ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ
June 14th, 2021
マイクロプレートフィーダーアッセイは、 ショウジョウバエの液体食品消費を定量化するための経済的で高いスループットの方法を提供します。3Dプリントされたデバイスは、ハエが1536ウェルマイクロプレートに収容される96ウェルマイクロプレートを接続し、そこからハエがトレーサー染料で給餌溶液を消費します。溶液体積の減少は分光光度測定で測定される。
マイクロプレートフィーダーアッセイは、ショウジョウバエの摂食行動を測定するためのシンプルで高スループットで経済的な方法を提供し、他のより精巧な方法よりも複数の利点を提供します。プレートリーダーで吸光度を測定することで消費を定量化することで、手動測定を排除し、手動でのデータ入力を排除します。データは、プログラムによる抽出や処理にも適しています。
この高スループットアッセイにより、水溶性栄養素、医薬品、医薬品、毒素の消費量を定量化することができ、様々な昆虫種への適用のためにシステムを変更することができます。溶融アガロースを試薬トラフに注ぎ、マルチチャネルピペットを使用して96ウェルマイクロプレートの各ウェルに80マイクロリットルの溶融アガロースを分配します。残ったアガロースを密閉した袋に入れ、再溶融して追加のプレートを作ります。
バリアストリップが緩み過ぎる場合は、指の周りにそれらを巻き付けて、チャネルでそれらを保持するために曲率を与えます。バリアストリップをバリアストリップチャンネルに挿入して、カプラーを準備します。カプラーを飢えプレートに貼り付け、カプラーが滑り落ちる可能性があるため、カプラーを使用してプレートを操作しないようにします。
カプラーの角度のあるコーナーが、正しい方向を維持するために、マイクロプレートの角度付きコーナーと一致していることを確認します。CO2麻酔の下で、3〜5日齢のハエを選別します。個々のハエを柱で飢餓プレートにロードします。
各列を閉じ、そのバリア ストリップを閉じた位置に調整して、塗りつぶしに合わせて閉じます。マイクロプレート内のサンプルレイアウトを注意深く記録します。飢餓プレートが満杯になったら、ハエがCO2を取り除いた後に自発的に回復し、最初の麻酔時間から6時間飢えさせます。
10ミリリットルの蒸留水に0.4グラムのスクロースと0.1グラムの酵母エキスを溶解して、15ミリリットルの円錐管に10ミリリットルの液体食品を調製します。固体が完全に溶解するまでチューブをボルテックスします。40マイクロリットルの染料ストック液を加え、液体食品を0.45マイクロメートルフィルターでチップした10ミリリットルのシリンジに移します。
1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに一度に約1.5ミリリットルの溶液をフィルターします。溶液を含むシリンジを脇に置き、フィーダープレートの調製中に必要に応じて追加の溶液をフィルター処理します。1536ウェルマイクロプレートの底部をシールフィルムで密封してフィーダープレートを準備します。
シールパドルを使用してフィルムに完全に付着します。次に、カミソリの刃で、左右の端から余分なフィルムをトリミングします。1536ウェルマイクロプレートの4つのウェルの各クラスターについて、濾過された液体食品の10マイクロリットルを左上ウェルに縦方向に分配します。
すべてのウェルが充填されたら、マイクロプレートの底部を密封するために使用されるのと同じ手順に従って、プレートの上部にシールフィルムを塗布します。希望するプレート数に対して繰り返します。プレートを200倍Gで10秒間遠心分離し、液体を沈着させます。
これは、吸収度の測定値を隠し、凝縮を引き起こす可能性があるため、プレートを冷やすようにしないでください。直径0.25ミリメートルの針を装備した針プローブツールでプレートの上面のウェルを穿孔し、溶液を分配する際に使用したのと同じ順序で穿孔します。クロスコンタミネーションを防ぐために、溶液間の針を拭き取ります。
プレートをめくり、底の井戸を穿穿けます。蓋なしで630ナノメートルでプレートの吸光度を読み取ります。上部のシールフィルムに内部蓋を置き、凝縮リングが穿光井戸を囲むよう、外蓋をプレートに置きます。
ガイドがフィーダープレートと飢餓プレートの適切な穴を揃えるよう、ボンプラーの上にフィーダープレートを上に置きます。カプラーとプレートの向きが正しいことを確認します。すべてのフィーダープレートがカプラーにロードされたら、カプラーのバリアストリップを調整してプレートの井戸を開きます。
カプラーとプレートアセンブリを 2 次コンテナに配置します。浸したペーパータオルを入れたピペットボックスの下半分を各二次容器に入れて湿度を提供します。二次コンテナの蓋を閉じ、制御された環境に移します。
ハエが22時間消費することを許可します。22時間の露出後、各プレートに死んだハエがないか確認し、それに応じてプレートのレイアウトを更新します。すべてのプレートをチェックした後、二次容器の中にCO2をポンピングすることによって、ハエを一斉に麻酔します。
約60秒後、すべてのハエが固定されていることを確認してください。ハエを飢餓プレートにそっとタップし、プラスチックバリアストリップを交換します。読み取り用のフィーダープレートを取り外します。
プレートの吸光度を630ナノメートルで再読み込みします。すべてのプレートが読み取られるまで、このプロセスを繰り返します。蒸発は、すべてのウェルについて定量化され、個々のプレートのウェル間に相関関係が存在するかどうかを判断することが判明した。
蒸発と行と蒸発対カラムのピアソン相関係数を計算し、蒸発と井戸の位置の間の傾向を評価した。3〜5日齢のカントン-SBハエの消費は、プロトコルの有効性を確立するために定量化されました。ハエは、1%酵母抽出物を含む4%スクロース溶液と、15%エタノールと1%酵母抽出物を添加した4%スクロース溶液の間で選択を与えられた。
男性と女性の両方がエタノールと酵母エキスで溶液の圧倒的な好みを示しました。フィーダープレートを構築する際には一貫性を保ち、各フライに食品の量、蒸発、アクセスに関して同一の消費シナリオが提示されるようにすることが不可欠です。この技術により、ショウジョウバエ分野の研究者は、従来の方法と比較して、より高いスループットと低コストで消費と好み行動に対してハイスループットアッセイを実行することができます。
概要
マイクロプレートフィーダーアッセイは、ショウジョウバエの摂食行動を定量化するための高スループットの方法を提供します。この経済的なアプローチは、3Dプリントされたデバイスを使用してマイクロプレートを接続し、液体食品の消費を効率的に測定することを可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動生物学
- 昆虫学
背景
- ショウジョウバエの摂食行動を測定することは、栄養の好みを理解する上で重要です。
- 従来の方法は労働集約的で非効率的になる可能性があります。
- マイクロプレートフィーダーアッセイはこのプロセスを合理化します。
- データ収集に分光測定法を利用します。
研究の目的
- ショウジョウバエの食品消費を評価するための高スループットな方法を開発すること。
- さまざまな栄養素や物質の定量化を容易にすること。
- 摂食行動研究の効率性を向上させること。
使用した方法
- 摂食アッセイ用のアガロースとマイクロプレートの準備。
- 制御された摂食実験のためのハエの選別と麻酔。
- 吸光度を測定して食品消費を定量化すること。
- 摂食行動と好みの傾向を分析すること。
主要な結果
- ハエはエタノールと酵母エキスを含む食品を好みました。
- データ収集は自動化された吸光度測定によって合理化されました。
- 蒸発率を定量化し、相関関係を分析しました。
- アッセイは高スループットの摂食研究に効果的であることが証明されました。
結論
- マイクロプレートフィーダーアッセイは、ショウジョウバエ研究に有用なツールです。
- 摂食行動の効率的かつ正確な測定を可能にします。
- この方法はさまざまな昆虫種や応用に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying consumption in model organisms supports target validation and phenotypic screening in early discovery. The microplate feeder assay enables high-throughput measurement of liquid food intake in Drosophila, providing quantitative data for mechanistic de-risking of nutritional, toxicological, or pharmacological interventions. This approach improves predictive confidence in lead identification by standardizing consumption metrics across large sample sets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals in a genetically tractable model.
- Operational Value: Enables biological de-risking through standardized, absorbance-based measurement of liquid food intake.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating reproducible consumption data for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by isolating individual fly consumption in multi-well formats.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through sealed microplates and controlled evaporation correction.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse via 3D-printed couplers that synchronize 96- and 1536-well microplates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling dose-response analysis of consumable compounds.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when assessing behavioral responses to substances like ethanol or yeast extract.
- Disease-Relevant System: Supports studies of consumption-associated traits with environmental and pharmacological variables.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, supporting quantitative behavioral phenotyping.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through quantified liquid food intake.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via absorbance measurements before and after consumption.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including evaporation correction and Pearson correlation analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it via preference testing between sucrose and ethanol-supplemented solutions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through 3D-printed couplers and sealing protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in consumption-related phenotypes.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability through microplate-based absorbance readings and barrier strip controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by enabling high-throughput preference and consumption assays.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative intake data across compound libraries.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in Drosophila handling, microplate preparation, and spectrophotometry.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include plate readers capable of 630 nm absorbance and 3D-printed coupler systems.
- Cross-team standardization requirements for sealing, perforation, and environmental controls to minimize condensation and evaporation artifacts.
- Adaptation considerations across model systems, noting potential for extension to other insect species with modified food formulations.
- Practical limitations supported by source material: evaporation must be quantified and corrected; chilling plates causes condensation that obscures readings; consistent orientation of coupler and microplates is required for proper well access.
