Name: クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 学ぶ、クライオ電子顕微鏡用の高温サンプルグリッド作製プロトコル。70°Cまでの温度制御と急速凍結法を用いて、タンパク質の温度依存性構造を解析する手法を解説します。構造生物学研究に有用です。

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著者らは、有用なアドバイスを提供してくれたサーモフィッシャーサイエンティフィックのHervé Remigy博士に感謝します。クライオEM実験は中央研究院クライオEM施設(ASCEM)で実施しました。ASCEMは中央研究院の支援を受けています(助成金番号。AS-CFII-108-110)および台湾タンパク質プロジェクト(助成金番号。AS-KPQ-109-TPP2)。著者らはまた、サンプル調製の支援をしてくれたHui-Ju Huang氏にも感謝しています。

注:このプロトコルは、特定の温度、特に37°Cを超える温度でクライオ電子顕微鏡(クライオEM)サンプルを調製するために、変更された市販のガラス化装置を使用することを目的としています。 全体的な実験セットアップを 図1に示します。プロトコルは例として55°Cを使用します。その他の温度での具体的な条件については、参考文献12の補足表2を参照してください。
1. ガラス化保存装置の準備
<ol><li>閉じた端にある50 mLの遠心分離管に1cmの穴を開けます。</li>
	<li>図2に示すように、超音波水出口のガラス化保存装置チャンバーにチューブを置きます。 注意: 目的は、チャンバー全体に到達する前に、水蒸気をチューブを介して熱交換器に導くことにより、水の凝縮を最小限に抑えることです。</li>
	<li>ガラス化保存装置の温度を規定温度( 図3に示すように55°Cなど)に設定し、ガラス化槽を55°C、相対湿度100%にします。実験を開始する前に、条件を安定させるために少なくとも30分間放置します。</li>
</ol>2.サンプルとツールのウォームアップ
<ol><li>ウォーターバスをホットプレートに置き、ホットプレートを希望の温度(ここでは55°C)に設定します。温度計で水が55°Cに達することを確認します。</li>
	<li>サンプルをウォーターバスでインキュベートし、ブロッティング実験の前にホットプレートの端にあるピペットチップを2分以上予熱します。 注:ガラス化装置チャンバーの最高温度は60°Cです。 サイロEM実験用のより高い温度(例えば70°C)のグリッドを作製するには、サンプルを80°Cの水浴中でインキュベートし、サンプル温度とガラス化保存装置温度の平均がグリッド上のサンプルの実際の温度(ここでは70°C)であると推定される。この見積もりの詳細と制限については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。</li>
</ol>3. ブロッティング実験の準備
<ol><li>グロー放電は、穴のあるカーボン支持グリッドを25mAで30秒間、または使用するデバイスに応じて値の代わりに放電します。</li>
	<li>ピンセットをガラス化装置のグリッドで2分以上インキュベートします。</li>
	<li>標準的な手順に従って、エタン容器にエタンを入れます。エタンをオーバーフローさせないでください。 注:このステップには約10分かかり、凍結を避けるためにすぐにブロッティング実験を行う必要があります。</li>
	<li>ブロッティング実験の5分前までにガラス化ろ紙をガラス化装置チャンバーに入れます。 注意: ろ紙をチャンバーに入れるのが早すぎると、ろ紙が濡れすぎます。</li>
</ol>4. ブロッティング実験
メモ: グリッドを保持するときは、グリッドが安定していて、ピンセットとの接触面積が最小限であることを確認してください(図4)。これは、エタンの最高の冷却効率を維持し、非ガラス質の氷を避けるために行われます。
<ol><li>ピペットチップを使用して、7〜9 μLのサンプルをグリッドに塗布します。次に、1〜2秒待ち、1〜1.5秒間ブロットし、サンプルを液体エタンにすばやく浸します。</li>
	<li>グリッドを液体エタンから液体窒素に貯蔵されているクライオボックスに移します。 注意: ピンセットはまだ高温であるため、この手順は非常に慎重に実行する必要があり、この時点で冷却タンク全体が蒸気でいっぱいになります。</li>
</ol>5.グリッドの品質チェック
<ol><li>グリッドをクリップし、クライオEM装置にアップロードします。</li>
	<li>クライオEM装置の表示画面とソフトウェアの低線量機能を使用して、グリッド上の氷の状態とグリッド上のサンプルの分布をスクリーニングします。 注意: 多くの場合、グリッドは非常に乾燥しているか、氷の層が厚すぎます。高温で調製されたグリッドの成功率は、室温または4°Cでのそれよりも大幅に低い。 良好なグリッドと不満足なグリッドの代表的な結果を次のセクションに示します。</li>
	<li>結果のグリッドの品質が良くない場合は、さまざまな条件(待機時間、ブロッティング時間など)でグリッド準備のプロセスを繰り返します。結果のグリッドの品質が良好な場合は、同じ手順を繰り返して、異なる温度でグリッドを作成します。</li>
</ol>6. データ収集
<ol><li>高品質のグリッドを高解像度のクライオEM装置に移します。</li>
	<li>確立された手順に従ってデータ収集とデータ分析を実行します。 注:以前の出版物に示されているように、構造の解像度は高温の影響を受けません12。</li>
</ol>

<ol><li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587, 157-161 (2020).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587, 152-156 (2020).</li>
<li>Chen, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cryo-EM+to+uncover+structural+bases+of+pH+effect+and+cofactor+bi-specificity+of+ketol-acid+reductoisomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).</li>
<li>Cabra, V., Samsó, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+of+cryo-electron+microscopy%3A+A+primer+on+sample+preparation+and+high+quality+data+collection+for+macromolecular+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behavior+during+CryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales.</a> Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high+resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high resolution cryo-EM.</a> J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+complex+I-like+molecule+NDH+of+oxygenic+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis.</a> Nature. 566, 411-414 (2019).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+operating+principles+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structures and operating principles of the replisome.</a> Science. 363, (2019).</li>
<li>Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+subunit+arrangement+of+native+AMPA+receptors+elucidated+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM.</a> Science. 364, 355-362 (2019).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+ribosome+subunit+association+studied+by+mixing-spraying+time-resolved+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy.</a> Structure. 23, 1097-1105 (2015).</li>
<li>Singh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+temperature+sensation+by+the+TRP+channel+TRPV3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structure+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3.</a> Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).</li>
<li>Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-resolved+cryo-EM+uncovers+structural+bases+of+temperature-dependent+enzyme+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions.</a> Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

プロトコルのステップ1では、遠心管がしっかりと取り付けられており、実験の進行中に落下しないことを確認してください。チャンバー内に多数の水滴が蓄積し、ろ紙の吸着能力が変化する可能性があるため、ガラス化装置チャンバーが平衡温度に達した後、実験の全体的な時間が30分を超えないようにすることをお勧めします。操作時間が30分を超える場合、オペレーターはろ紙を交換し、キャビンが温度と湿度のバランスを取り戻すのを待つ必要があります。プロトコルのステップ8では、7〜9 μLの推奨サンプル量は、それ以外の場合、サンプルが高温で急速に蒸発し、グリッド上に空の正方形につながるため、通常よりも大きくなります。一方、適用されるサンプルは9μLを超えないことを強くお勧めします。 そうしないと、吸い取り前にピンセットを動かす過程でサンプルが滴り落ちる可能性が非常に高くなります。全体として、この手法の成功の鍵は、グリッドの安定した迅速な把持と、時間制限のある各アクションの正確で安定した実行です。さらに、実験の各ラウンドは、1つの特定の高温のみを扱うことをお勧めします。別の温度で実験を実行する前に、すべてのシステムを完全に回復してリセットする必要があります。
<...

タンパク質複合体の構造を解明するためのクライオEM技術は、特に高分解能の構造を得る方向に改善を続けています1,2。その間、そのアプリケーションの展望は、サンプルグリッドの準備とそれに続くプランジ凍結を含むガラス化プロセス3の前にpHやリガンドなどのサンプル条件を変えることによっても拡大されました4,5。もう一つの重要な条件は温度です。クライオ電子顕微鏡実験は、X線結晶構造解析と同様に低温で行われますが、クライオ電子顕微鏡で解かれた構造は、ガラス化前の溶液状態での構造を反映しています。最近まで、単粒子分析(SPA)クライオEM研究の大部分は、ガラス化の前に氷上(すなわち4°C)に保たれたサンプルを使用していますが6、多くの研究では、室温付近の7、8、9、10または42°Cまでのサンプルを使用しています11。最近の報告では、好熱性古細菌スルフォロブスソルファタリクス(Sso)由来の酵素ケトール酸レダクトイソメラーゼ(KARI)の温度依存的研究を4°Cから70°Cまでの6つの異なる温度で実施しました12。私たちの研究は、機能的に関連する温度でサンプルグリッドを準備することが重要であり、クライオEMが複数の温度で同じタンパク質複合体の構造を解くために実用的に実行可能な唯一の構造方法であることを示唆しています。
高温でのガラス化の主な困難は、蒸気の凝縮を最小限に抑え、薄い氷を実現することです。ここでは、 Sso-KARI 12の以前の研究で高温でサンプルグリッドを準備するために使用された詳細なプロトコルを報告します。読者または視聴者は、クライオEM実験のための全体的なサンプル調製およびデータ処理手順をすでに経験していることを前提とし、高温に関連する側面を強調します。

<table><tbody><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td>サイズ: 50 mL</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>テッド ペラ</td><td>47000-100</td><td>&Oslash;55/20mm、グレード595</td></tr><tr><td>HI1210</td><td>ライカ</td><td></td><td>ウォーターバス</td></tr><tr><td>K100X</td><td>電子顕微鏡科学</td><td></td><td>グロー放電</td></tr><tr><td>Quantifoil、1.2/1.3 200Mesh Cuグリッド</td><td>テッド・ペラ</td><td>658-200-CU-100</td><td></td></tr><tr><td>タイタン・クリオス G3</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>1063996</td><td>低線量イメージング</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobotピンセット</td><td>テッドペラ</td><td>47000-500</td><td></td></tr></tbody></table>

クライオ電子顕微鏡用高温サンプルグリッドの作製

Preparation of High-Temperature Sample Grids for Cryo-EM

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)実験用のサンプルグリッドは、通常、生物学的サンプルの保存に最適な温度、主に4°C、場合によっては室温で調製されます。最近、低温で解かれたタンパク質構造は、特に好熱性古細菌のタンパク質にとって、機能的に関連性がない可能性があることを発見しました。クライオEM分析のために、より高い温度(最大70°C)でタンパク質サンプルを調製するための手順が開発されました。我々は、より高い温度で調製されたサンプルの構造が機能的に関連性があり、温度に依存することを示した。ここでは、55°Cを例に、高温でサンプルグリッドを調製するための詳細なプロトコルについて説明します。実験では、追加の遠沈管を使用して修正したガラス化保存装置を利用し、サンプルを55°Cでインキュベートしました。 詳細な手順は、蒸気の凝縮を最小限に抑え、グリッド上に薄い氷の層を得るために微調整されました。成功した実験と失敗した実験の例が提供されています。

低倍率の概要を 図5A、Bに示します。パネル A は、成功したグリッドの例です。左上(厚い)から右下(薄いまたは空)への氷のグラデーションがあります。このようなグリッドにより、青や緑のボックスなど、データ収集に適した中央領域の氷層の適切な厚さを簡単に見つけることができます。グリッドBが乾燥しすぎています。グリッド内の正方形のコントラストは明るいため、氷の層が薄すぎるか、氷の層がまったくありません。赤い矢印で示されている2つの正方形のみがデータ収集に適しています。
さらに、異なるグリッドからの低線量画像の例を 図5C、Dに示す。パネルCの画像は、ほとんどの氷が結晶形であり、データ収集には適していないことを示しています。一方、パネルDの画像は、氷層がほとんどアモルファス状態にあり、データ収集に適していることを示しています。
これは、高温でのグリッ...

この論文は、クライオEM実験のために急落凍結する前に、70°Cという高い温度でサンプルグリッドを準備するための詳細なプロトコルを提供します。

The sample grids for cryo-electron microscopy (cryo-EM) experiments are usually prepared at a temperature optimal for the storage of biological samples, ...

タンパク質の機能は温度に依存し、温度に最適です。このプロトコルは、より高い温度でタンパク質構造を解決する方法を提供します。このアプローチは、機能的に関連する構造を提供し、タンパク質構造の温度依存性の理解を深めることができます。手順のデモンストレーションは、中央研究院クライオEM施設のマネージャーであるYuan-Chih Changです。閉じた端にある50ミリメートルの遠沈管に1センチメートルの穴を開けることから始めます。超音波水出口のガラス化保存装置チャンバーにチューブを置きます。ガラス化保存装置の温度を規定温度に設定し、ガラス化槽を摂氏55度、相対湿度100%にします。実験を開始する前に、条件を安定させるために少なくとも30分間放置します。ウォーターバスをホットプレートに置き、ホットプレートを希望の温度に設定します。温度計で水が摂氏55度に達することを確認します。サンプルをウォーターバスでインキュベートし、ブロッティング実験の前にホットプレートの端にあるピペットチップを2分以上予熱します。グローは、穴のあるカーボン支持グリッドを25ミリアンペアで30秒間放電します。吸い取り実験の5分前までにガラス化ろ紙をガラス化装置チャンバーに入れます。ピンセットをガラス化装置のグリッドで2分以上インキュベートします。標準的な手順に従ってエタンでエタン容器を構築し、エタンがオーバーフローしないようにします。ピペットを使用して、7〜9マイクロリットルのサンプルをグリッドに適用します。次に、1〜2秒待ち、1〜1秒半ブロットして、サンプルを液体エタンにすばやく浸します。グリッドを液体エタンから液体窒素に保存されたクライオボックスに移します。グリッドをクリップしてアンロードし、電子顕微鏡またはクライオEM装置を取得します。クライオEM装置の表示画面とソフトウェアの低線量機能を使用して、グリッド上の氷の状態とグリッド上のサンプルの分布をスクリーニングします。得られたグリッドの品質が良くない場合は、待機時間、ブロッティング時間などのさまざまな条件でグリッド準備のプロセスを繰り返します。結果のグリッドの品質が良好な場合は、同じ手順を繰り返して、異なる温度でグリッドを作成します。高品質のグリッドを高解像度のクライオEM装置に転送します。確立された手順に従ってデータ収集とデータ分析を実行します。成功したグリッドの場合、グリッドの左上に厚い氷、右下に薄い氷で氷の勾配が形成されました。データ収集に適した青と緑のボックスが成功したグリッドで観察されました。もう一方のグリッドでは明るいコントラストが観察されました。氷の薄い層または氷の欠如を示します。2番目のグリッドでのデータ収集に適しているのは2つの正方形のみであることがわかりました。グリッドの1つは、主にクリスタリン型の氷で構成されており、データ収集には適していませんでした。一方、もう一方のグリッドは、氷層がほとんどデータ収集に適したアモルファス状態にあることを示しました。ASコンテナなどの準備は、時点に応じて完了する必要があります。時間管理と実験を迅速かつ正確に終了することが最も重要です。このプロトコルを使用して得られた結果によっては、研究者は単純な条件を設定する際により注意しなければならない場合があります。

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