フローサイトメトリーによる品質管理痰解析
August 9th, 2021
このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。
このプロトコルは、従来、高スループットの臨床診断目的でフローサイトメトリーで使用することが困難になった喀痰処理で経験した一般的な課題を解決します。このプロトコルは、痰の重量を使用して抗体と染色染色量を決定することで時間を節約するように設計されています。染色インキュベーションの間、下流工程に対して細胞数を行うことができる。
フローサイトメーターでの動作時に問題が発生するのを防ぐために、正確なセルカウントを達成して正しい再懸濁液量を決定することが重要です。このプロトコルは、肺の健康を調査する研究分野に関する洞察を提供することができます。例えば、COPD、喘息、肺癌、またはCOVIDの影響などの病気を研究することができます。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究開発科学者であるマイケル・ライ博士です。まず、痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。痰の重量に基づいて適切なサイズの容器にサンプルを移し、0.5%NACのグラム当たり1ミリリットル、0.1%DTTのグラム当たり4ミリリットルを加えます。
最高速度で15秒間、最高速度でサンプルを渦を出し、室温で15分間最高速度で揺れ動きます。このサンプルを4Xハンクスバランス塩溶液またはHBSSで希釈して、NACとDTTを中和します。そして、迅速な渦の後、室温でサンプルを5分間揺らします。
フィルターセルサスペンションは、100マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50ミリリットルの円錐型遠心分離チューブに入り、単一細胞懸濁液を作成します。細胞をペレットダウンします。上清を吸引した後、15ミリリットル円錐形チューブにペレットを組み合わせ、同じ条件でHBSSで洗浄します。
細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。細胞懸濁液からアリコートを取り、0.4%トリパンブルーの30マイクロリットルで痰希釈の10マイクロリットルを混合し、生きている/死んだ細胞数のためにヘモサイトメーターの計数室にロードする。補償管のラベルの痰。
テキストに示されているように、HBSS抗体と色素を各喀痰細胞チューブおよび補償チューブに追加します。痰細胞をアッセイチューブに加え、テキストに記載されているように補償チューブに補償ビーズを追加します。氷上のすべてのチューブを35分間、光から保護してインキュベートします。
その後、氷冷HBSSでチューブを充填した後、800倍のG.補償チューブで10分間摂氏4度で遠心分離機、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。次に、0.5ミリリットルの冷たいHBSSを補償管に加え、フローサイトメトリー分析に必要になるまで氷上のチューブを光保護領域に保管します。次いで、上清を、染色されていない痰、アイソタイプ、血液、および上皮管から吸引する。
チューブをフリックしてペレットを緩めます。1%PFAの2ミリリットルを未染色およびアイソタイプチューブに加え、血液および上皮管に10ミリリットルを加えます。氷上のチューブを光保護された方法で30分間インキュベートし、最高速度で素早く渦を出し、さらに30分間再びインキュベートします。
その後、氷冷HBSSでチューブを充填します。次に、細胞ペレットを乱さずに10分間、600倍のG.吸入体で摂氏4度でチューブを遠心分離し、指でチューブをフリックして細胞を緩め、200マイクロリットルの冷たいHBSSを未染色およびアイソタイプチューブに加えます。総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためにHBSSの必要な容積を計算し、加える。
フローサイトメトリー解析が行われるまで、氷上の光から保護された補償管に全てのサンプルを摂氏4度で保存します。使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。国立標準技術研究所またはNISTビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロットにスパンするようにNISTビーズを配置します。
LSRII の場合は流量を中に設定し、Navios EX の場合は高に設定します。散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整するためのガイダンスとして、ゲージ戦略を持つ数字を使用してください。最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。
痰重量を用いて、染色用の抗体または色素量を決定した。痰の重さと細胞収量の相関は強くはなかった。痰サンプルは、細胞収量の分布に集まった4つの重量カテゴリに分けられた。
使用した各抗体は、最も高い染色指数を有する高原相上濃度で滴定し、働き濃度として選択した。すべての重量カテゴリーにおいて、平均SEC汚染は20%未満であり、生存細胞の割合が示された。提示は、分析に使用される格言戦略です。
NISTビーズは、破片を除去するために痰サンプルに適用されたゲートを設定するために使用されました。小さな破片は、幅のゲートによってさらに排除されました。生存性染料は死んだ細胞を排除するために使用され、シングルゲートはダブレットを除去した。
抗CD45抗体標識により、生きた単一喀痰細胞を血液細胞および非血液細胞区画に分離することができた。ナビオスEX、LSRII、およびリリックから得られたプロファイルを比較した。破片、死んだ細胞、ダブレットを排除し、血液と非血液プロファイルを比較するための格言戦略が示されている。
この技術は、これらの方法を適用して、非侵襲的な臨床検査として使用するための肺癌リスクを検出することを可能にしました。
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概要
このプロトコルは、痰の処理で経験される一般的な課題を解決し、高スループットの臨床診断にフローサイトメトリーを使用することを容易にします。正確な細胞カウントと再懸濁体積の重要性を、フローサイトメトリー分析の成功に重視しています。
主要な研究要素
科学分野
- フローサイトメトリー
- 細胞生物学
- 肺の健康研究
背景
- 痰の処理は、歴史的にフローサイトメトリーにとって課題となってきました。
- 正確な細胞カウントは効果的な分析に不可欠です。
- 研究分野には、COPD、喘息、肺がん、COVID-19が含まれます。
- このプロトコルは、臨床診断のための痰分析を効率化することを目的としています。
研究目的
- 痰を単一細胞懸濁液に分離する効率的な方法を提供すること。
- 標準的なフローサイトメトリープラットフォームを使用して細胞サブセットを特徴付けること。
- 肺の健康と関連疾患の研究を強化すること。
使用方法
- 痰の重量に基づいて抗体および染色液の体積を決定すること。
- 染色中における細胞カウントの実施。
- 下流の分析にフローサイトメトリーの利用。
- 研究インサイトのための細胞サブセットの特徴付け。
主要な結果
- このプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に正常に分離します。
- 正確な細胞カウントが達成され、効果的なフローサイトメトリーを可能にします。
- 肺の健康と疾患メカニズムについての洞察が提供されます。
- プロセスの効率化により、臨床診断能力が向上します。
結論
- このプロトコルは、痰分析のための信頼性の高い方法を提供します。
- フローサイトメトリー用の痰処理における過去の課題に対処します。
- この結果は、肺関連疾患のさらなる研究を支持します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key bottleneck in lung disease research by enabling high-throughput, quantitative analysis of sputum via flow cytometry. It transforms a traditionally low-yield, labor-intensive cytology method into a scalable, reproducible platform suitable for biomarker discovery and target validation in respiratory therapeutics. The approach supports mechanistic de-risking by providing immunophenotypic resolution of hematopoietic and epithelial lineages while excluding confounding debris and squamous epithelial cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular heterogeneity in lung microenvironment to validate therapeutic targets in inflammatory and oncologic pathways.
- Operational Value: Reduces reliance on specialized cytopathology personnel through automated, standardized phenotyping.
- Predictive Value: Supports target confidence by quantifying immune cell infiltration and epithelial activation states relevant to COPD, asthma, lung cancer, and post-COVID lung pathology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiparametric readouts of CD45+ and CD45− populations for assay standardization across drug screening campaigns.
- Operational Value: Enables high-throughput sample processing using weight-based reagent normalization, improving reproducibility across sites and operators.
- Platform Reuse: Demonstrated compatibility across Navios EX, LSR II, and Lyric cytometers, supporting cross-platform assay transfer and centralized core lab utilization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses lung-specific macrophage identification as a quality control to confirm sample origin, enhancing confidence in preclinical-to-clinical continuity.
- Mechanistic De-risking: Enables longitudinal monitoring of immune and epithelial shifts in disease models, supporting go/no-go decisions in lead optimization.
- Predictive Confidence: Provides a biomarker-ready framework for evaluating target engagement in pulmonary inflammation or tumor microenvironment modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling standardized immune profiling of lung-derived samples, supporting hypothesis testing in early discovery and mechanistic validation in preclinical stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven exploration of lung immune landscapes and stromal interactions in disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular readouts suitable for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Generates multiparametric flow cytometry data enabling statistical comparison of treatment effects across experimental groups.
- Translational Research: Supports biomarker alignment through lineage-specific gating and viability-based exclusion of nonviable or contaminating cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, weight-normalized workflow that can be deployed across multiple sites and instrument platforms for consistent data generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from debris and squamous epithelial contamination.
- Operational Value: Improves throughput and reproducibility via sputum weight-based reagent dosing and standardized gating strategies.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions in respiratory drug programs by providing quantifiable immune and epithelial phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating translatable biomarker data from non-invasive lung samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, gating, and immunophenotyping of primary human cells.
- Dependent on access to flow cytometers with adequate fluorescence detection and scatter resolution.
- Necessitates standardization of staining protocols and QC metrics (e.g., NIST bead normalization) across sites.
- Requires adaptation of antibody panels based on target biology while maintaining viability and singlet gating.
- Limited by sample quality and sputum viscosity, which may affect dissociation efficiency and cell yield.
