心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

この手順の全体的な目標は、単一のデバイスに3つのイメージングシステムの統合を実証することです, これは、機械的機能の同時測定を可能にします, イオンダイナミクス, および収縮心臓組織の幾何学的変化.具体的には、組織の力の産生、カルシウム過渡、局所的な変位、形状変化を測定します。これらのイメージングモダリティの組み合わせは、効果的な治療戦略の開発に大きな影響を与える心臓病の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、筋肉活動の不均一性を研究することができます。このプロトコルで使用される装置は、同じサンプルを撮像することができる3つの撮像システム、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、および光学コメレンス断調を含んでいる。一連の二色性鏡は、蛍光放射と明視野透過画像を分離するために使用されます。

この装置の基本的な特徴は2つの独立して作動させた取付けのホック、3つの光学的に明確な斧を持つ測定室および刺激装置と明視野およびOCTのカメラを同期させる外部のトリガーラインである。このビデオでは、心臓のトラベキュラを分離、準備、および画像化する方法を示し、いくつかの代表的な結果を提示します。麻酔ラットから心臓を切除した後、解剖室に移します。

2つの湾曲した鉗子を使用して、大大間を灌流カニューレの上に引っ張る。大間を1つの鉗れで所定の位置に保持します。一方、チューブラインを開けて、解剖溶液が輸血カニューレを通って流れるようにする。

冠状動脈血管系が血液から取り除かれ、心臓に解剖液が完全に浸透したら、縫合糸を用いて大動脈を所定の位置に固定する。左冠動脈が上面に見えるようにカニューレを回転させることによって心臓を位置づけます。解剖室の底に心臓の頂点を固定します。

両方のアトリアを切断します。中隔の右側を心臓の頂点まで切ります。開いた左心室を解剖室の基部に固定します。

その後、中隔の左側に沿って切断し、右心室を開き、解剖室の基部にピン留めします。右心室の自由な柱管を特定します。スプリングハサミと鉗めを使って、柱壁を取り巻く壁組織を切る。

次いで、壁組織を半分に切断し、柱柱の方向に直交する。壁組織をトリムし、その寸法が使用する取り付け構成に適しています。切除室に切除された線維柱を残します。

洗浄熱水、蒸留水、次に測定室を通して溶液を過熱させます。明視野顕微鏡の光源をオンにし、F1を押してキャプチャを有効にします。下流フックを、明視野イメージの中央に配置するまで手動で調整します。

ダウンストリーム軸 0 をクリックしてから、ダウンストリームを無効にしてモーターを有効にします。フックの終点が既定の対象領域のエッジに揃わるまで、下流の設定ポイント スライダーを動かします。下流軸を再びゼロにしてから、下流の設定点スライダーを 1,000 に移動します。

上流フックでプロセスを繰り返しますが、上流軸を再ゼロにした後は、上流の設定ポイントスライダーを動かしません。取り付けに移動をクリックします。メインスイッチを切り替えてコントローラサブシステムを素早くオンにする前に、ランプスイッチを切り替えて蛍光照明システムを起動します。

操作モードをフロントパネルのモードボタンを押してターボブランキングに切り替え、続いて2つ、次に1つを押します。オンライン ボタンを押して、外部制御を有効にします。測定チャンバーを通るスーパーフューズートの流れを一時停止します。

取り付けチャンバーに解剖液を充填します。1ミリリットルのシリンジを使用して、分離チャンバーから取り付けチャンバにトラベキュラを輸送する。トラベキュラが重力で取り付けチャンバーに降下できるようにします。

取り付けチャンバーの流体レベルを下げて、フックの中央部と同じレベルにします。下流の設定ポイントスライダーを動かして、トラベキュラの緩み長さを反映するようにフック間の距離を調整します。顕微鏡を使用して視覚化を助け、端部組織の片方を鉗子で軽く握り、上流フックに取り付けます。

他の端のティッシュを下流のホックに取り付けます。しっかりと取り付けられたら、チャンバーに移動してトラベキュラを測定室に戻し、スーパーフューズトの流れを再開します。刺激周波数を1に、刺激持続時間を10に、刺激電圧を10に設定します。

刺激を押して刺激を開始します。明視野照明システムをオンにします。F1 キーを押して、ユーザー インターフェイスの線種領域を囲む対象地域を選択します。

計算サルコメアの長さをクリックして、ハイライトされた領域の平均サルコメア長さを計算します。平均サルコメアの長さが約2.32ミクロンになるまで筋肉の長さを増やします。中心の中央の設定点スライダーと分離制御タブを調整して、下流フックの端が明視野画像内にちょうど見えるようにして、筋肉を動かします。

10ツイッチの蛍光情報を収集します。中心の設定値を 200 ずつ増やし、さらに 10 個分の蛍光情報を収集します。明視野のイメージに上流フックが含まれるまで、このプロセスを繰り返します。

最後のウィンドウの蛍光情報を収集します。中心の設定値をゼロに設定して、柱管を中央の位置に戻します。刺激周波数を 0.2 ヘルツに減らし、K-H スーパーフューザートから Fura-2 負荷溶液に切り替えます。

10分ごとに蛍光信号を測定します。PMT信号タブで信号を可視化します。360ナノメートルの信号が10倍に増加した後、刺激周波数を1ヘルツに戻し、K-Hスーパーフューザート溶液に戻します。

信号が安定するまで10分ごとに比率測定を確認し、その時点でデータ収集を開始できます。下流フックのエッジが明視野画像内にある位置に筋肉を戻します。クリックして蛍光源を有効にすることで蛍光情報をキャプチャします。

ハードウェア データのストリーミングを開始します。明視野イメージングユーザインタフェースで、キャプチャモードを外部トリガに設定し、フレームレートを100ヘルツに増やし、キャプチャする画像の数を100に設定します。Control-shift-Sを押し、続いてF1を押して、このウィンドウの明視野イメージングデータを記録します。

中心の設定値を 200 ずつ増やし、明視野のキャプチャプロセスを繰り返します。最終ウィンドウのイメージングデータが収集されるまで、スキャンプロトコルを続行します。中心の設定値をゼロに設定して、柱管を中央の位置に戻します。

マスターキーを回し、電源ボタンを押し、続いてSLボタンを押して、OCT照明ソースをオンにします。ガルバノメーターの頭を覆い、バックグラウンドをクリックして背景干渉パターンを測定し、測定から引きます。イメージ キャプチャ モードをライブ ビューに設定します。

X 軸と Y 軸の X 軸と Y 軸の中心に、X と Y のオフセット値を調整します。柱管を中央に配置し、Y 位置を調整して Y 軸に沿ってスキャンし、上流および下流のフックに対応する位置を見つけます。これらの位置を下に置き、注意してください。

範囲 Y を、これらの値の絶対差を 10 で割った値に設定します。イメージ キャプチャ モードを刺激トリガーに設定し、X から 100 までの範囲を指定し、[アクティブなパラメーターの設定] ボタンをクリックします。ストリームデータをクリックし、取得します。

ここで提示される柱管の全長の地域のカルシウムと明視野情報を捕捉するためには、7つの筋肉位置が必要であった。重ね合わせられた各ポジションからの平均力のこの図は、この動きによってけいれん力が乱されなくなったことを示唆し、力生産の行為の位置依存がないことを明らかにした。100ヘルツのレートで光コヒーレンス断層撮影を使用して収集されたこれらのスキャンは、ImageJプラグイン、Wekaを使用してセグメント化されました。

各断面は、横と深度の解像度の違いにより歪んで表示されます。これは、それぞれの解像度で各軸を個別にスケーリングすることで修正されました。原形のC-スキャンをスケーリングした後、筋肉はほぼ円筒形である。

測定室壁の反射は、時には筋肉データと重複することができますが、セグメンテーションソフトウェアは、これを説明するために訓練することができます。セグメント化されると、筋肉の長さに沿った断面領域を、ツイッチ全体で計算することができます。この特定のトラベキュラは小さな枝を持っていることに注意してください。

枝の動きは、柱柱道に沿っておよそ半ばに明らかです。最後に、セグメント化された画像をメッシュに変換して、幾何学モデルの構築を支援します。毎秒100フレームのレートで7つの位置のそれぞれで撮影された画像データをつなぎ合わせて、柱柱の単一の完全な画像を作成しました。

340および380ナノメートルの励起光に関連する省略された蛍光の比は、トラベキュラがフラ-2を装填された後の細胞内カルシウムと相関する。各ウィンドウからの10の細胞内カルシウム過渡的な平均は、それらが画像化された領域と一致している。この線維柱の過渡期のピークは合理的に一貫しているように見えるが、拡張期カルシウムはその長さに沿って減少した。

同様に、変位追跡とサルコメア長計算の結果も、地域変動の存在を示しています。使用するマーカーレストラッキング技術は、各ピクセルの変位を計算することができます。サルコメア長さの推定の適合性は、FFT信号に合わせたガウスの幅と振幅に基づいてテストされた。

これらの条件は、ゼロと500ミクロンの間の筋肉領域では満たされなかったので、サルコメアの長さの情報はそこで計算できませんでした。関連する変位を考えると、この領域のサルコメアは、ツイッチの収縮期に細長い可能性が高い。このビデオを見た後、心臓の線維柱を分離し、マルチモーダルイメージングのために確実にそれらを準備する方法をよく理解する必要があります。

このプロセスは、心臓組織収縮の生理学的情報に基づく有限元素モデルの構築に必要なデータセットを収集するための経路を確立する。