Name: 心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: 学ぶ心臓トラベキュラの同時多モーダルイメージング手法。ラット心臓から分離した組織の力学的機能、カルシウム動態、幾何学的変化をブライトフィールド・蛍光・光コヘレンス断層法で測定し、心筋活動の不均一性を解析する。

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この研究は、オークランド大学(JDおよびMCに授与)、サー・チャールズ・ハーカス健康研究フェローシップ(20/011および21/116)ニュージーランド保健研究評議会(J-CHからKTに授与)の博士奨学金によって資金提供されました。 それぞれ)、国立心臓財団(AAに授与)、ニュージーランド王立協会からのマースデン・ファスト・スタート交付金(UOA1504およびUOA1703)によって授与された博士課程の奨学金(J-CHおよびKTに授与される) それぞれ)、ニュージーランド王立協会(ATに授与)のジェームズ・クック研究フェローシップを授与。この楽器の元の開発は、ニュージーランド王立協会(ATとPNに授与)からのマースデン助成金(11-UOA-199)によって資金提供されました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、明視野、蛍光、OCTイメージングを組み合わせた3つの光学系を組み立てて、積極的に収縮するex vivo心臓柱管路筋道からデータを収集できる構成を提示する(図1および図2)。このような調整された統合は、測定チャンバ(図3)の設計により、明視野蛍光軸にOCTの直交配置を可能にするため可能である。筋肉取り付けシステムは、心筋励起収縮ダイナミクスを特徴付ける上で主要指数の同時定量化の成功に同様に重要な役割を果たす。その新しさは、筋肉の機械的性能に明らかな妨害を伴う筋肉スキャン手順を可能にすることに存在する(図6)。このシステムは、力測定用のイメージング構成と電動フックシステムを組み合わせることで、Ca2+過渡性、変位、サルコメアの長さの地域異質性を、収縮する柱管の巨視的幾何学的情報と共に、ツイッチの時間経過を通じて評価することができます(図7および図8)。
心臓研究所内の明視野-蛍光イメージングシステムの普遍性を考えると、これらの結果の再現は、いくつかのマイナーなハードウェアの考慮事項で達成することができます。ここでは、基礎となる収縮性異種性の解析に不可欠な、明視野発蛍光とOCTを組み合わせるための画像処理ツールキットを紹介する。OCTの統合には遮るもののない光路が必要ですが、ゲート付きイメージングには刺激とOCTと明視野イメージングカメラの両方の間の外部トリガラインと、測定チャンバー全体でサンプルを移動できるマッスルマウントフックが必要です。必要な後処理ソフトウェアと方法は自由に利用できます。特に、使用されるセグメンテーションソフトウェアWEKA14はオープンソースである。材料点8、サルコメア長さ、ゲート容積画像10、およびメッシュ生成コードのマーカーレス追跡の技術も同様にアクセス可能であり、対応する著者からの要求に応じて利用可能にすることができる。
筋生存率、Fura-2の最適な荷重、画像フォーカスは、実験の基礎となる3本の柱です。BDMを含む解剖溶液を用いて拘縮を防ぎ、注射器中の筋肉の輸送、溶液の継続的な酸素化、および実験の日に新しい実験溶液を調製し、すべてが高い筋肉生存率に寄与する。Fura-2AMでトラベキュラをロードする前に、自家蛍光を収集する必要があり、測定されたCa2+ 過渡過渡15に大きな影響を与えることができるので、1つは、研究に興味を持っている。フラ-2AMローディング溶液の酸素化は、色素の負荷を助けるために界面活性剤pluronic-F127の必要な包含によって複雑である。この界面活性剤によって引き起こされる過剰な気泡の形成に対抗するために、ローディング溶液中の抗泡剤の小さな低下は、ユーザが酸素化速度を増加させ、それによって、線維柱が負荷プロセス全体で機能的な生存率を維持する可能性を改善する。最後に、明視野情報と蛍光情報のノイズ比に対する信号を最大にするために、画像化焦点は筋肉の長さに沿って均一でなければならない。
ここで説明する方法には、2 つの制限事項があります。1つ目は、蛍光顕微鏡の空間分解能です。OCTと明視野イメージングの空間分解能は高いが、蛍光顕微鏡の分解能は、540 μm x 540 μmのイメージングウィンドウ内で撮影された体積からの蛍光の積分に限定される。PMTの代わりに高利電結合デバイスカメラを用いて蛍光顕微鏡の空間分解能を高める範囲があり、信号対雑音比16を犠牲にして蛍光信号を捕捉する。第二は、測定可能なサルコメアの長さと幾何学的深さの点で研究することができる柱の直径です。サルコメアの長さを計算するためのウィンドウ付きFFTアプローチは、空間分解能の向上の利点を利用しますが、ロバストネスの低下に関連しています(図8D)。濁ったまたは大口径の線維が研究される場合、より大きい組織サンプルの肉体バンドに関連するコントラストが減少するため、FFTの解決性は大きく低下する。同様に、OCT 内では、300 μm を超えるイメージング深度からのバック反射は、セグメント化段階で解決するには弱すぎる。したがって、我々の技術は、直径300μm未満のトラベキュラに限定されています。しかし、刺激率が高い17の間に筋核の拡散性酸素化に問題がある可能性があるので、大径サンプルを研究することはお勧めできません。
健康筋や病気筋の筋肉幾何学に関連したイオン性機械的機能の評価が可能となり、心筋生理学、病態生理学、薬理学を理解するための強力なアプローチを提供します。ここで概説する画像処理パイプラインは、収縮性の不均一性に対する深い理解を得るための極めて重要なデータを抽出します。このような豊富なデータセットの可能性を十分に認識する1つの手段は、これらのデータを統合して解釈する数学的モデルの構築と、私たちのデバイスを使用して実験的にテストできる予測をすることです。

分離された心筋組織製剤の重ね合いは、心臓イオン活性化および力学1を研究するための標準および広く使用されるプロトコルである。特に、心室壁からの柱状構造の単離により、収縮2の長さ依存的活性化、収縮3、4、および心組織の伸縮性5の伸縮性応答を含む現象の評価が可能となった。テル・ケールスは、孤立した線維柱を重ね合わせたこの技術のイニシエータであり、最初はサルコメア長を決定するためのCa2+測定とレーザー回折のための蛍光イメージングの組み合わせを使用した。これらの初期の研究以来、明視野顕微鏡画像上の2D高速フーリエ変換(FFT)ベースの技術6を用いて、より大きな空間解像度でサルコメアの長さの情報を抽出することがますます一般的になっています。2つの画像システムはCa2+放出とサルコメアの長さに依存する力の生産の間の基礎的な関係の部分的な評価を可能にする。
心臓の筋肉は、厚くて厚いフィラメントからなる収縮ユニットの基礎となる一連の基になる一連の関連付けられた可視バンディングで、線条化される。サルコメアを構成するこれらの構成フィラメントの相互作用は、次のように開始する力の生成の根底にある:脱分極電気信号、または作用電位は、細胞膜の電圧依存性L型Ca2+チャネルを開く原因となる。Ca2+の続く細胞流入は、Ca2+誘導Ca2+放出7として知られているプロセスで、細胞内Ca2+ストアであるサルコプラスミクスレチクル(SR)からのCa2+の放出を誘導する。ナノモルからマイクロモル範囲への細胞内Ca2+濃度のこの急激な増加は、力生産が発生することを可能にする;Ca2+ポンプは、細胞質ゾルからCa2+をSRおよび細胞外コンパートメントに連続的に押し出します。細胞内Ca2+濃度がナノモル範囲に戻ると、力の産生が停止し、筋肉が弛緩する。力の生産の間に、構成厚く、薄いフィラメントは互いの上に滑る。サルコメアの長さは、重なり合いの相対的な程度を決定し、したがって、筋肉の力産生の可能性をマクロコスティックに決定する。
本論文では、これらの蛍光・明視野イメージング技術を拡張し、光コヘレンス断層撮影(OCT)を含む。OCTは、干渉の物理的原理を利用し、筋肉収縮不均一性8を理解するために組織の幾何学的変形を獲得することができる。当社のデバイス(図1)は、スペクトルドメインOCT(SD-OCT)システムを使用しています。SD-OCTでは、ビームスプリッタは、広帯域短いコヘレンス長超発光ダイオードからの光をリファレンスアームと測定アームに分割します。リファレンスアームには固定ミラーが含まれ、測定アームには2D-ガルバノメーターが含まれ、光を操縦します。サンプルから後方散乱した光が収集され、参照アームの反射光に干渉して干渉パターンを形成します。深度情報は、スペクトル縞の周波数でエンコードされます。情報を抽出するために、信号は分光計を通り、逆FFTが結果に適用されます。対応する1D信号は、屈折率9(A-スキャン)の変化に対応する異なる深度の構造を表す。レーザーを単軸に操舵させることにより、目的のサンプルの断面(B-スキャン)を構築することができ、同様に、残りの軸にステップワイズパターンで工程を繰り返すことで、3次元画像を生成することができる(C-スキャン)。延長すると、外部トリガに基づいて時間変動の被験者を繰り返し行う一連のBスキャンを収集し、3次元スキャンを繰り返して生成し、時間変動平面画像10を表すことができる。
3つのイメージングシステムを統合する際には、次の2つの原理を検討しました。第一に、イメージングセンサは代替画像モダリティからの光を検出せず、第2に、物理設計には少なくとも3つの同時イメージングプレーンのための空き領域が含まれるべきです。最初の要件に対応するために、明視野顕微鏡は660 nmの波長LEDを使用して、逆の構成でサンプルを照らします。蛍光顕微鏡は、放出された光の励起および収集の両方に同じ対物レンズが使用される、励起構成である。励起光は340nm~380nmの波長を有し、光増倍管(PMT)は510nmの波長で放出された光を測定する。二色性ミラーのペアは、これら2つの光路が反対の測定を妨げることなく同じ物理的フットプリントを共有することを可能にする(図2)。最後に、OCT は、他の 2 つのモダリティとは異なる、中心波長 840 nm の広帯域 (100 nm スペクトル幅) ライトを使用します。OCT に使用される光の低コメレンスの性質上、明視野蛍光源からの散乱光は深度情報をコードする干渉パターンに寄与しません。第二の要件のために、キャピラリーチューブのハウジング設計は、サンプルの前部、劣った、および優れた平面へのアクセス可能な光学経路を有する。実験中、2つのプラチナフックは、酸素化されたクレブス・ヘンセレイト(KH)溶液を透過させた毛細管内に柱管を保持します。OCTのガルバノメータヘッドは、第3直交光学平面を利用する明視野蛍光イメージング経路に直交方向に向けられた(図3)。
この論文では、カルシウム、サルコメアの長さ、筋肉の形状を同時にイメージングできるデバイスを構築するための設計上の考慮事項について説明します。これらの測定能力を実証するために、心室性線維柱を単離するプロセス、必要な緩衝液の調製、 およびエクスビボ トラベキュラの取り扱いと蛍光負荷に関与する重要なステップについて述べています。最後に、データセットをより有用な視覚化に変換するために必要なプロセスの概要を説明します。

<table><tbody><tr><td>2,3-ブタンジオンモノキシム</td><td>アクロスオーガニックス150375000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20&times;顕微鏡レンズ</td><td>ニコン</td><td>CFIスーパーフルーア20&�倍;</td><td>NA 0.75</td></tr><tr><td>2Dガルバノメータ</td><td>Thorlabs</td><td>GVSM002/M</td><td></td></tr><tr><td>50-50 ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>FC850-40-50-APC</td><td></td></tr><tr><td>90-10 ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R2A2</td><td></td></tr><tr><td>アナログ入力モジュール</td><td>National Instruments</td><td>NI-9205</td><td>200kHz でPMT信号を記録</td></tr><tr><td>明視野イメージング光源</td><td>CoolLED</td><td>PE-2</td><td>660&nbsp;nm LAM</td></tr><tr><td>広帯域光源</td><td>Superlum</td><td>Broadlighter-840</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Cameralinkカード</td><td>National Instruments</td><td>NI-1429</td><td>明視野イメージングフレームグラバー</td></tr><tr><td>Carbogen 5</td><td>BOC</td><td>ガスコード:181</td><td></td></tr><tr><td>コンデンサレンズ</td><td>Nikon</td><td>LWD 0.52</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>DAQ</td><td>National Instruments</td><td>NI-6259</td><td>ガルバノメータの動きをトリガーします</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 1</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー 2</td><td>Semrock</td><td>FF552-Di02</td><td></td></tr><tr><td>回折格子</td><td>Wasatch Photonics</td><td>1200 lines/mm @840 nm</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Direct-Q 3 UVシステム</td><td>メルクミリポア</td><td>ZRQSVR3WW</td><td>蒸留水機</td></tr><tr><td>ドライバス</td><td>コーニング</td><td>6875-SB</td><td>LSE デジタルドライバス</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>オープンソース画像処理</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>Fura-2AM ペンタカリウム塩</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F14186</td><td></td></tr><tr><td>ハードウェア FPGAカード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI-7813R</td><td>明視野キャプチャのトリガも制御</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>ファイザー</td><td>61024</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TI-DH 照明柱</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>MedSource</td><td>VAPDRUGISO250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>ラインスキャンカメラ</td><td>Basler</td><td>spL2048-70km</td><td>分光計カメラ</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td>RCT 基本</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>データ処理コード</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<サブ>4</サブ>.7H<サブ>2</サブ>O</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NaH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ>.2H<サブ>2</サブ>O</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO<サブ>3</サブ></td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>OCT FPGAカード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>NI-1483R</td><td></td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td>BOC</td><td>ガスコード:100D</td><td></td></tr><tr><td>pH計</td><td>メトラー・トレド</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>光電子増倍管</td><td>浜松</td><td>H7422-20</td><td></td></tr><tr><td>パワーロード</td><td>サーモフィッシャー</td><td>P10020</td><td></td></tr><tr><td>スーパールミネッセンスダイオード</td><td>ブロードライター</td><td>D-840</td><td></td></tr><tr><td>トランスインピーダンス増幅器</td><td>カスタム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Wistar ラット</td><td>Vernon Jansen Unit</td><td></td><td>8 &ndash; 10 週間</td></tr><tr><td>キセノンアークランプ</td><td>サッター機器</td><td>DG-4</td><td>ラムダ DG-4</td></tr></tbody></table>

心臓トラベキュラex vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

Simultaneous Brightfield, Fluorescence, and Optical Coherence Tomographic Imaging of Contracting Cardiac Trabeculae Ex Vivo

心筋において、細胞内Ca2+ 過渡は収縮筋線維を活性化し、収縮、巨視的な短縮、幾何学的変形を引き起こす。これらの事象間の内部関係に関する我々の理解は、筋肉の内部を「見る」ことも、興奮収縮ダイナミクスの時空間的性質を正確に追跡することもできないため、限られている。これらの問題を解決するために、イメージングモダリティのスイートを組み合わせたデバイスを構築しました。具体的には、サルコメアの長さと組織株の局所的変化を測定するための明視野顕微鏡、Ca2+ 過渡性を視覚化する蛍光顕微鏡、および心臓周期の時間経過を通じて組織の幾何学的変化を捉える光学コヘレンストモグラフを統合する。ここでは、イメージングインフラストラクチャと関連するデータ収集フレームワークを紹介します。データは、トラベキュラカルネとして知られている孤立した棒様組織構造から収集されます。私たちの器械では、位置制御されたプラチナフックのペアは、それが継続的に栄養豊富な生理食塩水で過重化しながら、 元生体筋 サンプルの両端を保持します。フックは独立した制御下にあり、筋肉の長さと力のリアルタイム制御が可能です。縦方向の翻訳により、サンプルの部分走査が可能になり、顕微鏡イメージングウィンドウの相対サイズ(540 μm x 540 μm)と典型的な柱管の長さ(>2000 μm)に関連する制限を克服できます。筋肉室の両端にある白金電極は、ユーザー定義の速度でトラベキュラを刺激する。刺激信号を各イメージングウィンドウからデータを同期させるトリガーとして利用し、定常状態の下でサンプル全体のけいれんを再構築します。これらの明視野画像データに画像処理技術を適用することで、組織変位およびサルコメア長さの地図が提供されます。このようなデータの収集は、実験モデリングパイプラインに組み込まれると、筋肉の収縮性均質性と生理学および病理生理学における不均一性のより深い理解を提供する。

ここで提示されるトラベキュラの全長の地域Ca2+ と明視野情報をキャプチャするためには、7つの筋肉位置が必要でした。 図6 は、この動きによってけいれん力が乱され、活性力生産の位置依存性が存在しなかったことを示唆している。
光コヒーレンス断層撮影を使用して収集したBスキャンは、ImageJプラグインWEKA14を使用してセグメント化された(図7A)。各断面は、横(10 μm)と深さ(1.73 μm(心筋)の解像度の差により歪んで表示されます。この歪みは、画像の深度軸を横方向の解像度-深さ解像度比でスケーリングすることで修正されました。図7B,Cは、原C-スキャンをスケーリングした後、それが幾何学的にほぼ円筒形であることを示す。測定室壁の反射は、筋肉データ(図7A、B)と重なる場合がありますが、セグメンテーションソフトウェアはこれを考慮して訓練することができます(図7D,E)。セグメント化されると、筋の長さに沿った断面領域を、ツイッチ全体で計算することができます(図7F)。この特定の柱管はそれから分岐する小さい付属器を有することに注意してください。枝の動きは、柱柱に沿って約0.75mm明らかです。最後に、セグメント化された画像をメッシュに変換して、ジオメトリモデルの構築を支援することができます(図7G)。
100 fpsの速度で異なる柱の位置で撮影された画像データをつなぎ合わせて、柱柱の単一の完全な画像を作成した(図8A)。これらの画像の解像度は0.535 μm/ピクセルです。隣接するウィンドウの重なる領域で線形重み関数を使用すると、ビニゼーションが助けになり、明視野画像に存在するビネットの影響を最小限に抑えることができます。蛍光信号を測定するために、540 μm~540 μmの経線を、340 nm、365 nm、380 nmの波長光で周期的に600 Hzの速度で照らします。340nmおよび380nmの励起光に関連する放出された蛍光の比は、トラベキュラがFura-2を装填された後の細胞内カルシウムと相関する。この測定は比率であるため、実効測定率は200Hzです。各ウィンドウからの平均(n=10) 細胞内Ca2+ の過渡は、それらが画像化された領域に整列している(図8B)。過渡性のピークは合理的に一貫しているように見えますが、拡張期[Ca2+]は、柱柱に沿って900 μmから1800 μmの領域内で低くなっています。同様に、変位追跡の結果(図8C)とサルコメアの長さ(図8D)計算は、地域変動の存在を示しています。使用されるマーカーレストラッキング技術は、十分なコントラストを与えられた各ピクセルの変位を処理することができます。ポストでサルコメアの長さの分布をマッピングする場合、128×128ピクセル(〜67μm×67μm)の相互相関領域を使用して、局所サルコメアの長さを計算しました。この領域は、サンプルを閉じるときに約29個のサルコメアをカプセル化します。各相互相関ウィンドウの重心間のステップサイズ (x 方向と y方向の両方)は、これらのデータを処理するために50ピクセル(〜26μm)に設定されました。サルコメア長さの推定の適合性は、FFT信号に合わせたガウスの幅と振幅に基づいてテストされた。これらの条件は、0 μm から 500 μm の筋肉領域では満たされなかったため、サルコメアの長さの情報はそこで計算できませんでした。関連する変位を考えると、この領域のサルコメアは収縮期に細長い可能性が高い。この推測に従って、その期間中に、トラベキュラの右側の平均サルコメアの長さが短くなります。各パネルから提供された情報を組み合わせることで、最も大きい断面面積を持つ領域が最も重要な力を生み出さないことが分かります。Ca2+ トランジェントの地域変動がほぼ滑らかな勾配を有することを前提に、 図8B は、最大振幅Ca2+ 過渡が、柱管に沿って1300 μmから1600μmの間のどこかで起こることを示しています。ディスプレイスメント マップは、最小モーションを受ける領域がピーク Ca2+ 過渡性とよく一致していることを示します。ただし、この領域はサンプルの最小の断面領域を持ちます。これらのデータを念頭に置いて、この領域が最もストレスを発生させると推測できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig01.jpg"> 図1: 心筋計の画像に関するアノテ例 主要な光学部品のそれぞれは概説される。インセットは、測定室の下の 、その場で顕微鏡の目的のクローズアップ、リアビューが含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig02.jpg"> 図2:同時明視野と蛍光顕微鏡のための光学経路 蛍光顕微鏡の照明源は、キセノンアーク灯であり、その出力は340nm、365 nm、および380 nm光の間で周期的に切り替わる。アークランプの出力経路は、光を蛍光顕微鏡目的に導く鏡にUV光を反射する409 nmのカットオフ波長の二色性ミラーを含む。レンズは、励起光をサンプルに焦点を当て、510 nmの長波長を有する放出光を収集する。この放出光は、552 nmのカットオフ波長を有するので、第1の二色性鏡を通過するが、第2の二色性ミラーを通過しない。フィールドレンズは、反射光をPMTのセンサーに焦点を当てる。一方、明視野顕微鏡用の照明源(660 nm LED)は、サンプルの上方に位置しています。透過光は凝縮レンズによって試料に集着し、20×蛍光目的は、得られた透過画像を捕捉する。明視野照明に使用される波長は、各二色性鏡のカットオフ波長を超えているため、画像がCMOSカメラのセンサーに焦点を合わせる前に両方を通過します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig03.jpg"> 図3:測定室ホルダー設計(A)光学パスを重ねた測定室ホルダーのアイソメトリック図。明視野照明は、上面(z軸)から発生します。蛍光照明は、劣った表面(z-軸)から発生し、測定アームOCT信号は他の照明軸(y-軸)に直交している。実験中、2つのプラチナフックは、測定室として機能するガラスキャピラリーチューブ内に柱管を保持します。ボイスコイルモーターは、各フックを制御し、その位置はレーザー干渉法を使用して測定されます。現在の位置はユーザ定義の設定ポイントと比較され、FPGA内で符号化されたPIDコントローラを使用すると、エラーが最小化されます。(B)明視野照明をオンにした現場の測定室。バックビューは、図 1のインセットに示されています。(C)測定室ホルダーを通るスーパーフューズート流れの概略。スーパーフューセートはブロックの背面に入り、矢印で示される方向に流れます。上流および下流電極は測定室の取付けられた柱の収縮を引き出すためのフィールド刺激を確立する。青いシェーディングは、実験中にスーパーフューズが流れる領域を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig04.jpg"> 図4:画像取得および制御ソフトウェアの前面パネル( A)ブライトフィールドイメージングユーザインタフェース(B) OCT イメージング ユーザ インタフェース。(C) ハードウェア制御ユーザー インターフェイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig05.jpg"> 図5:トラベキュラ解剖および取り付けプロトコル(A)解剖室でのランゲンドルフ浸透ラット心臓。 (B ) 心房を取り除いた同じ心臓。破線は、心室を開く切除軌道を示します。(C) 両方の心室の内部を露出する心を開いた。破線のボックスは、通常、トラベキュラが見つかる領域を示します。(D) 切除された右心室壁領域 (C の破線ボックスで示されるのと同じ)。破線は3本の柱を強調する。(E)D. (F) 壁組織を除去したパネルEから3つの中から選択された柱管。(G)1 mL シリンジの末端に単離されたトラベキュラ。(H)取り付けチャンバー内のトラベキュラ。(I) 2つのプラチナフックの間に取り付けられたトラベキュラ。(J)この柱は、フック間に取り付けられ、測定チャンバー内(図3B)内に設置される。緑色のスポットは、最初の二色性フィルターからのアーティファクトです。(K)測定室内に取り付けられた柱管の二次角度。柱筋キュラと顕微鏡対物レンズの距離は約1mmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを見るにはこちらをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig06.jpg"> 図6: 力測定の位置依存性 各撮像位置(n=7) から筋肉によって生じる力が重ねられる。平均活性力生産は0.527 mN±0.003 mN、50%収縮に時間は0.3ms±、時間は50%緩和328.1 ms±0.9 msであった(すべてのデータは平均±SEとして提示される)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2.jpg"> 図7: OCTイメージング解析(A) WEKA セグメンテーションの例。筋肉のセグメント化された断面は赤でハイライトされ、背景は緑色で強調表示されます。(B) 柱柱の生のC-スキャンデータの優れたビュー。画像の上部に向かって明るい角度の線は、測定室の壁の反射です。(C) 柱柱の生のCスキャンデータの側面図。(D) セグメント化された OCT データの上位ビュー。(E) セグメント化された OCT データの横ビュー。(F) 経時(y軸) を経て、柱管の長さ(x 軸) に沿った断面領域。筋肉長に沿った断面の平均面積は0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2(平均±S.E.)(G) 柱のメッシュ。メッシュはパネルFの断面面積プロットとほぼ一致<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig7v2lage.jpg" target="_blank">しています。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62799/62799fig08.jpg"> 図8:ブライトフィールドと蛍光イメージング解析(A)柱柱のステッチ画像(7つのイメージングウィンドウ)(B) Ca2+は、柱管の長さに沿って過渡的である。(C) 各イメージングウィンドウからの平均x-変位。正の変位は、右に動き、左に負の値を表します。(D)必要な画像コントラストを持つ各イメージングウィンドウからの平均サルコメア長さ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/62799fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:この表を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62799/Tables_of_solutions.xlsx" target="_blank">ダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、積極的に収縮している心臓の柱状の筋柱からサルコメア、カルシウム、および巨視的幾何学的データの集合 を提示する。これらの同時測定は3つのイメージのモダリティの統合によって可能にされる。

心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

In cardiac muscle, intracellular Ca2+ transients activate contractile myofilaments, causing contraction, macroscopic shortening, and ...

この手順の全体的な目標は、単一のデバイスに3つのイメージングシステムの統合を実証することです, これは、機械的機能の同時測定を可能にします, イオンダイナミクス, および収縮心臓組織の幾何学的変化.具体的には、組織の力の産生、カルシウム過渡、局所的な変位、形状変化を測定します。これらのイメージングモダリティの組み合わせは、効果的な治療戦略の開発に大きな影響を与える心臓病の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、筋肉活動の不均一性を研究することができます。このプロトコルで使用される装置は、同じサンプルを撮像することができる3つの撮像システム、明視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、および光学コメレンス断調を含んでいる。一連の二色性鏡は、蛍光放射と明視野透過画像を分離するために使用されます。この装置の基本的な特徴は2つの独立して作動させた取付けのホック、3つの光学的に明確な斧を持つ測定室および刺激装置と明視野およびOCTのカメラを同期させる外部のトリガーラインである。このビデオでは、心臓のトラベキュラを分離、準備、および画像化する方法を示し、いくつかの代表的な結果を提示します。麻酔ラットから心臓を切除した後、解剖室に移します。2つの湾曲した鉗子を使用して、大大間を灌流カニューレの上に引っ張る。大間を1つの鉗れで所定の位置に保持します。一方、チューブラインを開けて、解剖溶液が輸血カニューレを通って流れるようにする。冠状動脈血管系が血液から取り除かれ、心臓に解剖液が完全に浸透したら、縫合糸を用いて大動脈を所定の位置に固定する。左冠動脈が上面に見えるようにカニューレを回転させることによって心臓を位置づけます。解剖室の底に心臓の頂点を固定します。両方のアトリアを切断します。中隔の右側を心臓の頂点まで切ります。開いた左心室を解剖室の基部に固定します。その後、中隔の左側に沿って切断し、右心室を開き、解剖室の基部にピン留めします。右心室の自由な柱管を特定します。スプリングハサミと鉗めを使って、柱壁を取り巻く壁組織を切る。次いで、壁組織を半分に切断し、柱柱の方向に直交する。壁組織をトリムし、その寸法が使用する取り付け構成に適しています。切除室に切除された線維柱を残します。洗浄熱水、蒸留水、次に測定室を通して溶液を過熱させます。明視野顕微鏡の光源をオンにし、F1を押してキャプチャを有効にします。下流フックを、明視野イメージの中央に配置するまで手動で調整します。ダウンストリーム軸 0 をクリックしてから、ダウンストリームを無効にしてモーターを有効にします。フックの終点が既定の対象領域のエッジに揃わるまで、下流の設定ポイント スライダーを動かします。下流軸を再びゼロにしてから、下流の設定点スライダーを 1,000 に移動します。上流フックでプロセスを繰り返しますが、上流軸を再ゼロにした後は、上流の設定ポイントスライダーを動かしません。取り付けに移動をクリックします。メインスイッチを切り替えてコントローラサブシステムを素早くオンにする前に、ランプスイッチを切り替えて蛍光照明システムを起動します。操作モードをフロントパネルのモードボタンを押してターボブランキングに切り替え、続いて2つ、次に1つを押します。オンライン ボタンを押して、外部制御を有効にします。測定チャンバーを通るスーパーフューズートの流れを一時停止します。取り付けチャンバーに解剖液を充填します。1ミリリットルのシリンジを使用して、分離チャンバーから取り付けチャンバにトラベキュラを輸送する。トラベキュラが重力で取り付けチャンバーに降下できるようにします。取り付けチャンバーの流体レベルを下げて、フックの中央部と同じレベルにします。下流の設定ポイントスライダーを動かして、トラベキュラの緩み長さを反映するようにフック間の距離を調整します。顕微鏡を使用して視覚化を助け、端部組織の片方を鉗子で軽く握り、上流フックに取り付けます。他の端のティッシュを下流のホックに取り付けます。しっかりと取り付けられたら、チャンバーに移動してトラベキュラを測定室に戻し、スーパーフューズトの流れを再開します。刺激周波数を1に、刺激持続時間を10に、刺激電圧を10に設定します。刺激を押して刺激を開始します。明視野照明システムをオンにします。F1 キーを押して、ユーザー インターフェイスの線種領域を囲む対象地域を選択します。計算サルコメアの長さをクリックして、ハイライトされた領域の平均サルコメア長さを計算します。平均サルコメアの長さが約2.32ミクロンになるまで筋肉の長さを増やします。中心の中央の設定点スライダーと分離制御タブを調整して、下流フックの端が明視野画像内にちょうど見えるようにして、筋肉を動かします。10ツイッチの蛍光情報を収集します。中心の設定値を 200 ずつ増やし、さらに 10 個分の蛍光情報を収集します。明視野のイメージに上流フックが含まれるまで、このプロセスを繰り返します。最後のウィンドウの蛍光情報を収集します。中心の設定値をゼロに設定して、柱管を中央の位置に戻します。刺激周波数を 0.2 ヘルツに減らし、K-H スーパーフューザートから Fura-2 負荷溶液に切り替えます。10分ごとに蛍光信号を測定します。PMT信号タブで信号を可視化します。360ナノメートルの信号が10倍に増加した後、刺激周波数を1ヘルツに戻し、K-Hスーパーフューザート溶液に戻します。信号が安定するまで10分ごとに比率測定を確認し、その時点でデータ収集を開始できます。下流フックのエッジが明視野画像内にある位置に筋肉を戻します。クリックして蛍光源を有効にすることで蛍光情報をキャプチャします。ハードウェア データのストリーミングを開始します。明視野イメージングユーザインタフェースで、キャプチャモードを外部トリガに設定し、フレームレートを100ヘルツに増やし、キャプチャする画像の数を100に設定します。Control-shift-Sを押し、続いてF1を押して、このウィンドウの明視野イメージングデータを記録します。中心の設定値を 200 ずつ増やし、明視野のキャプチャプロセスを繰り返します。最終ウィンドウのイメージングデータが収集されるまで、スキャンプロトコルを続行します。中心の設定値をゼロに設定して、柱管を中央の位置に戻します。マスターキーを回し、電源ボタンを押し、続いてSLボタンを押して、OCT照明ソースをオンにします。ガルバノメーターの頭を覆い、バックグラウンドをクリックして背景干渉パターンを測定し、測定から引きます。イメージ キャプチャ モードをライブ ビューに設定します。X 軸と Y 軸の X 軸と Y 軸の中心に、X と Y のオフセット値を調整します。柱管を中央に配置し、Y 位置を調整して Y 軸に沿ってスキャンし、上流および下流のフックに対応する位置を見つけます。これらの位置を下に置き、注意してください。範囲 Y を、これらの値の絶対差を 10 で割った値に設定します。イメージ キャプチャ モードを刺激トリガーに設定し、X から 100 までの範囲を指定し、[アクティブなパラメーターの設定] ボタンをクリックします。ストリームデータをクリックし、取得します。ここで提示される柱管の全長の地域のカルシウムと明視野情報を捕捉するためには、7つの筋肉位置が必要であった。重ね合わせられた各ポジションからの平均力のこの図は、この動きによってけいれん力が乱されなくなったことを示唆し、力生産の行為の位置依存がないことを明らかにした。100ヘルツのレートで光コヒーレンス断層撮影を使用して収集されたこれらのスキャンは、ImageJプラグイン、Wekaを使用してセグメント化されました。各断面は、横と深度の解像度の違いにより歪んで表示されます。これは、それぞれの解像度で各軸を個別にスケーリングすることで修正されました。原形のC-スキャンをスケーリングした後、筋肉はほぼ円筒形である。測定室壁の反射は、時には筋肉データと重複することができますが、セグメンテーションソフトウェアは、これを説明するために訓練することができます。セグメント化されると、筋肉の長さに沿った断面領域を、ツイッチ全体で計算することができます。この特定のトラベキュラは小さな枝を持っていることに注意してください。枝の動きは、柱柱道に沿っておよそ半ばに明らかです。最後に、セグメント化された画像をメッシュに変換して、幾何学モデルの構築を支援します。毎秒100フレームのレートで7つの位置のそれぞれで撮影された画像データをつなぎ合わせて、柱柱の単一の完全な画像を作成しました。340および380ナノメートルの励起光に関連する省略された蛍光の比は、トラベキュラがフラ-2を装填された後の細胞内カルシウムと相関する。各ウィンドウからの10の細胞内カルシウム過渡的な平均は、それらが画像化された領域と一致している。この線維柱の過渡期のピークは合理的に一貫しているように見えるが、拡張期カルシウムはその長さに沿って減少した。同様に、変位追跡とサルコメア長計算の結果も、地域変動の存在を示しています。使用するマーカーレストラッキング技術は、各ピクセルの変位を計算することができます。サルコメア長さの推定の適合性は、FFT信号に合わせたガウスの幅と振幅に基づいてテストされた。これらの条件は、ゼロと500ミクロンの間の筋肉領域では満たされなかったので、サルコメアの長さの情報はそこで計算できませんでした。関連する変位を考えると、この領域のサルコメアは、ツイッチの収縮期に細長い可能性が高い。このビデオを見た後、心臓の線維柱を分離し、マルチモーダルイメージングのために確実にそれらを準備する方法をよく理解する必要があります。このプロセスは、心臓組織収縮の生理学的情報に基づく有限元素モデルの構築に必要なデータセットを収集するための経路を確立する。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この記事では、電位差色素（ジ- 8 -...

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

このレポートは、ストレッチ誘発性心房細動時のランゲンドルフ灌流羊の心臓の無傷の左心房の電気的興奮を同時に心内膜と心外膜の光学的マッピングの方法論と結果の詳細な説明を提供します。...

ストレッチ誘発性心房細動の羊のモデルで高解像度の心内膜と心外膜光学マッピング

この方法は、実験的に誘発された心筋虚血のマウスにおいて、心臓の形態、機能、灌流、代謝、および生存率を評価するための量子マイクロコンピュータ断層撮影法(MicroCT)の使用を概説しています。この技術は、ヒト心臓病のさまざまな動物モデルの非破壊ハイスループット縦断的in...

心筋の構造、機能の in vivo定量的評価では 、灌流および生存率は、心臓マイクロコンピュータ断層撮影法を使用しました

このプロトコルは、脳の血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光（NIRF）イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）の適用を説明します。この技術は、血栓負担と進化の定量化を可能にします。 NIRFイメージング技術は、マイクロCT技術は、金ナノ粒子を用いた動物生体の内部に血栓を視覚化しながら、蛍光、切除した脳内の血栓標識可視化します。...

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

このプロトコルは、MRIと全心心筋組織の3次元比較するための新規な方法を説明します。これは、心筋梗塞の慢性ブタモデルの梗塞境界域における心筋内注射の正確な評価のために設計されています。...

3Dホール・ハート心筋組織の分析

心臓では、分子事象は器官の電気的および収縮機能を調整します。ここで紹介する地元の視野蛍光顕微鏡技術のセットは、無傷の心の中の細胞の変数の記録を可能にします。心機能を定義するメカニズムを識別することは心が病的な状況下でどのように機能するかを理解する上で重要です。...

ローカルフィールド蛍光顕微鏡：無傷の心の中に携帯電話の信号のイメージング

本研究の目的は、翻訳動物モデルを用いて心臓動態を調べる方法を確立することにあった。記述された実験的アプローチは、孤立した無傷の豚の心臓モデルにおける電気的活動を評価するための電気生理学的研究と共に二重放出眼電図を組み込む。...

元ヴィヴォ・ランゲンドルフ・パーフュード・ハーツの眼電図と電気生理学研究

我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。...

マウス心臓全体のメゾスコピック光学イメージング

ここでは、コラーゲン選択的コントラスト増強を有する健康で病理学的な大型哺乳類心臓全体の高解像度マイクロコンピュータ断層撮影画像を得るためのプロトコルを提示する。...

慢性疾患を有する大型哺乳類心臓モデルのコントラスト増強マイクロコンピュータ断層撮影イメージングのための組織調製技術

このプロトコルは、高度なライトシート顕微鏡法と適応した組織透明化法を利用して、げっ歯類の心臓の複雑な心臓構造を調査し、心臓の形態形成とリモデリングの理解に大きな可能性を秘めています。...

げっ歯類の心臓の構造を明らかにするためのライトシートイメージング

再灌流性急性心筋梗塞 (repAMI) における心臓損傷の 3 次元 (3D)...

ライトシート蛍光顕微鏡を用いた再灌流急性心筋梗塞における心臓損傷と免疫応答の同時3D解析

学ぶ心臓トラベキュラの同時多モーダルイメージング手法。ラット心臓から分離した組織の力学的機能、カルシウム動態、幾何学的変化をブライトフィールド・蛍光・光コヘレンス断層法で測定し、心筋活動の不均一性を解析する。

心臓トラベキュラEx Vivoの同時ブライトフィールド、蛍光、光コヘレンス断層イメージング

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