Name: 光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 学ぶ光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現法。LED照射による正確な時空間制御で遺伝子発現を誘導し、系譜追跡や機能獲得アッセイに応用可能な革新的な手法を解説します。

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ステファン・マテルナとウーとマテルナの研究室のメンバーに、このプロトコルに関する有益な提案とコメントに感謝します。アンナ・リード、ケビン・ガードナー、ローラ・モッタ・メナに感謝し、このプロトコルを開発しながら貴重な議論と洞察を得た。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金によって支えられた。R03 DK106358)とカリフォルニア大学がん研究調整委員会(CRN-20-636896)からS.W.

この研究は、カリフォルニア大学マーセド校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
1. ゼブラフィッシュの交差と胚のコレクション
<ol><li>TAEL転写活性化剤またはC120制御レポーター遺伝子のいずれかを含む別々のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを維持し、スプリアス活性化を最小限に抑えます。</li>
	<li>TAELとC120成分の両方を含む二重トランスジェニック胚を生成するために、標準的な方法9を使用して各ラインから6〜8個の成体ゼブラフィッシュを渡る(図1B)。 注:あるいは、両方の成分は、標準的な方法10を用いてmRNAまたはプラスミドDNAのマイクロインジェクションを通じて一過性に発現することができる。</li>
	<li>卵水(蒸留水に溶解した60μg/mLインスタントオーシャン海塩)を含むペトリ皿に胚を収集し、テストする条件ごとに約30個の胚をテストします。</li>
	<li>防光ボックスに皿を置くか、アルミホイルで覆い、周囲光による意図しない活性化を最小限に抑えます( 表1参照)。</li>
</ol>2. グローバルな光誘導
<ol><li>青色光(465 nm)のLEDパネルを使用して、一度に複数の胚に青色光を活性化します。</li>
	<li>胚を含むペトリ皿に対してLEDパネルを配置して、胚が受け取る光の実際の電力が光パワーとエネルギーメーターで測定される約1.5mW/cm2になるように配置する(図2A)。</li>
	<li>TAEL転写活性化剤5,8への光損傷のリスクを低減するために3時間以上照らす場合は、タイマーリレーを使用して1時間/1時間の間隔で光をパルスする。 注: イルミネーションの正確な持続時間は、特定のアプリケーションに合わせて最適化する必要があります。このプロトコルでは、30分、1時間、3時間、および6時間の照射持続時間の例が提供される。</li>
	<li>ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。</li>
	<li>コントロール胚を含むペトリ皿を防明箱に入れるか、暗いコントロールのためにアルミホイルで覆います。</li>
</ol>qRT-PCRによる誘導の定量的評価
<ol><li>目的の活性化持続時間の後に、胚を照明から除去します。</li>
	<li>キットの指示に従ってRNA分離キットを使用して、30-50光活性化および30〜50個の暗い胚から総RNAを抽出します。<ol>
<li>胚を1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。リシスバッファーを追加し、プラスチックの害虫で胚を均質化します。</li>
		<li>ライセートをキット提供のコラムに移し、キットの指示に従います。直ちにステップ3.3に進むか、-20°C〜-80°Cで精製されたRNAを保存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>キットの指示に従って、cDNA合成キットを使用してcDNA合成に1 μgの総RNAを使用します。<ol>
<li>薄肉の0.2 mL PCRチューブを取り、5x cDNA反応マスターミックス(最適化されたバッファ、オリゴdTおよびランダムプライマー、およびdTPsを含む)の4μLにRNAの1μgを加え、20倍逆転写酵素溶液の1μL、およびヌクレアーゼを含まない水を20μLの総体積に加えます。</li>
		<li>チューブをプログラムしたサーモサイクラーに、22°Cで10分間、42°Cで30分間、85°Cで5分間、4°Cで保持します。 直ちにステップ3.4に進むか、-20°CでcDNAを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SYBRグリーン酵素マスターミックス、5倍希釈cDNA(ステップ3.3)、およびGFP用各プライマーの325 nMを含むqPCR反応を調製する。 注: このプロトコルで使用するプライマーは次のとおりです。GFPフォワード:5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3';GFP逆: 5'-GTCCTTTTGAAGTCGATGC-3';ef1aフォワード5'-カッグガカカキャットGCTGag-3';ef1a逆: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3')。</li>
	<li>リアルタイム PCR マシンで qPCR 反応を実行します。 注:PCRプログラム:最初の活性化は95°Cで10分、95°Cで30s、60°Cで30s、72°Cで1分の40サイクルが続きます。</li>
	<li>PCRが完了したら、溶融曲線解析を行い、反応特異性を決定します。各サンプルに対して 3 つの技術的な複製を実行します。</li>
	<li>光活性化誘導を、2-ΔΔCt 法11を用いて、暗に保たれた胚に対するフォールド変化として計算する。統計的有意性は、統計ソフトウェアパッケージで決定することができます。</li>
</ol>4. 蛍光顕微鏡による誘導の定性的評価
<ol><li>活性化の所望の持続時間の後に、照明から胚を除去する。</li>
	<li>ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。</li>
	<li>標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光体顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。すべてのサンプルに同一の画像取得設定を使用します。</li>
	<li>取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。</li>
</ol>

<ol><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL%3A+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).</li>
<li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAEL+2.0%3A+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li>
<li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li>
<li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).</li>
<li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Embryology%22%5BJournal%5D)">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li>
<li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).</li>
<li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738(2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).</li>
</ol>

利益相反は宣言されませんでした。

このプロトコルは、光遺伝学的TAEL/C120系を用い、青色光誘導性遺伝子発現を達成することを説明する。このシステムは、青色光で照明時に二量体化し、C120調節要素の下流の対象遺伝子の転写を活性化する転写活性化剤TAELで構成されています。GFPレポーターの誘導発現は、わずか30分の光暴露後に検出することができ、このアプローチは比較的速く応答性の高い動態を有することを示唆している。
いくつかの要因は、誘導レベルに影響を与えることができます。最も重要なのは、光を活性化する波長とパワーです。このプロトコルでは、1.5 W/cm2で配信される 465 nm の LED ライトが使用されました。短波長と長波長(それぞれ紫と緑の光)と低光パワーは、効果的に発現を活性化しません(データは示されていません)。一方、より多くの光パワーは、胚を光損なうリスクを高める。したがって、TAELシステムの使用を成功させるためには、活性化光は(1)可視光スペクトルの青色範囲で、(2)TAELの有効活性化と光損傷リスクの軽減のバランスを取るのに十分な電力でなければなりません。有効光パワーは...

誘導可能な遺伝子発現システムは、遺伝子発現量、タイミング、位置を制御するのに役立ちます。しかし、多細胞生物の空間的・時間的制御を正確に行うのも困難でした。時間制御は、最も一般的には、低分子化合物1 またはヒートショックプロモーター2の活性化を加えることによって達成される。それでも、どちらのアプローチもタイミング、誘導強度、およびオフターゲットのストレス応答の問題に対して脆弱です。空間制御は、主に組織特異的プロモーター3の使用によって達成されるが、このアプローチは、常に利用可能ではない適切なプロモーターまたは調節要素を必要とし、サブ組織レベルの誘導を助長しない。
このような従来のアプローチとは対照的に、光活性化光遺伝学的転写活性化剤は、遺伝子発現の空間的および時間的制御を細かくする可能性を有する。青色の光応答性TAEL/C120システムは、ゼブラフィッシュ胚5,6での使用に最適化された。このシステムは、細菌由来の細菌E.リソラリス7,8からの内因性光活性化転写因子に基づいている。TAEL/C120システムは、TAELと呼ばれる転写活性化剤で構成されており、これは、カル-TA4トランスアクティベートドメイン、青色光応答性LOV(光-酸素電圧センシング)ドメイン、およびらせん旋回らせん(HTH)DNA結合ドメイン5を含む。照射されると、LOVドメインは、2つのTAEL分子が二量体化し、TAEL応答性C120プロモーターに結合し、対象となる下流遺伝子の転写を開始することを可能にする立体構造変化を受ける5,8。TAEL/C120システムは、毒性を最小限に抑えた迅速かつ強い誘導を示し、いくつかの異なる光送達モダリティによって活性化することができます。最近、TAEL/C120系の改良は、核局在化シグナルをTAEL(TAEL-N)に加え、C120調節要素をcFos基底プロモーター(C120F)に結合させることによって行われた(図1A)。これらの改変は、誘導レベルを15倍以上6倍に改善した。
このプロトコルでは、TAEL/C120システムを活性化し、レポーター遺伝子GFPのユビキタス発現を誘導するために、シンプルなLEDパネルが使用されます。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いて転写レベルを測定することにより、蛍光強度を観察するか定量的に観察することにより、定性的にモニタリングすることができる。このプロトコルは 、In vivoでの遺伝子発現の堅牢な調節を可能にする、多目的で使いやすいツールとしてTAEL/C120システムを実証する。

<table><tbody><tr><td>BioRender ウェブベースの科学イラストレーションツール</td><td>BioRender</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://biorender.com/ カラー CCD デジタルカメラ</td><td>Lumenara</td><td>755-107</td><td></td></tr><tr><td>コンパクトパワーおよびエネルギーメーターコンソール、デジタル 4 インチ LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター、545 nm</td><td>オリンパス</td><td>ET545/25x</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini キット</td><td>GEヘルスケア</td><td>95017-491</td><td></td></tr><tr><td>インスタント オーシャン シー ソルト</td><td>インスタント オーシャン</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>MARS AQUA 調光可能 165 W LED アクアリウム ライト (青と白)</td> <td>アマゾン</td><td>B017GWDF7E</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7140</td><td></td></tr><tr><td>NEARPOW プログラマブル デジタル タイマー スイッチ</td><td>アマゾン</td><td>B01G6O28NA</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR グリーン ファスト ミックス</td><td>Quantabio</td><td>101414-286</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop画像処理ソフトウェア</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prismグラフ作成および統計ソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qScript XLT cDNA SuperMix</td><td>Quantabio</td><td>10142-786</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28137</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120 蛍光LED光源</td><td>エクセリタス</td><td>010-00326R</td><td>販売終了X-Cite mini+に置き換えられました</td></tr></tbody></table>

光遺伝学的tael/c120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導gfp発現

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

誘導可能な遺伝子発現系は、生物学的プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。光遺伝学的発現系は、誘導剤として光を用いた遺伝子発現タイミング、位置、振幅を精密に制御できる。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成するために光遺伝学的発現系が用いられる。このシステムは、細菌 E.リトオラリスからの自然発生する光活性化転写因子に基づいてTAELと呼ばれる設計された転写因子に依存する。青色光で照らされると、TAELは二量体化し、C120と呼ばれるその同結合調節要素に結合し、転写を活性化する。このプロトコルは、ユビキタス ubb プロモーターの制御下でTAEL転写因子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用する。同時に、C120調節エレメントは、蛍光レポーター遺伝子(GFP)の発現を駆動します。青色光を活性化するシンプルなLEDパネルを使用して、GFP発現の誘導は、最初に30分後の照明の後に検出することができ、3時間の光処理後に130倍以上の誘導のピークに達します。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)および蛍光顕微鏡法により評価することができます。この方法は、光遺伝学的遺伝子発現のための多目的かつ使いやすいアプローチです。

このデモンストレーションでは、C120応答性GFPレポーターライン(Tg(C120F:GFP)ucm107)がユビキチンb(ubb)プロモーター(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)からTAEL-Nをユビキタスに表現するトランスジェニックラインと交差し、両方の要素を含む二重トランスジェニック胚を生成しました。24時間受精後、胚を青色光を活性化させることに曝され、1時間オン/1時間オフの頻度でパルスした。GFP発現の誘導は、30分、1時間、3時間、および6時間の後活性化時のqRT-PCRにより定量した(図2Bおよび表1)。暗い状態に保たれた対照兄弟胚と比較して、青色光暴露後30分でGFP発現の誘導が検出された。GFP発現のレベルは、その後、着実に6時間の後の活性化まで増加し続けた。
GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した(...

光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

このプロトコルは、遺伝子発現をインタクトな生物に誘導するための光遺伝学的、または光活性化方法であるため、重要である。私たちの場合、ゼブラフィッシュ胚。この技術の利点は、誘導の非常に正確な、容量および時間的制御を可能にする誘導剤として、光を使用することである。このプロトコルは、誘導可能な遺伝子発現が有用であろうあらゆる状況に有用であろう。これには、系統トレース、機能獲得アッセイ、レスキュー実験などがあります。まず、一度にいくつかの胚に光の平方センチメートルの1.5ミリワットの電力を提供するための胚を含むペトリ皿に対するLEDパネルを位置付けます。テール転写アクティベーターの写真損傷のリスクを低減するには、タイマーリレーを使用して1時間のオンオフ間隔で光をポストします(3時間以上照らす場合)。ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。コントロール胚と暗いコントロールのための防明箱を含むペトリ皿を置きます。希望の活性化持続時間の後に、照明から胚を取り除きます。RNAの全抽出には、RNA抽出キットを使用してください。胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。リシスバッファーを追加した後、プラスチックの害虫で胚を均質化します。ライセートをキットに移し、メーカーの指示に従ってRNAを精製します。精製されたRNAを、マイナス20〜マイナス80°Cで保存し、1マイクログラムからcDNAを使用するか、またはすぐに合成するまで、cDNA合成キットを使用して全RNAを、製造業者の指示に従うことによって保管する。薄い壁に0.2ミリリットル、PCRチューブ、5回のcDNA反応マスターミックス、1マイクロリットルの添加、20倍の逆転写酵素酵素溶液の薄い壁にRNAの1マイクログラムを追加します。次に、ヌクレアーゼを含まない水で20マイクロリットルの最終容積を構成する。cDNA合成のためのプログラムされたサーモサイクラーにチューブを置きます。使用するか、またはすぐに定量的評価に使用するまで、合成されたcDNAをマイナス20°Cで保存します。サイバーグリーン酵素マスターミックスを含む定量PCR反応を設定します。325ナノモル濃度で325ナノモル濃度で5倍希釈されたcDNAおよびGFPプライマーは、プログラムされたリアルタイムPCRマシンで反応を行います。反応が完了したら、メルト曲線を分析して反応特異性を決定します。二重デルタCT法を用いて、コントロール胚に対するフォールド変化として光活性化誘導を計算する。そして、統計ソフトウェアを使用して有意性を判断します。照明から胚を除去した後、ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光ステレオ顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。GFP発現の定量化は、青色光暴露後30分で発現誘導を示した。GFP発現のレベルは、その後、着実に後活性化、6時間まで増加し続けました。GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した。バックグラウンドレベルを超えるGFP蛍光は、最初に活性化後3時間で観察され、6時間の後活性化で顕著に明るくなった。対照的に、すべての時間ポイントに対する対照胚は、暗所に保たれ、示さなかった、任意のかなりのGFP蛍光を示した。活性化光は可視光スペクトルの青色の範囲になければなりません。部屋の光と日光の両方に青色の光が含まれています。だから、任意の周囲の光源からあなたの負のコントロールを保護するために注意してください。TAEL C120システムは、遺伝的にコードされ、モジュラーであり、関心のある任意の遺伝子の発現を駆動することができる。したがって、他の技術と組み合わせることで、様々な生物学的な質問に答えるために使用することができます。

light-induced-gfp-expression-zebrafish-embryos-using-optogenetic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

多光子顕微鏡は深く、光浸透と低光毒性を持つ低エネルギーの光子の制御が可能になります。我々は、ゼブラフィッシュ胚における生細胞標識のためのこの技術の使用について説明します。このプロトコルは、容易に様々な光反応性分子の光誘導に適合させることができる。...

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

このビデオでは、遺伝子組み換え体性感覚ニューロンを活性化し、誘発された行動反応を高速ビデオカメラで記録する光遺伝学的手法について説明しています。...

ゼブラフィッシュのオプトジェネティクス:幼虫の行動反応を研究するための遺伝子組み換え体性感覚ニューロンの活性化

このビデオでは、トランスポゼースmRNAと蛍光電圧インジケーターをコードするTol2トランスポゾンコンストラクトを含むTol2トランスポゾンシステムを同時注入した後、蛍光電圧インジケータータンパク質を構成的に発現する安定したゼブラフィッシュトランスジェニックラインを生成する手順を示します。...

Tol2トランスポゾン媒介ゼブラフィッシュトランスジェネシス:受精ゼブラフィッシュ胚へのTol2系共注入後のトランスジェニックゼブラフィッシュ作製法

Optogenetic技術は、それが可能動作に固有ニューロンの寄与を研究するために作られました。我々は高速ビデオカメラを用いて行動を誘発したダイオード励起固体（DPSS）レーザーと記録とchannelrhodopsin変異体を発現する単一性感覚ニューロンを活性化させるための幼虫のゼブラフィッシュの方法（シェフ）を記述する。...

CHEF-tdTomatoを使用してゼブラフィッシュ体性感覚ニューロンのOptogeneticアクティベーション

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。...

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

前新生物細胞進行及び先天性免疫細胞相互作用の最も初期の事象を研究することは理解して癌を治療するために極めて重要である。ここでは、条件付きで上皮細胞の変換とHRAS G12Vは 、ゼブラフィッシュの幼虫に皮膚細胞を発現する、自然免疫細胞の相互作用のその後のライブイメージングを誘導する方法を説明します。...

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

我々は、ゼブラフィッシュをモデルとして用いた脊髄運動ニューロンにおける光によるTARDNA結合タンパク質43(TDP-43)の相転移を誘導するプロトコルを記述する。...

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄運動ニューロンにおけるTDP-43の光遺伝学的相転移

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。...

ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。...

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

学ぶ光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現法。LED照射による正確な時空間制御で遺伝子発現を誘導し、系譜追跡や機能獲得アッセイに応用可能な革新的な手法を解説します。

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

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