微生物微小液滴培養システム(MMC)を用いた微生物の自動培養と適応進化

この方法は、従来の微生物培養方法の問題点の解決に役立てることができる。これは、自動化された微生物培養と適応進化のための低コストで操作しやすく、結果信頼性の高い実験プラットフォームを提供します。この技術は、運用を自動化し、より大きな労力消費を削減します。

同時に、信頼性の高い結果と簡単な操作で優れた培養性能を備えています。この技術は、主に成長曲線測定、適応実験室進化、単一因子マルチレベル分析などの微生物学研究分野で使用されています。内径0.41ミリメートル、外径0.71ミリメートルのシリンジ針をクイックコネクタAと試薬ボトルに接続して実験の準備を開始する。

その後、すべての機器を摂氏121度で15分間オートクレーブします。マイクロ流体チップを取り付けるには、操作室のドアを開け、光ファイバプローブを持ち上げます。電界穴を針に合わせた後、チップをチップ台座にそっと置き、2つの位置決め列を位置決め穴に挿入して光ファイバプローブを置きます。

次に、チップ上のクイックコネクタAを、原稿に記載されている位置番号に従って微生物微小液滴培養システムまたはMMCの対応するポートに接続する。完了したら、操作室のドアを閉じます。培養したエシェリヒア・コリMG1655懸濁液を培地で0.05〜0.1のOD600に希釈し、10ミリリットルの初期菌液を得た。

MMC を初期化するには、[初期化] タブをクリックします。初期化インターフェースが表示されたら、栽培温度を37°C、光電信号値を0.6に設定します。初期化には約 20 分かかります。

その後、滅菌した試薬ボトルをクリーンベンチに置き、キャップを締めます。10ミリリットルの滅菌シリンジを使用して、シリンジ針からサイドチューブまでの3〜5ミリリットルのMMCオイルを試薬ボトルに注入します。次に、試薬ボトルをゆっくりと傾けて回転させ、オイルが内壁に完全に浸透するようにします。

5ミリリットルの初期菌液をボトルに注入した後、5〜7ミリリットルのMMCオイルを注入して試薬ボトルに充填する。試薬ボトルの独立したクイックコネクタAを引き出し、クイックコネクタAをボトルのクイックコネクタBに挿入してサンプル注入操作を完了します。完了したら、手術室のドアを開けて試薬ボトルを金属浴に入れます。

チップのC2コネクターと試薬ボトルのクイックコネクターAを引き出します。試薬ボトルのサイドチューブコネクタをC2コネクタに接続し、トップチューブコネクタをO2コネクタに接続します。その後、操作室のドアを閉めます。

成長曲線測定の機能を選択するには、パラメータ設定インターフェースの[成長曲線]をクリックし、数値を15として入力します。次に、OD検出スイッチをオンにし、波長を600ナノメートルに設定します。[スタート]タブをクリックして、ドロップレットの生成を開始します。

このプロセスは完了するまでに15分かかります。メインインターフェイスにポップアップウィンドウが表示されたら、操作室のドアを開けて試薬ボトルを取り出し、C2コネクタとO2コネクタを接続します。ドアを閉じた後、ポップアップウィンドウの[OK]ボタンをクリックすると、自動的に液滴が開き、OD値が検出されます。

成長曲線が定常フェーズに達したら、[データのエクスポート] ボタンをクリックして OD データをエクスポートします。データ保存パスを選択し、栽培期間中に記録されたOD値をCVS形式でエクスポート 成長曲線をプロットするには、ExcelやOrigin 9.0などのマッピングソフトウェアを使用します。前述のように、初期細菌溶液、新鮮培地、およびMMCオイルの必要量を、初期細菌溶液用の別々の滅菌試薬ボトルに注入する。

適応進化の機能を選択するには、ソフトウェアでALEをクリックします。パラメータ設定インタフェースでOD検出スイッチをオンにし、原稿に記載されているすべてのパラメータを設定し、[スタート]タブをクリックして液滴生成を開始します。このプロセスには約25分かかります。

各転耕栽培期間中に、液滴の最大OD値が有意に増加したかどうかを観察します。増加が発生し、実験の要件を満たしている場合は、データのエクスポート ボタンをクリックして OD データをエクスポートします。MMCからターゲット液滴を抽出するには、スクリーニングタブをクリックして液滴抽出の機能を選択します。

次に、「収集」オプションを選択し、ターゲットドロップレットの数をクリックします。完了したら、[OK]をクリックします。ポップアップウィンドウがメッセージをプロンプト表示するのを待ちます。次に、CFクイックコネクタを収集用の微量遠心チューブに入れ、[OK]をクリックします。ソフトウェアインターフェイスがメッセージを促す新しいウィンドウをポップアップ表示する1〜2分後、CFクイックコネクタを挿入し、[OK]をクリックしてMMCの実行を続行します。

次のターゲット液滴が液滴認識部位に到達したら、前に指定したとおりに収集します。2.5マイクロリットルのピペットを使用して液滴を取り出し、90ミリメートルの固体プレート上に置き、続いて、一辺の長さが3センチメートルのガラス三角形のコーティングされた棒で滴を均等に広げ、次に37°Cの恒温インキュベーターで滴を72時間培養する。その後、細菌の独立したコロニーを3〜5個選び、各コロニーを、毎分200回転および摂氏37度で振とう培養器内の10ミリリットルの新鮮な培地を含む50ミリリットルの振とうフラスコで別々に培養する48〜72時間。

培養後、関連する標準規制に従って、培養細菌溶液をグリセロールチューブに保存する。代表的な分析は、適応進化プロセス全体における50個の液滴の成長曲線を示す。メタノール必須大腸菌株またはMeSV2.2は、初期に遅い成長を示し、その後に速い成長を示すことが観察された。

全適応進化過程における液滴6の成長曲線を別々にプロットした。第一世代の最大OD600値は0.37で、最後の転耕栽培期間に0.58に増加し、液滴6の株が明らかな適応進化を実現したことを示しています。さらに、液滴6株と初期株の成長曲線を比較した。

この液滴6株は、初期株よりも固定相においてより高い最大比増殖速度および細胞濃度を示した。最も重要なことは、機器チップと試薬ボトルの接続が正しいことを確認することであり、これは操作が正常に進行するための液滴である。この方法は、微生物の培養のための新しいアイデアを研究者に提供し、また、株の適応進化のための効率的で低コストのプラットフォームを提供します。