラベル</td></tr><tr><td>蛍光キュベット</td><td>ヘルマ</td><td>Z801291</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>蛍光分光蛍光計</td><td>島津</td><td>製作所 RF 5301PC</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>HisTrap&trade;FF</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0004-59</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>IPTG、ジオキサンフリー</td><td>American Bionalytical</td><td>AB00841-00010</td><td>タンパク質発現</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>LB培地</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10000713</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>Pipetman L P10L</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>Pipetman L P100L</td><td>Gilson</td><td>FA10004M</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>Pipetman L P200L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>Pipetman L P1000L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>Pipetman L P5000L</td><td>Gilson</td><td>FA10007</td><td>蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>Precision plus std</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性</td>ナトリウム <td>J.T. Baker</td><td>3828-19</td><td>バッファー調製</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>J.T. Baker</td><td>3818-01</td><td>バッファー調製</td></tr><tr><td>シリンジフィルター 0.2</td><td>um ミリポア</td><td>GVWP04700</td><td>溶液ろ過</td></tr><tr><td>Temed</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td>SDSページ</td></tr><tr><td>トリス</td><td>・バイオ・ラッド</td><td>1610719</td><td>SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

組換えca2+-atpasenドメインにおけるトリプトファン残基の化学修飾

Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET

サルコ/小胞体Ca2+-ATPase(SERCA)は、様々な立体構造で結晶化されたP型ATPaseです。それにもかかわらず、詳細な機能情報は、分離組換えドメインから得ることができる。この組み換えヌクレオチド結合ドメイン(N-ドメイン)は、リガンド結合時に蛍光消光を表示する(Trp552LeuおよびTyr587Trp)。外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、アルグ、ヒス、アラ、ルー、およびPhe残基との静電および疎水性相互作用を介してヌクレオチド結合部位に結合する。ANS結合は、370nmの波長(λ)で励起された場合の蛍光強度の増加によって証明される。しかし、295nmのλで励起すると、蛍光強度の増加は、Nドメイン固有蛍光の急行に結合されるようである。蛍光スペクトルは、フェスター共鳴エネルギー伝達(FRET)様のパターンを示し、Trp-ANS FRETペアの存在を示唆し、Tyr587TrpとANSの間の短距離(〜20Å)によって支持されているように見える。本研究では、N-ブロモスハクイミド(NBS)によって媒介されるTrp化学修飾(および蛍光焼入れ)によるTrp-ANS FRET対の分析について説明する。化学修飾N-ドメインでは、ANS蛍光は295nmのλで励起されると増加し、λ370nmで励起された場合と同様である。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、TrpとANSの間のFRETの不在をプローブするために使用することができる。Trp蛍光がない場合、ANS蛍光の増加を観察すべきではありません。NBSによるタンパク質中のTrp残基の化学修飾は、結合ANSに近いTrp残基間のFRETを調べるのに有用であり得る。このアッセイは、他の蛍光ホルを使用する場合にも有用である可能性が高い。

分子ドッキングは、静電および疎水性相互作用を介したNドメインのヌクレオチド結合部位へのANSの結合を示す(図1)。Trp残基とANS(ヌクレオチド結合部位に結合)との間の分子距離(20Å)は、FRETの発生をサポートする(図1)。この設計された(設計された)組換えN-ドメインは、アフィニティークロマトグラフィー(図2)により高純度で得られ、蛍光実験に適したものである。ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、λ=295nmでの励起時にFRET様パターンを示した(図3A)。NBSによるTrp残基の化学修飾は、Nドメインの本来の蛍光の焼入れにつながった(図3B)。化学的にNBS修飾Nドメインにおいて、実験結果は、非修飾Nドメインで観察されたのと同様に、Λ=295nm(図3C)での励起時...

ANSはCa2+-ATPase組換えNドメインに結合する。蛍光スペクトルは、295nmの波長で励起時にFRET様パターンを表示します。TrpのNBS媒介化学修飾は、Nドメインの蛍光を発し、Trp残基とANSとの間のエネルギー移動(FRET)の欠如をもたらす。

組換えCa2+-ATPaseNドメインにおけるトリプトファン残基の化学修飾

The sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA) is a P-type ATPase that has been crystallized in various conformations. Detailed functional ...

これらのアッセイは、ANS結合試験を行う際に、タンパク質におけるトリプトファン残基の役割を明らかにするのに役立つ可能性がある。ANS蛍光は、タンパク質中の特定の構造部位に結合すると増加します。時にはANS結合部位は、トリプトファンとANSの間のFRETの存在を示唆する距離を有するトリプトファン残基の近くに位置する。NBSは、タンパク質中のトリプトファン残基の化学修飾を仲介し、その蛍光を消光する。したがって、これらのアッセイは、トリプトファン残基がFRETによるANS蛍光強度の増加に寄与するかどうかを決定することを可能にする。本研究では、変異を含むSERCAから作製された組換えヌクレオチド結合ドメインを用いて、ANSも結合するヌクレオチド結合部位に近いトリプトファンを見つけることを目指す。このアッセイは迅速かつ実行が容易であるため、その主な利点です。ANSとSERCA Nドメイン相互作用のインシリコにおける決定好ましいタンパク質モデリングソフトウェアを用いて分子モデリングによりタンパク質の立体構造を生成する。好ましい分子構造ソフトウェアを用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、アルギニンおよびリジン残基の存在を決定する。これらはANS結合に必要であり、蛍光強度を高める。SERCAのヌクレオチド結合部位にアルギニンおよびリジン残基が存在するため、ANSのNドメインへの結合を仮説する。3Dモデルでは、ATP結合部位を形成するアミノ酸残基がオレンジ色で同定され、強調表示される。同様に、チロシンからトリプトファンへの突然変異は、青で位置し、強調されている。ATP、FITC、およびANSで分子ドッキングを行います。ドッキング結果は、ANSがATPおよびFITCと同様に、ヌクレオチド結合部位にうまく適合することを示す。FITCは、ヌクレオチド結合部位にラベルを付けます。トリプトファン残基とANSの間の分子距離を計算します。20オングストロームはFRETにとって適切な距離のようです。ANS N-ドメイン複合体の分子動的シミュレーションを行い、相互作用の安定性を決定します。10ナノ秒のシミュレーション時間は、複合体の安定性を示しています。インビトロ実験を行う。組換えNドメインの発現および精製急行精製は、アフィニティークロマトグラフィーにより、組換えNドメインを組み換えする。精製したタンパク質のSDS-PAGEを実行して、純度を決定します。N-ドメインの消滅係数を用いて、280ナノメートルの波長の吸光度でタンパク質濃度を決定します。ANSおよびN-ドメイン蛍光強度変化に基づいて、ANS Nドメイン複合体の形成を監視します。N、N-ジメチルホルムアミドでANSストック溶液を調製する。少量のANSの重量を量ります, 間 1 から 5 ミリグラム.Nの最終容積の1mL、N-ジメチルホルムアミドにANSを溶解する。N,N-ジメチルホルムアミドのANS溶液を用いて100マイクロモルANSストック溶液を調製する。3~5回ボルテックスで溶液を混ぜます。NBSストック溶液をN、N-ジメチルホルムアミドで調製する。少量のNBS,1~5ミリグラムの重量を量る。NBSをN-ジメチルホルムアミドの1 mLに溶解する。N-ジメチルホルムアミド中のNBS溶液を用いて1ミリモルNBSストック溶液を調製する。3~5回ボルテックスで溶液を混ぜます。N-ドメインをANSで計り、25度で295ナノメートルの波長で励起するための蛍光スペクトルを記録します。蛍光スペクトルベースラインを取得する。1 mL 蛍光クォーツキュベットに pH 8 を含む 50 ミリモルリン酸緩衝液の 1 mL を入れます。分光光度計の熱式セルチャンバーにセルを配置し、励起波長を295ナノメートルに設定します。蛍光スペクトルを記録します。ブランクの蛍光スペクトルは、後で減算しなければならない水のピークを示しています。Nドメインの本来の蛍光スペクトルを得る。蛍光クォーツキュベットにpH 8と共に50ミリモルリン酸緩衝液900マイクロリットルを入れます。1マイクロモルN-ドメイン最終濃度を得るために100マイクロリットルのN-ドメイン懸濁液を加える。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。分光光度計の熱式チャンバーにセルを置きます。励起波長を295ナノメートルに設定します。N-ドメイン固有蛍光スペクトルを記録します。ANSを追加し、295ナノメートルの波長で励起することにより蛍光スペクトルを得る。100マイクロモルANSストック溶液の2マイクロリットルアリコートを懸濁Nドメインに加え、0.2マイクロモルANS最終濃度を得る。マイクロピペットを使用して、この溶液の均質性を確保し、穏やかに均質化する。蛍光スペクトルを記録します。1:1 ANS N-ドメインモル関係について、上記のようにANSの追加と蛍光スペクトル記録を繰り返します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。1つのグラフにすべてのスペクトルをプロット FRET のようなパターンがスペクトルによって形成されているかどうかを判断します。ANS N-ドメイン蛍光スペクトルは、FRET様パターンを形成する。N-ドメイン内の固有の蛍光滴定は、NBSによるトリプトファン化学修飾による。Nドメインの本来の蛍光スペクトルを再度得る。1ミリモルNBSストック溶液の1マイクロリットルのアリコートを懸濁Nドメインに加え、1マイクロモルNBSの最終濃度を得る。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。蛍光スペクトルを記録します。最小のN-ドメイン固有蛍光消光が観察されるまで、NBS付加および蛍光スペクトル記録を繰り返す。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。蛍光スペクトルを25度で記録することにより、NBS修飾NドメインをANSで評価します。ANSを追加し、295ナノメートルの波長で励起することにより蛍光スペクトルを得る。溶液の均質性を確保するために、マイクロピペットを使用して穏やかに均質化します。蛍光スペクトルを記録します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。生成された蛍光スペクトルは、FRETの発生を支持または反論する。すなわち、FRETが発生すると、ANS蛍光は増加せず、その逆もまた同様である。370ナノメートルの波長で励起することにより、化学的に修飾されたNドメインにANS結合の証拠。NBS改変N-ドメインにANSを加え、370ナノメートルの波長で励起してNドメイン固有蛍光スペクトルを記録します。ソフトウェアを使用して、各スペクトルから空白のスペクトルを差し引きます。すべてのスペクトルを 1 つのグラフにプロットします。ANS蛍光強度の上昇によりNドメインに結合するANSを確認する。N-Domainに結合するANSは、370ナノメートルの波長で励起されると蛍光増加を示す。結果の概要。パネルA.ANS N-ドメイン複合体は、295ナノメートルの波長で励起するときのFRET様パターンを表示します。パネルB.NBSは、化学的に修飾されたNドメイン内の唯一のトリプトファン残基を化学的に改変することによって、Nドメイン固有蛍光をクエンチする。パネルC.ANS蛍光は295ナノメートルの波長で励起すると増加する。パネルD.ANS蛍光はまた370ナノメートルの波長で励まされると増加する。したがって、295ナノメートルの波長でのANSの直接励起は、ATP結合部位に結合する場合のANS蛍光の主な供給源である。結論。これらのアッセイは、タンパク質中のトリプトファン残基とANSとの間にFRETの存在を決定するために使用され得る。TRYptopanとANSの間のFRETの明確化は、タンパク質構造研究でより良い結論を引き出すことを可能にする。このアッセイは、他のフルオロフォアを使用する場合にも有用である。

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学ぶトリプトファン残基の化学修飾と蛍光分光法によるANS結合解析。組換えCa²⁺-ATPase Nドメインを用いて、FRET様エネルギー移動とタンパク質動態の関係を解明する生化学的手法です。

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