光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現
2021年8月19日
光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。
このプロトコルは、遺伝子発現をインタクトな生物に誘導するための光遺伝学的、または光活性化方法であるため、重要である。私たちの場合、ゼブラフィッシュ胚。この技術の利点は、誘導の非常に正確な、容量および時間的制御を可能にする誘導剤として、光を使用することである。
このプロトコルは、誘導可能な遺伝子発現が有用であろうあらゆる状況に有用であろう。これには、系統トレース、機能獲得アッセイ、レスキュー実験などがあります。まず、一度にいくつかの胚に光の平方センチメートルの1.5ミリワットの電力を提供するための胚を含むペトリ皿に対するLEDパネルを位置付けます。
テール転写アクティベーターの写真損傷のリスクを低減するには、タイマーリレーを使用して1時間のオンオフ間隔で光をポストします(3時間以上照らす場合)。ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。コントロール胚と暗いコントロールのための防明箱を含むペトリ皿を置きます。
希望の活性化持続時間の後に、照明から胚を取り除きます。RNAの全抽出には、RNA抽出キットを使用してください。胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。
リシスバッファーを追加した後、プラスチックの害虫で胚を均質化します。ライセートをキットに移し、メーカーの指示に従ってRNAを精製します。精製されたRNAを、マイナス20〜マイナス80°Cで保存し、1マイクログラムからcDNAを使用するか、またはすぐに合成するまで、cDNA合成キットを使用して全RNAを、製造業者の指示に従うことによって保管する。
薄い壁に0.2ミリリットル、PCRチューブ、5回のcDNA反応マスターミックス、1マイクロリットルの添加、20倍の逆転写酵素酵素溶液の薄い壁にRNAの1マイクログラムを追加します。次に、ヌクレアーゼを含まない水で20マイクロリットルの最終容積を構成する。cDNA合成のためのプログラムされたサーモサイクラーにチューブを置きます。
使用するか、またはすぐに定量的評価に使用するまで、合成されたcDNAをマイナス20°Cで保存します。サイバーグリーン酵素マスターミックスを含む定量PCR反応を設定します。325ナノモル濃度で325ナノモル濃度で5倍希釈されたcDNAおよびGFPプライマーは、プログラムされたリアルタイムPCRマシンで反応を行います。
反応が完了したら、メルト曲線を分析して反応特異性を決定します。二重デルタCT法を用いて、コントロール胚に対するフォールド変化として光活性化誘導を計算する。そして、統計ソフトウェアを使用して有意性を判断します。
照明から胚を除去した後、ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光ステレオ顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。
GFP発現の定量化は、青色光暴露後30分で発現誘導を示した。GFP発現のレベルは、その後、着実に後活性化、6時間まで増加し続けました。GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した。
バックグラウンドレベルを超えるGFP蛍光は、最初に活性化後3時間で観察され、6時間の後活性化で顕著に明るくなった。対照的に、すべての時間ポイントに対する対照胚は、暗所に保たれ、示さなかった、任意のかなりのGFP蛍光を示した。活性化光は可視光スペクトルの青色の範囲になければなりません。
部屋の光と日光の両方に青色の光が含まれています。だから、任意の周囲の光源からあなたの負のコントロールを保護するために注意してください。TAEL C120システムは、遺伝的にコードされ、モジュラーであり、関心のある任意の遺伝子の発現を駆動することができる。
したがって、他の技術と組み合わせることで、様々な生物学的な質問に答えるために使用することができます。
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概要
本プロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚において光誘導性の遺伝子発現を実現するためのオプトジェネティクス（光遺伝学）の使用法を実演します。青色光応答性のTAEL/C120システムを用いることで、個体内で遺伝子発現を精密に制御することが可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 光遺伝学
- 遺伝子発現
- ゼブラフィッシュモデル
背景
- 光遺伝学は、光によって遺伝子発現を誘導する方法である。
- この手法により、誘導の空間的および時間的な制御が可能になる。
- これは、特に系統追跡や機能獲得試験において有用である。
- ゼブラフィッシュの胚は、in vivoでの遺伝子発現を研究するためのモデルとして用いられる。
研究目的
- 光誘導性遺伝子発現の手法を実演する。
- オプトジェネティクス（光遺伝学）の応用に興味を持つ研究者にプロトコルを提供する。
- 遺伝子発現の精密な制御を必要とする実験を促進する。
使用した手法
- 胚を含むペトリ皿に対するLEDパネルの配置。
- 1.5 mW/cm²の光を照射。
- 複数の胚における遺伝子発現の同時誘導。
- 遺伝子制御のためのTAEL/C120光遺伝学システムの活用。
主な結果
- ゼブラフィッシュ胚における遺伝子発現の誘導に成功した。
- 遺伝子活性化の空間的および時間的な制御を実証した。
- 今後のオプトジェネティクス研究に有用な信頼性の高いプロトコルを提供した。
- 誘導剤として光を用いる利点を明らかにした。
結論
- オプトジェネティクスは、遺伝子機能を研究するための強力なツールを提供します。
- TAEL/C120システムは、in vivoでの遺伝子発現誘導に有効です。
- この手法は、さまざまな生物学的研究シナリオに適用可能です。
よくある質問
産業上の重要性
遺伝子発現のオプトジェネティック（光遺伝学的）制御により、生体内（in vivo）における生物学的標的の精密な時空間的解析が可能となり、初期探索段階におけるメカニズムのリスク低減が促進されます。TAEL/C120システムは、遺伝的にコードされた光スイッチ可能なプラットフォームを提供し、定量的リードアウトによる治療仮説の検証を可能にします。このアプローチは、ゼブラフィッシュ胚において遺伝子発現の可逆的かつ用量依存的な変調を可能にすることで、標的検証における予測信頼性を向上させます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 整数脊椎動物モデルにおいて、誘導可能かつ可逆的な遺伝子活性化により、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： 光誘導発現をGFPリポーターおよびqRT-PCR定量による表現型リードアウトに結びつけることで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 予測的価値： 疾患に関連するコンテキストにおいて、ターゲットの十分性とパスウェイの関連性を評価するための機能獲得およびレスキュー実験を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備： 化合物や条件のスクリーニングのために、蛍光顕微鏡およびqRT-PCRで測定可能な、光依存的な定量的GFP発現を誘導する。
- 再現性： 定義された光強度（1.5 mW/cm²）と時間的制御を用いた標準化された誘導プロトコルにより、繰り返し実験間のばらつきを最小限に抑える。
- 拡張性： LEDパネルを用いて複数の胚を制御された照明下で同時に処理することで、マルチウェル形式への適応が可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患モデリング： 遺伝子発現の経時的制御により、誘導可能な治療介入を模倣するゼブラフィッシュベースの前臨床モデルをサポートします。
- バイオマーカーの整合： GFPおよびqRT-PCRの出力は、パスウェイの関与およびターゲット変調に対する、翻訳可能な薬力学的リードアウトとして機能します。
- リスク軽減： 哺乳類での研究に先立ち、誘導可能な機能獲得およびレスキュー設計を通じて必要性と十分性を検証することで、ターゲットのリスク軽減を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット仮説の検証からリード化合物の同定に至る探索的な連続プロセスに適合しており、脊椎動物系における分子ターゲットの反復的な検証を可能にします。
- 発見生物学：生体内での光誘導による時間的な発現を通じて、標的の十分性とパスウェイの活性化を検証します。
- スクリーニング：定量的かつ標準化された出力（GFPの倍率変化）を提供し、遺伝学的または薬理学的な条件の比較を可能にします。
- 分析：二重デルタCT法を用いたqRT-PCRおよび蛍光強度を用い、誘導群と暗所コントロール間の統計的比較を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：ゼブラフィッシュにおける誘導性発現と表現型のアウトカムを関連付け、前臨床薬効試験への継続性をサポートします。
- 企業での再利用：モジュール式のTAEL/C120システムは任意の標的遺伝子を駆動させることができるため、複数の標的やプロジェクトにわたる再利用が可能です。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 複雑な生物における遺伝子発現を精密に時間制御することで、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 標準化された光照射と内部ダークコントロールを導入し、環境変動を考慮することで再現性を確保する。
- 戦略的価値： 急速かつ可逆的な標的変調により表現型への影響を評価できるため、Go/No-go判断を効率化する。
- ポートフォリオへの影響： リソース集約的な展開の前に、生理学的に妥当な誘導システムで標的を検証することで、リスク調整後の優先順位付けを支援する。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの飼育、マイクロインジェクション、および光遺伝学的ハードウェアのセットアップに関する専門知識が必要です。
- 正確な青色光の強度およびタイミング制御が可能なLED照明システムに依存します。
- データの比較可能性を確保するため、光照射時間および暗所制御の維持に関する標準化されたプロトコルが必要です。
- 異なる胚段階や遺伝的背景にスケールアップする場合、適応に関する検討が必要となります。
- 不透明な組織における光透過性に制限がありますが、ゼブラフィッシュ胚では光学的な透明度が高いため、この影響は軽減されます。
