Name: フローサイトメトリーによる品質管理痰解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる痰処理の品質管理手法。COPDや喘息、肺がんなどの呼吸器疾患研究に有用な単細胞懸濁液調製と細胞解析の効率的なプロトコールです。

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ダビド・ロドリゲスのフィギュア準備に対する彼の支援に感謝したいと思います。痰サンプルは、UTヘルス、NIH-NCI P30 CA054174-20(UTヘルスのCTRC)およびUL1 TR001120(CTSA助成金)によってサポートされているUTヘルスサンアントニオフローサイトメトリー共有リソース施設のBD LSR IIで実行されました。

痰処理のすべてのステップは、適切な個人用保護具を備えた生物学的安全キャビネットで行われます。
1. 痰解離開始前の試薬製剤
<ol><li>1%パラホルムアルデヒド(PFA)、氷上のサンプルあたり25 mLを解凍し、使用するまで冷たく保ちます。 注意:PFAは吸入および皮膚接触によって有毒である。メーカーの指示に従って固定液を準備し、使用するまで25 mLアリコートで-20°Cで凍結します。</li>
	<li>サンプルの重量に近いし、ステップ2.2のために十分な0.1%ジチオトレイトール(DTT)を解凍し、37°Cに持って来ます。 (DTTのアリコートは使用前に-20 °Cで保存する必要があります。</li>
	<li>ステップ2.2のために37 °Cまで十分な0.5%N-アセチル-L-システイン(NAC)を持って来なさい。(NACは毎週新鮮にして、使用前に4°Cで保管してください。</li>
</ol>2. 痰解離
<ol><li>痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。 注: サンプルは、最初のウェイトが ≤3 g、>3 g が ≤8 g の場合は中程度、>が 16 g ≤ 場合は大きい、サンプルが >16 g の場合は特大である場合は小さいと見なされます。小、中、大、および超大の表示は、プロトコル全体で使用されます。解離や標識に必要な試薬の量は、痰サンプルの大きさによって異なります。</li>
	<li>小さなサンプルを清潔な50 mL円錐形チューブ、中程度のサンプルを清潔な250 mLプラスチック製使い捨てボトルに、または大型の超大型サンプルを、清潔な500 mLプラスチック製の使い捨てボトルに移します。0.5%のNACと0.1%DTTの4 mL/gサンプル重量の1 mL/gサンプル重量を加えます。</li>
	<li>最高速度(15sの場合)で渦を起こしてから、室温(最高速度)で15分間揺れ動きます。</li>
	<li>NAC と DTT を中和するために、4 つの量のハンクのバランス塩溶液 (HBSS) (サンプル + 試薬の総量に基づく) でサンプルを希釈します。最高速度で素早く渦を、最高速度で5分間室温で揺れ動く。</li>
	<li>100 μm ナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50 mL円錐遠心分離チューブにセルサスペンションをフィルターして、単一細胞懸濁液を作成します。</li>
	<li>4°Cで10分間800xgで細胞を遠心分離する。 上清を吸引し、1本の15mL円錐状チューブに入ったペレットを全て結合し、同じ条件でHBSSでペレットを洗浄します。</li>
	<li>細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。 メモ:小さなサンプルは、HBSSの250 μLで再懸濁されます。中程度のサンプルは、HBSSの760 μLで再懸濁されます。大きなサンプルと超大型サンプルは、1460 μLのHBSSで再懸濁されます。</li>
	<li>トリパンブルーを使用してライブ/デッドセルカウントのための細胞サスペンションのアリコートを取ります。 メモ:小さなサンプルの場合は5μLを使用してください。中型、大、または特大サンプルの場合は、10 μL を使用します。<ol>
<li>0.4%のトリパンブルーの30 μLと痰希釈の10 μLを混合して、1:40の最終サンプル希釈を達成します。細胞数のためのヘモサイトメーターの計数室にロードします。 メモ: セル数が小さすぎる場合や、セル数が多すぎて正確な数を得るには、最終的な希釈を調整する必要があります。痰細胞とSECsや破片を正しく区別するためのGuiotら.20 のコンサルティングを強く推奨します。これは、正確なセル数に不可欠です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>超大型サンプルから、合計から50 x 106 個のセルを取り出し、HBSSを十分に追加して新しいチューブに追加して、合計体積1700 μLを作成します。 注: プロトコルの残りの部分については、このサンプルを大きなサンプルと考えてください。残ったサンプルは廃棄するか、または他の目的のために使用することができる。</li>
</ol>3. 抗体と生起性染料染色
<ol><li>抗体と染色染料の選択 注: 表 1 は、このプロトコルで使用されている抗体および生存率染料と、それらが識別する細胞集団を示しています。<ol>
<li>痰セルを含むチューブにラベルを付けます(ラベルについては 表2 を参照)。</li>
		<li>未染色細胞とチューブとアイソタイプコントロールを有するチューブとサンプルチューブに5mLフローサイトメトリーチューブ(使用されるフローサイトメーターと互換性がある)を使用してください。血液および上皮管サンプルに15 mL円錐形チューブを使用してください。 注:これらのサンプルは、抗体染色および固定に続いてフローサイトメトリーチューブに移されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>補償管にラベルを付けます(表3)。 注:使用されているフローサイトメーターと互換性のある5 mLフローサイトメトリーチューブを使用してください。</li>
	<li>表 2 および 表3に示すように、それぞれHBSS、抗体および/または色素の量を痰細胞チューブおよび補償管に加える。 注:細胞または補償ビーズを追加する前にすべてのチューブにバッファー(HBBS)、抗体、および染料を追加して、すべてのチューブの染色時間が一貫していることを確認してください。</li>
	<li>表2に記載されている痰細胞容積量をアッセイチューブに加えます。</li>
	<li>表 3 に示すように、補正ビードを補正管に追加します。</li>
	<li>氷の上のすべてのチューブ(アッセイおよび補償チューブ)を、光から保護し、35分間インキュベートします。その後、氷冷HBSSと遠心分離機を4°Cで800xgで10分間充填 します。</li>
	<li>補償管の場合、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。</li>
	<li>0.5 mLの冷たいHBSSを補償管に加え、4°Cの氷の上に保管し、フローサイトメトリー分析に必要になるまで光から保護します。</li>
	<li>遠心分離後の非染色アイソタイプ、血液、上皮管から上皮管を吸引し、チューブをフリックしてペレットを緩めた。</li>
</ol>4. 1%パラホルムアルデヒド(PFA)による固定
<ol><li>未染色の、アイソタイプ、血液、および上皮管に冷たい1%PFA(現在では解凍されるべき)を加える。2 mLを非染色およびアイソタイプチューブに、血液および上皮管に10 mLとした。</li>
	<li>氷上のチューブをインキュベートし、1時間光から保護します。30分後に最高速度で素早く渦を起たします。</li>
	<li>氷冷HBSSでチューブを充填します。次いで、遠心管を4°Cで1600xgで10分間10分間用 いた。</li>
	<li>細胞ペレットを邪魔することなくできるだけ多くの上清を吸引し、指でチューブをフリックして細胞を緩めます。</li>
	<li>200 μL のコールド HBSS を、未染色およびアイソタイプのチューブに追加します。</li>
	<li>総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためのHBSSの容積を計算する。 注: 再懸濁液量 = 0.15 x [総セル数(痰解離のステップ 8)/106]。特大サンプルのセル数として 50 x 106 を使用します。</li>
	<li>フローサイトメトリー分析が行われるまで、氷上の光から4°Cで保護されたすべてのサンプルおよび補償チューブを保管してください。 注: このプロトコルは、24 時間を超えるストレージのテストは行っていません。</li>
</ol>5. フローサイトメーターでのデータ取得
<ol><li>使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。 注:プロトコルのこのセクションでは、フローサイトメーターを操作する人は、特に光学系および流体システムの安定性のチェック、光散乱および蛍光強度を標準化するための技術、および正しい補償行列の計算と適用を含む日常的な手順に関して、利用可能な機器の使用に関する訓練を受けていることを前提としています。</li>
	<li>国立標準技術研究所(NIST)ビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロット全体に分散するようにNISTビーズを配置します。 注:このステップは、取得後の分析をゲートすることにより、5 μm未満の破片を確実に除去するために重要です。使用するフローサイトメーターによっては、最小のビーズがしきい値(LSR IIまたはリリックを使用する場合)または高い識別子(Navios EXフローサイトメーターを使用)で除外されないことに注意してください。Navios EXでは、フォワードとサイドの散乱には2のゲイン、前方散乱には236、サイドスキャッタには250の電圧が使用されました。LSR IIでは、順方向散乱電圧165、側散乱電圧190を使用した。</li>
	<li>流量を中(LSR II)または高(Navios EX)に設定します。 メモ:ほとんどの機器の中流量または高流量は、痰管の獲得に使用できます。流量が遅すぎたり、サンプルが希薄化しすぎると細胞が沈降し、望ましくない渦が増える可能性があることに注意することが重要です。したがって、ステップ4.6で計算されたリサスペンション体積に付着すると、迅速に取得できるが、機械を詰まらせない細胞密度をもたらすはずである。</li>
	<li>散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整する方法のガイダンスとして、格言戦略との数字を使用してください。 注: 必要なすべてのパラメータが取得前のパラメータ選択ウィンドウで選択されているか、データが取得されないことを確認してください。</li>
	<li>最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。 注:細胞懸濁液が集中しすぎて、フローサイトメーターが詰まることなくサンプルを実行できない場合、サンプルはHBSSでさらに希釈される可能性があります。</li>
</ol>

著者は全員、バイオアフィニティ・テクノロジーズの過去または現在の従業員です。

痰の細胞含有量は、多くの場合、多くの破片37を伴う広い範囲の細胞の多種多様を含む。さらに、喀痰分析には、サンプルが口腔38の代わりに肺から採取されることを確認する品質管理が必要である。したがって、血液の場合ほどフローサイトメトリーによって痰を分析することは簡単ではなく、例えば、はるかにクリーンで均質な細胞懸濁液を放出する。このプロトコルは、特定のサイズのビーズを使用して計器の設定を提供して、最小および最大の細胞集団の両方を検出できるようにするため、破片、細胞の塊、SECsおよび他の死んだ細胞を汚染するゲージ戦略、そして最後に、痰サンプルが主に唾液ではなく肺からのものであることを保証するための品質管理措置である。
プロトコルには、指摘する価値のある痰を扱う上で重要なステップがあります。まず、細胞収量は、プロトコルの痰解離部分のステップ2.5で使用されるナイロンセルストレーナーの数によって大きな影響を受けることができます。複数のストレーナーは、ストレーナーの詰まりのためにあまりにも多くの細胞...

フローサイトメーターのハードウェアとソフトウェアの技術的進歩により、多くの異なる細胞集団を同時に1,2,3,4個同定することが可能になりました。例えば造血細胞研究におけるフローサイトメーターの利用は、免疫系2および造血系5の細胞階層の理解を大幅に向上させ、また多数の異なる血液癌の診断的区別を6,7,8に導いた。ほとんどの喀痰細胞は造血起源9,10,11であるが、血流サイトメトリーは診断目的で喀痰解析に広く適用されていない。しかし、いくつかの研究は、痰(細胞の最も重要なサブセット)における免疫細胞集団の評価が喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)12,13,14,15などの疾患の診断および/またはモニタリングに大きな助けとなる可能性があることを示唆している。さらに、フローサイトメトリーに使用できる上皮特異的マーカーの存在は、痰、肺上皮細胞における細胞の次の最も重要なサブセットの尋問を可能にする。
異なる組織起源の多くの異なる細胞集団を分析する能力に加えて、フローサイトメーターは比較的短い期間で多数の細胞を評価することができる。それに比べて、スライドベースの細胞学的なタイプの分析には、多くの場合、高度に専門性の高い人員や機器が必要です。これらの分析は、作業集約的であり、分析される痰サンプルの割合に過ぎない。
3つの重大な問題は、フローサイトメトリーにおける痰の広範な使用を制限する。最初の問題は、痰のコレクションに関連しています。痰は、肺から口腔に粘液を排出するハフ咳を通して収集され、その後、コレクションカップに唾を吐く。粘液は口腔内を通過するので、SEC汚染の可能性が高い。この汚染は検体分析を複雑にしますが、この研究で示されるように、フローサイトメトリックプラットフォーム上で問題が容易に修正されます。
誰もが自発的に痰を作り出すことができるわけではありません。したがって、いくつかの装置は、非侵襲的な方法で痰の収集を支援するために開発された17。ネブライザーは、そのような装置の1つであり、信頼性の高い痰サンプル18,19,20を生成することが示されている。ネブライザーは、非侵襲的に痰を収集する非常に効果的な方法であるが、その使用はまだ専門の人員21を有する医療施設での設定を必要とする。対照的に、肺フルート22,23,24やacapella16,25などのハンドヘルドデバイスは、非常にユーザーフレンドリーであるため、自宅で使用することができます。これらの補助装置は安全で費用効果が高い。
私たちにとって、アカペラは肺flute16よりも一貫して良い結果を与えたので、アカペラ装置は痰のコレクションのために選ばれました。痰を使用する主な目的は、肺癌検出テスト16を開発することであるため、3日間の採取サンプルが決定されました。3日間のサンプルは、1日または2日間のサンプル26,27,28と比較して肺癌検出の可能性を高めることが示されている。しかしながら、痰の収集の他の方法は、異なる目的のために好ましいかもしれない。ここで説明した痰の収集方法とは異なる場合は、フローサイトメトリクス分析に使用される各抗体または色素を注意深く評価することをお勧めします。異なる喀痰の収集方法がフローサイトメトリーの標的タンパク質にどのような影響を与えるかについては、ごくわずかなデータが利用できます。
第二の問題は、主にフローサイトメトリーに関連する診断に痰を使用するための熱意を減衰させる、細胞数である。問題は、信頼性の高い分析に十分な生存細胞の収集です。2つの研究は、非侵襲的な方法によって収集された痰サンプルが、補助装置の助けを借りて、臨床診断または研究研究で利用できる十分な生存細胞を含み、16,24を示した。しかし、これらの研究はいずれもフローサイトメトリーに関する細胞数の問題に取り組まないようにした。
このプロトコルの基礎となる研究では、各研究部位に対して承認された制度ガイドラインに従って、肺癌を発症する危険性が高い参加者から喀痰サンプルを採取した。リスクの高い参加者は55年から75年の間と定義され、30パック年を吸い、過去15年以内に禁煙しなかった。患者は、メーカーの指示に従ってアカペラ装置を使用する方法を示された29 、自宅で3日間連続して痰を採取した。サンプルは最後のコレクションまで冷蔵庫に保管していました。最終採取日に、サンプルは冷凍コールドパックで一晩実験室に出荷されました。サンプルは、受け取った日に単一の細胞懸濁液に処理された。この喀痰収集法により、信頼性の高いフローサイトメトリック解析のために十分以上の生存細胞が得られます。
最後に、以前の細胞数問題に関連して、痰細胞をそのマス状環境からどのように放出させるかという問題である。細胞を生存可能に保ち、フローサイトメーターを詰まらせない単一細胞懸濁液を作り出す方法は?Pizzichini et al.30およびMillerら31の初期の研究に基づいて、このプロトコルは、フローサイトメトリック分析に適した単一の細胞懸濁液への痰処理のための容易で信頼性の高い方法を記述する。この方法は、フローサイトメトリ32,33,34の定評のあるガイドラインを用いて、喀痰中の造血細胞および上皮細胞を同定し、計器設定、品質管理措置、および流体細胞測定プラットフォーム上で痰分析を標準化する分析ガイドラインを提供するための効率的な抗体標識戦略を開発しました。

<table><tbody><tr><td>1% パラホルムアルデヒド Flow-Fix</td><td>Polysciences</td><td>25037</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;M nylon cell strainers, Falcon #352360</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0593-1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形ファルコンチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 抗ヒト CD19</td><td>BioLegend</td><td>302219</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 抗ヒト CD3</td><td>BioLegend</td><td>300415</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 抗ヒトサイトケラチン</td><td>BioLegend</td><td>628608</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 アイソタイプ</td><td>BioLegend</td><td>400129</td><td></td></tr><tr><td>BV510 抗ヒト CD45</td><td>BioLegend</td><td>304036</td><td></td></tr><tr><td>CD66b FITC アイソタイプ</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td></td></tr><tr><td>CompBead Plus Compensation ビーズ</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>Corning ポリスチレンディスポアブル 滅菌ボトル 250 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>09-761-4</td><td></td></tr>コー<tr><td>ニングポリスチレン使い捨て滅菌ボトル500mL</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>09-761-10</td><td></td></tr><tr><td>CS&Tビーズ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>655051</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>FITC 抗ヒト CD66b</td><td>GeneTex</td><td>GTX75907</td><td></td></tr><tr><td>固定可能な生存率 染色</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>FlowCheck</td><td>ベックマンコールター</td><td>A69183</td><td></td></tr><tr><td>FlowSet</td><td>ベックマンコール</td><td>ターA69184</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-175-095</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NISTビーズ、05 & MU;M</td><td>Polysciences</td><td>64080</td><td></td></tr><tr><td>NIST ビーズ, 20 &mu;M</td><td>Polysciences</td><td>64160</td><td></td></tr><tr><td>NIST ビーズ、30 &mu;M</td><td>Polysciences</td><td>64170</td><td></td></tr><tr><td>PE 抗ヒト CD45</td><td>BioLegend</td><td>304039</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 抗ヒト EpCAM</td><td>BD Biosciences</td><td>565399</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 CD206/EpCAM アイソタイプ</td><td>BD Biosciences 562292</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-CR594 抗ヒト CD206</td><td>BD Biosciences</td><td>564063</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>EMD</td><td>SX0445-1</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

Quality-Controlled Sputum Analysis by Flow Cytometry

肺の健康状態を理解するために細胞内容やその他の微小環境特徴を研究するために広く使用されている痰は、従来、細胞学ベースの方法論を用いて分析されている。スライドの読み取りには時間がかかり、高度に専門的な人員が必要であるため、そのユーティリティは限られています。さらに、広範な破片およびあまりにも多くの扁平上皮細胞(SIC)、または頬細胞の存在は、しばしば診断に不十分なサンプルをレンダリングする。対照的に、フローサイトメトリーは、破片やSICを同時に除外しながら、細胞集団のハイスループットのフェノタイピングを可能にします。
ここで提示されるプロトコルは、痰を単一細胞懸濁液に解き分け、抗体染色および細胞集団を固定し、フローサイトメトリクスプラットフォーム上でサンプルを取得する効率的な方法を説明する。デブリ、死細胞(SICを含む)および細胞ダブレットの排除を記述する格言戦略がここに提示される。さらに、この研究はまた、分化(CD)45正および負の集団のクラスターに基づいて生存可能な単一の痰細胞を分析し、造血および上皮系のサブセットを特徴付ける方法を説明する。また、サンプルが肺由来で唾液ではないことを示す証拠として、肺特異的マクロファージを同定することで、品質管理の尺度が提供される。最後に、この方法は、3つのフローサイトメーターで分析された同じ患者の痰プロファイルを提供することによって、異なるサイトメトリックプラットフォームに適用できることが実証されています。ナビオスEX、LSR II、および歌詞。さらに、このプロトコルは、関心のある追加の細胞マーカーを含むように変更することができる。フローサイトメトリックプラットフォーム上で全体の喀痰サンプルを分析する方法をここでは紹介し、肺疾患のハイスループット診断を開発するために痰を有効にします。

このプロトコルは、臨床検査室を念頭に置いて開発されました。プロトコルの開発中に焦点は、シンプルさ、効率、および再現性でした。痰の処理における最も時間のかかるステップは、細胞を数えることであることがわかった。したがって、プロトコルは、時間を失うことなく細胞数とは無関係に喀痰処理および細胞標識を行うことができるように設定される。正確な細胞数は、妨げられない実行のためにサンプルを適切に希釈するために必要であり、抗体標識インキュベーション期間中に得ることができます。
このプロトコルは、最適な細胞標識に使用する抗体/色素の量を示すものとして、細胞数の代わりに痰重量測定を使用します。しかし、痰サンプルの重量には大きな変動があります。分析された126個のサンプルのうち、重量は0.57gから38.30gの範囲で、 図1A は痰重量と細胞収率の相関が強くないことを示している。したがって、サンプルは4つのカテゴリに分かれていました。サンプルの重量の中央値は、小さいサンプルの場合は2.1g、中サンプルの場合は5.0g、大サンプルの場合は11.2...

このプロトコルは、標準的なフローサイトメトリックプラットフォーム上の単一細胞懸濁液に痰を解離し、その後の細胞サブセットの特性を分類するための効率的な方法を説明する。

Sputum, widely used to study the cellular content and other microenvironmental features to understand the health of the lung, is traditionally analyzed ...

このプロトコルは、従来、高スループットの臨床診断目的でフローサイトメトリーで使用することが困難になった喀痰処理で経験した一般的な課題を解決します。このプロトコルは、痰の重量を使用して抗体と染色染色量を決定することで時間を節約するように設計されています。染色インキュベーションの間、下流工程に対して細胞数を行うことができる。フローサイトメーターでの動作時に問題が発生するのを防ぐために、正確なセルカウントを達成して正しい再懸濁液量を決定することが重要です。このプロトコルは、肺の健康を調査する研究分野に関する洞察を提供することができます。例えば、COPD、喘息、肺癌、またはCOVIDの影響などの病気を研究することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究開発科学者であるマイケル・ライ博士です。まず、痰サンプルの重量を量って解離試薬の量を決定します。痰の重量に基づいて適切なサイズの容器にサンプルを移し、0.5%NACのグラム当たり1ミリリットル、0.1%DTTのグラム当たり4ミリリットルを加えます。最高速度で15秒間、最高速度でサンプルを渦を出し、室温で15分間最高速度で揺れ動きます。このサンプルを4Xハンクスバランス塩溶液またはHBSSで希釈して、NACとDTTを中和します。そして、迅速な渦の後、室温でサンプルを5分間揺らします。フィルターセルサスペンションは、100マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、1つ以上の50ミリリットルの円錐型遠心分離チューブに入り、単一細胞懸濁液を作成します。細胞をペレットダウンします。上清を吸引した後、15ミリリットル円錐形チューブにペレットを組み合わせ、同じ条件でHBSSで洗浄します。細胞ペレットを、痰サンプルの初期重量によって決定されるバッファーの体積で再懸濁する。細胞懸濁液からアリコートを取り、0.4%トリパンブルーの30マイクロリットルで痰希釈の10マイクロリットルを混合し、生きている/死んだ細胞数のためにヘモサイトメーターの計数室にロードする。補償管のラベルの痰。テキストに示されているように、HBSS抗体と色素を各喀痰細胞チューブおよび補償チューブに追加します。痰細胞をアッセイチューブに加え、テキストに記載されているように補償チューブに補償ビーズを追加します。氷上のすべてのチューブを35分間、光から保護してインキュベートします。その後、氷冷HBSSでチューブを充填した後、800倍のG.補償チューブで10分間摂氏4度で遠心分離機、ペレットにできるだけ近い上清を吸引し、ペレットをフリックして緩めます。次に、0.5ミリリットルの冷たいHBSSを補償管に加え、フローサイトメトリー分析に必要になるまで氷上のチューブを光保護領域に保管します。次いで、上清を、染色されていない痰、アイソタイプ、血液、および上皮管から吸引する。チューブをフリックしてペレットを緩めます。1%PFAの2ミリリットルを未染色およびアイソタイプチューブに加え、血液および上皮管に10ミリリットルを加えます。氷上のチューブを光保護された方法で30分間インキュベートし、最高速度で素早く渦を出し、さらに30分間再びインキュベートします。その後、氷冷HBSSでチューブを充填します。次に、細胞ペレットを乱さずに10分間、600倍のG.吸入体で摂氏4度でチューブを遠心分離し、指でチューブをフリックして細胞を緩め、200マイクロリットルの冷たいHBSSを未染色およびアイソタイプチューブに加えます。総細胞数に従って血液および上皮管の再懸濁のためにHBSSの必要な容積を計算し、加える。フローサイトメトリー解析が行われるまで、氷上の光から保護された補償管に全てのサンプルを摂氏4度で保存します。使用しているフローサイトメーターに対して適切な起動手順を適用します。国立標準技術研究所またはNISTビーズを混合して、前方散乱電圧と側面散乱電圧を設定して、ビーズを軸に近づけずにプロットにスパンするようにNISTビーズを配置します。LSRII の場合は流量を中に設定し、Navios EX の場合は高に設定します。散乱パラメータと蛍光パラメータに使用する各パラメータの電圧を調整して、細胞集団をスケールに配置します。それに応じて電圧を調整するためのガイダンスとして、ゲージ戦略を持つ数字を使用してください。最初に未染色痰サンプルのデータを取得し、次いでアイソタイプ染色サンプル、次に血液管および上皮管を取得する。痰重量を用いて、染色用の抗体または色素量を決定した。痰の重さと細胞収量の相関は強くはなかった。痰サンプルは、細胞収量の分布に集まった4つの重量カテゴリに分けられた。使用した各抗体は、最も高い染色指数を有する高原相上濃度で滴定し、働き濃度として選択した。すべての重量カテゴリーにおいて、平均SEC汚染は20%未満であり、生存細胞の割合が示された。提示は、分析に使用される格言戦略です。NISTビーズは、破片を除去するために痰サンプルに適用されたゲートを設定するために使用されました。小さな破片は、幅のゲートによってさらに排除されました。生存性染料は死んだ細胞を排除するために使用され、シングルゲートはダブレットを除去した。抗CD45抗体標識により、生きた単一喀痰細胞を血液細胞および非血液細胞区画に分離することができた。ナビオスEX、LSRII、およびリリックから得られたプロファイルを比較した。破片、死んだ細胞、ダブレットを排除し、血液と非血液プロファイルを比較するための格言戦略が示されている。この技術は、これらの方法を適用して、非侵襲的な臨床検査として使用するための肺癌リスクを検出することを可能にしました。

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このビデオでは、気管支肺胞洗浄液中のさまざまな免疫細胞を同定し、カウントするためのフローサイトメトリーの使用を実演しています。まず、生存率色素を用いて単一の免疫細胞を同定し、続いて表面マーカータンパク質の鑑別染色を行うことで、各細胞タイプの正確な列挙が可能になります。...

フローサイトメトリーによる気管支肺胞洗浄液中の免疫細胞の同定と列挙

子宮頸部からリンパ球と単球を採取するためのサイトブラシサンプリングの使用は、女性の生殖管免疫の分析のためのサンプルを提供する低侵襲技術です。このプロトコルでは、フローサイトメトリーアッセイのためのサイトブラシサンプルの収集と免疫細胞の単離について説明します。...

人間頸管サンプルの採取、単離、およびフローサイトメトリー分析

この方法は、細菌の食作用と酸化的バーストを同時に測定することにより、顆粒球の機能を評価する技術を示しています。画像ベースのフローサイトメトリーにより、相対的な機能容量が異なる活性化顆粒球の3つの異なるサブセットを同定することができました。...

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術インビトロ

ここでは、フローサイトメトリーによって、アレルゲン負荷された粒子を定量化するためのプロトコルを提示します。周囲の粒子状物質の粒子は、吸着されたアレルゲンの担体として作用することができます。我々は、直径0.5ミクロン&gt;広く懸濁固体を特徴付けるために使用される方法、フローサイトメトリーことをここに示す、これらのアレルゲン負荷された粒子を測定するために使用することができます。...

PM10における粒子結合のBet V 1アレルゲンのフローサイトメトリー分析

肺の健康状態は、肺の細気管支に存在する免疫細胞のタイプおよび数によって反映される。私たちは、気管支肺胞洗浄技術を説明し、非接着性細胞およびマウスの下気道からの可溶性因子の単離および研究を可能にする。...

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

ここで喀痰誘発の手法について述べる。このプロトコルは、喀痰処理差分セル数を数えるために、喀痰培養上清を収集するために、さらなる分析のための細胞にも説明します。...

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

解剖されたインプラントからの細胞の単離とフローサイトメトリーによる特性評価は、インプラントに対する免疫応答のパターンの理解に大きく貢献します。この論文では、解剖したインプラントから細胞を単離し、フローサイトメトリー解析のために染色するための正確な方法について説明します。...

解剖されたインプラント組織の免疫機能解析のための高次元フローサイトメトリー

本明細書に記載されるプロトコルは、ヒト痰中の好中球プロテアーゼの活性を可視化し定量するためのガイドを提供する。このような分析の用途は、抗炎症治療の評価から、バイオマーカーの検証、薬物スクリーニングおよび大規模なコホート臨床研究まで及ぶ。...

ヒト痰サンプルにおける好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング

近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。...

ハイスループットフローサイトメトリー細胞ベースのアッセイN-メチル-D-アスパラギン酸受容体またはヒト血清中のドーパ​​ミン-2受容体に対する抗体を検出する

学ぶフローサイトメトリーによる痰処理の品質管理手法。COPDや喘息、肺がんなどの呼吸器疾患研究に有用な単細胞懸濁液調製と細胞解析の効率的なプロトコールです。

フローサイトメトリーによる品質管理痰解析

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