Name: ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 学ぶゼノプス・ラエビス胚の芽球からTGF-βファミリー切断産物を迅速に収集し、免疫ブロットで解析する手法。発生生物学におけるタンパク質動態の理解に貢献する。

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私たちは、優れた動物のケアのためにメアリー・サンチェスに感謝します。著者らの研究は、国立衛生研究所(NIH/NICHD)の国立小児保健人間開発研究所がR01HD067473-08およびR21 HD102668-01を付与し、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK/NIH)助成金R01DK128068-01によって支援されています。

<ol><li>Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomains+regulate+the+synthesis%2C+extracellular+localisation+and+activity+of+TGF-beta+superfamily+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands.</a> Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).</li>
<li>Gray, A. M., Mason, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+activin+A+and+transforming+growth+factor--beta+1+pro-regions+in+homodimer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for activin A and transforming growth factor--beta 1 pro-regions in homodimer assembly.</a> Science. 247 (4948), 1328-1330 (1990).</li>
<li>Constam, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGFbeta+and+related+signals+by+precursor+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGFbeta and related signals by precursor processing.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 32, 85-97 (2014).</li>
<li>Wang, X., Fischer, G., Hyvonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+activation+of+pro-activin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure and activation of pro-activin A.</a> Nature Communications. 7, 12052(2016).</li>
<li>Zhao, B., Xu, S., Dong, X., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prodomain-growth+factor+swapping+in+the+structure+of+pro-TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prodomain-growth factor swapping in the structure of pro-TGF-beta1.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+and+signaling+range+of+mature+BMP-4+is+regulated+by+sequential+cleavage+at+two+sites+within+the+prodomain+of+the+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The activity and signaling range of mature BMP-4 is regulated by sequential cleavage at two sites within the prodomain of the precursor.</a> Genes & Development. 15 (21), 2797-2802 (2001).</li>
<li>Goldman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+an+upstream+cleavage+site+in+the+BMP4+prodomain+leads+to+tissue-specific+loss+of+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutation of an upstream cleavage site in the BMP4 prodomain leads to tissue-specific loss of activity.</a> Development. 133 (10), 1933-1942 (2006).</li>
<li>Le Good, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+stability+determines+signaling+range%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Nodal stability determines signaling range.</a> Current Biology. 15 (1), 31-36 (2005).</li>
<li>Tilak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+rather+than+ordered+cleavage+of+two+sites+within+the+BMP4+prodomain+leads+to+loss+of+ligand+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Simultaneous rather than ordered cleavage of two sites within the BMP4 prodomain leads to loss of ligand in mice.</a> Development. 141 (15), 3062-3071 (2014).</li>
<li>Neugebauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prodomain+of+BMP4+is+necessary+and+sufficient+to+generate+stable+BMP4%2F7+heterodimers+with+enhanced+bioactivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (18), 2307-2316 (2015).</li>
<li>Robertson, I. B., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Bioavailability+of+TGF-beta+and+TGF-beta-Related+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Bioavailability of TGF-beta and TGF-beta-Related Proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (6), 355-372 (2016).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GDF6-CD99+Signaling+Regulates+Src+and+Ewing+Sarcoma+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GDF6-CD99 Signaling Regulates Src and Ewing Sarcoma Growth.</a> Cell Reports. 33, 108332(2020).</li>
<li>Nelsen, S. M., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+cleavage+of+BMP4+by+furin%2C+PC6%2C+and+PC7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific cleavage of BMP4 by furin, PC6, and PC7.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (40), 27157-27166 (2009).</li>
<li>Birsoy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPACE4+is+a+localized+pro-protein+convertase+required+for+mesoderm+induction+and+the+cleavage+of+specific+TGFbeta+proteins+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">XPACE4 is a localized pro-protein convertase required for mesoderm induction and the cleavage of specific TGFbeta proteins in Xenopus development.</a> Development. 132 (3), 591-602 (2005).</li>
<li>Mimoto, M. S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+gene+function+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of gene function in Xenopus laevis.</a> Methods Mol Biol. 770, 55-75 (2011).</li>
<li>Nelsen, S., Berg, L., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proprotein+convertase+genes+in+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Proprotein convertase genes in Xenopus development.</a> Developmental Dynamics. 233 (3), 1038-1044 (2005).</li>
<li>Constam, D. B., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein+activity+by+pro+domains+and+proprotein+convertases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein activity by pro domains and proprotein convertases.</a> Journal of Cell Biology. 144 (1), 139-149 (1999).</li>
<li>Sopory, S., Nelsen, S. M., Degnin, C., Wong, C., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+bone+morphogenetic+protein-4+activity+by+sequence+elements+within+the+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of bone morphogenetic protein-4 activity by sequence elements within the prodomain.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34021-34031 (2006).</li>
<li>Sopory, S., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSopory%2C+S+%22Analysis+of+Growth+Factor+Signaling+in+Embryos%22">Analysis of Growth Factor Signaling in Embryos</a>. Whitman, M. A., Whitman, S. , CRC Press LLC. 38-55 (2006).</li>
<li>Kim, H. S., McKnite, A., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+Activation+of+Bmps%3A+Analysis+of+Cleavage+in+Xenopus+Oocytes+and+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic Activation of Bmps: Analysis of Cleavage in Xenopus Oocytes and Embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1891, 115-133 (2019).</li>
<li>Degnin, C., Jean, F., Thomas, G., Christian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavages+within+the+prodomain+direct+intracellular+trafficking+and+degradation+of+mature+bone+morphogenetic+protein-4%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cleavages within the prodomain direct intracellular trafficking and degradation of mature bone morphogenetic protein-4.</a> Molecular Biology of the Cell. 15 (11), 5012-5020 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルの主な利点は、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供することです。もう一つの利点は、エピトープタグ付きタンパク質を分析し、ほとんどのTgfßファミリープロドメインを認識する市販の抗体の不足を回避できることです。また、トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるエピトープタグ付きTgfß前駆体タンパク質の切断を解析することも可能であるが、X.laevisを用いることはいくつかの利点がある。初期のX.ラエビス胚は、内因性Tgfßコンバーサーゼ(ふれん、Pcsk5、Pcsk6およびPcsk7)13、14、16の候補であるPCファミリーの4つのメンバーすべてを発現する。いくつかの哺乳動物細胞株は、1つ以上のPCを発現せず、切断17を調べるために前駆体タンパク質とそのコン転換体の両方の異...

トランスフォーム成長因子 ß (Tgfß) スーパーファミリーのメンバーは、非活性で二量体化された前駆体タンパク質として合成されます。前駆体は、分泌経路内または細胞外のプロプロテインコンフォーターゼ(PC)ファミリーのメンバーによって切断される。これは、活性なジスルフィド結合リガンドダイマーと2つのプロドメインフラグメント1を作成する。Tgfßファミリー前駆体のプロドメインが活性リガンド2を生成するために必要とされているのは30年以上前から知られているが、プロドメインがリガンド機能にどのように寄与するかを理解することは不完全である。
Tgfßファミリーメンバーのタンパク質分解活性化のプロセスの理解は不完全なままであるが、どのPCコンセンサスモチーフが生体内で切断されるか、切断が特定の細胞内または細胞外区画で起こるか、そしてプロドメインが切断リガンド3と共有結合的にまたは非共変に関連しているかの理解に関心が高まっている。いくつかの研究は、プロドメインが切断4、5の前にリガンド折りたたみを導くだけでなく、成長因子の安定性と作用範囲6、7、8、9に影響を与え、ホモダイマーまたはヘテロ二量体10の形成を促進し、リガンドを細胞外マトリックスに固定してリガンド遅延11を維持し、場合によっては、アガンドとして機能することを示している。 シグナリング12.Tgfßファミリーの多くのメンバーのプロドメイン内のヘテロ接合点突然変異は、ヒトの眼、骨、腎臓、骨格または他の欠陥に関連している3。これらの知見は、プロドメインが活性リガンドを生成および維持する上で重要な役割を強調し、Tgfßファミリー前駆体のタンパク質分解性成熟中に開発された切断産物の役割を同定し、解読することの重要性を強調する。
ここでは、X.ラエビス胚の芽球からTgfßファミリー前駆体の成熟中に生成された切断産物を吸引し、免疫ブロットで分析するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、前駆体タンパク質の1つ以上のPCコンセンサスモチーフが生体内10、13で切断されているかどうかを判断するために使用され、各モチーフ13、14を切断する内因性PCを同定し、Tgfßファミリーホモダイマー対ヘテロダイマー10の生体内形成を比較するか、またはTgfのヒト疾患関連点突然変異をTgfおよびCgのヒト疾患関連点突然変異をTgfの前駆体に対して分析する。

<table><tbody><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td>フィ<td>ッシャー</td><td>AC125470100</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>フィ</td><td>ッシャーB392-5</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーC79-500</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーC109-500</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>ペレット乳棒/ティッシュグラインダー</td>フィ<td>ッシャー12-141-364</td><td></td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr>胎児ウ<tr><td>シ血清</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>フィコール400</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管、1 X 90ミリメートル</td><td>Narshige</td><td>G-1</td><td></td></tr>グリ<tr><td>セロール</td><td>フィ</td><td>ッシャーG33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ヒト絨毛剤ゴナドトロピン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>注射用シリンジ、1 mL</td><td>フィッシャー</td><td>8881501368</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>フィッシャー</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>針、26 G</td><td>フィッシャー</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>ピコリットルマイクロインジェクター</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>習志毛</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP166-500</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td><td>フィ</td><td>ッシャーS318-500</td><td></td></tr>トリ<tr><td>カイン-S</td><td>ペンテア</td><td>TRS5</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP152-5</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

Analysis of Transforming Growth Factor &#223; Family Cleavage Products Secreted Into the Blastocoele of Xenopus laevis Embryos

Tgfß/Nodalまたは骨形態形成タンパク質(Bmp)リガンドに代表されるトランスフォーム成長因子ß(Tgfß)スーパーファミリーの2つの腕は、それぞれ胚発生および成人恒常性に不可欠な役割を果たす。Tgfßファミリーのメンバーは、小胞体内で二量体化および折り畳む不活性前駆体として作られる。前駆体は、その後、リガンドおよびプロドメイン断片に切断される。二量体リガンドだけがTgfß受容体を関与させ、下流シグナル伝達を活性化することができるが、プロドメイン部分がリガンド活性に寄与するという認識が高まっている。この記事では、Tgfß前駆体タンパク質の活性化中に生成された切断産物を同定するために使用できるプロトコルについて説明します。Tgfß前駆体をコードするRNAは、まず X.ラエビス 胚にマイクロインジェクションされる。翌日、切断産物はガストルラ期胚の芽球体から採取され、ウェスタンブロットで分析される。このプロトコルは、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供します。

以下に説明する実験の目的は、Bmp4およびBmp7がヘテロダイマー(1つのBmp4リガンドと1つのBmp7リガンドで構成されるダイマー)、ホモダイマー(2つのBmp4または2つのBmp7リガンドで構成される)、またはそれらが Xで 共発現される場合のそれぞれの混合物を決定することであった。 図 2 に示すデータは、以前に発表されたスタディ10から抽出されます。 図2A は、Bmp4またはBmp7ホモジマー前駆体またはBmp4/7ヘテロダイマー前駆体のタンパク質分解性成熟によって生成された切断産物を示す図表である。Bmp4はプロドメイン内の2つの部位で切断され、SDS-PAGEゲル上で〜26kDaで移動する2つのプロドメイン断片(濃い緑色および黄色)および1つの二量体リガンド断片(ライトグリーン)を生成する。Bmp7は、1つの部位で切断され、1つのプロドメインフラグメント(マルーン)と、~35kDaで移動する1つのジメリックリガンドフラグメント(ピンク)を...

変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス 胚で異所性発現すると、二量体化し、切断され、後期芽胞から早期胃管ステージに至るブラストコエレに分泌される。免疫ブロット解析のためのブラストコア腔から切断産物を吸引する方法について述べている。

The two arms of the Transforming Growth Factor &#223; (Tgf&#223;) superfamily, represented by Tgf&#223;/Nodal or Bone morphogenetic protein (Bmp) ligands, ...

このプロトコルは、TGF-βファミリーメンバーを含む分離前駆体タンパク質のより広い範囲が、タンパク質分解切断後の活性タンパク質に変換されるプロセスを研究するために使用することができる。このプロトコルの主な利点は、可視化された条件下で生体内で高濃度のTGF-β切断産物を得るために非常に迅速かつ安価な方法を提供することである。まず、翌日に注射した後、Ficoll溶液と死んだ胚または死んでいる胚を取り除き、胚をMBSで1、2回洗い流し、室温またはインキュベーターのベンチでMBSの胚を培養して発達を遅くする。熱し、希望の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を引っ張ります。鉗子を使用して、引っ張られた針の先端を切り取ります。詰まりを防ぐために、ブラストセレ吸引針の開口部はマイクロインジェクション針よりも大きくする必要があります。マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに吸引針を挿入し、針ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付けます。MBS充填注入トレイまたは皿に早期から中期の胃ステージ胚を入れます。動物の棒の近くの胚表面の下に針を挿入します。解剖顕微鏡を通して針と胚を観察しながらマイクロインジェクターの充填ボタンを押します。数秒にわたって、針の透明な液体のレベルが上昇し、胚が崩壊して凹状になる。注入ボタンを1回以上パルスして、破片やプロテアーゼを含む針に入る曇った白質を排出します。免疫ブロット上の切断産物を検出するために、抗体に応じて10〜20個以上の胚のブラスト胞液を吸引する。注入皿に置かれるパラフィン片に核を含まない水の1マイクロリットルをピペット。水滴に針を沈め、注入ボタンを押してブラスト胞液を水に払拭します。あるいは、流体を直接パラフィルムに排出し、平坦化を防ぐために、注入ボタンをパルスして、より低い圧力で流体を排出する。採取したブラスト胞液を氷上の無菌マイクロ遠心分離管に移し、核を含まない水を加えて最終体積を30マイクロリットルに調整します。TGF-β前駆体タンパク質を検出するには、胚細胞を破壊した胚を氷上の別のチューブに移します。過剰なMBSを取り除き、200マイクロリットルの冷蔵胚ライセートバッファーを加えます。胚を完全に均質化するために、塊が残らなくなるまで10〜20回上下のピペット。冷蔵マイクロ遠心分離機の均質化胚を10,000倍Gで10分間遠心分離し、P200ピペットを使用して上澄み物の160マイクロリットルを取り除き、氷上の新しいチューブに移し、チューブの下半分の白い黄身タンパク質やその他の細胞破片を避けるように注意してください。マイクロ遠心分離を一度繰り返し、128マイクロリットルの清澄上清を氷上の新しいチューブに移します。この時点で、クリアされた胚のライセートおよび収集されたブラスト胞液は、所望の限りマイナス80°Cで保存することができる。メーカーの指示に従って、PNGase Fとトランスゴルジネットワークを介して修飾されたブラスト胞体流体中に存在する切断タンパク質を脱グリコシル化します。脱糖剤は、SDSゲルのより凝縮されたバンドとして移行し、正確な同定に役立てることができます。ブラスト胞およびリセート中のプロドメインフラグメントモノマーおよび展開タンパク質を評価するには、4Xサンプルバッファーを15マイクロリットルのブラスト胞液および15マイクロリットルの明確な胚ライセートに加えて還元条件下でタンパク質を分析する。ブラストセレ内の切断ホモジメリックまたはヘテロ二量体リガンドの形成を評価するには、非還元4倍サンプルバッファーの5マイクロリットルを残りの15マイクロリットルのブラスト胞液に加えて非還元条件下でタンパク質を分析し、それを5分間加熱して氷の上に置きます。このプロトコルを使用した後、タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、免疫ブロットをmycエピトープタグを認識する抗体でプローブした。還元条件下では、Bmp4またはBmp7のみを発現する胚からのライセートにおいて、切断されたBmp4モノマーに対応する単一のバンドと、切断されたBmp7モノマーに対応する遅い遊覧バンドが検出された。両方のバンドは、Bmp4およびBmp7を共同発現する胚で検出された。タンパク質が非還元条件下で分離されると、Bmp7タンパク質レベルが高い場合には、単一の成熟したBmp4および7ヘテロダイマーバンドの中間移動性が、胚のBmp4ホモジマーの微量と共に検出された。しかし、この場合、過剰なBmp7は、Bmp4とBmp7とを共発現させたホモダイマーおよび胚を形成した。これらの結果は、ゼノプス・ラエビス胚で共発現した場合、Bmp4および7がヘテロ二量体を優先的に形成することを示した。この実験では、純粋なブラストセレを収集することは、正確な針の取り扱い経験を必要とする最も重要なステップです。だから、エラーを試してみて、修正し続けてください。この手順は、BMPヘテロ二量体が形成されるかどうか、また、どのアミノ酸がこれに重要であるかをテストします。次のステップでは、これらのアミノ酸が哺乳類の発達中に機能的に重要であるかどうかを尋ねるために、マウスをノックインが生成することができる。

analysis-transforming-growth-factor-family-cleavage-products-secreted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。...

の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。...

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

成長因子またはシグナル伝達経路の特定の阻害剤に浸したビーズを発生中の胚に移植することにより、それらの効果を生体内で直接テストすることが可能です。このプロトコルでは、ビーズを四肢の芽に移植して、これらの分子が遺伝子発現とシグナル伝達に及ぼす影響を決定します。...

遺伝子発現に影響を​​及ぼすシグナル伝達経路を同定するために、ニワトリ胚手足の開発にビーズのグラフト

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

栄養膜巨細胞(TGC)は、健康な妊娠を確保するために胎盤で重要な役割を果たします。着床後胚のクライオスタット切片または胚の7日目の外胎盤錐体の短期培養における新生蛍光in...

の新生RNA FISHによる転写分析<em&gt;インビボ</em&gt;栄養膜巨細胞または<em&gt;インビトロ</em&gt;栄養膜コーン外植片の短期文化

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

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ゼブラフィッシュ・ブラソドルム外植は、初期胚内の内在性シグナル伝達センターから胚細胞を単離することによって生成され、比較的ナイーブな細胞クラスターを容易に操作し、 培養したex...

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ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル...

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

学ぶゼノプス・ラエビス胚の芽球からTGF-βファミリー切断産物を迅速に収集し、免疫ブロットで解析する手法。発生生物学におけるタンパク質動態の理解に貢献する。

ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

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