Name: 単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ単粒子クライオ電子顕微鏡の自動データ収集ソフトウェアLatitude-Sを用いたハイスループット手法。病原体関連の生物学的マクロ分子の構造解析に効率化をもたらし、低線量条件下での高分解能データ収集を実現する。

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我々は、バイオテクノロジー省、科学技術省(DST)、インドの人事開発省(MHRD)に対し、IISc-バンガロールの資金調達とクライオEM施設について認める。我々は、バンガロール州IIScのナショナルクライオEM施設に対するDBT-BUILDERプログラム(BT/INF/22/SP22844/2017)とDST-FIST(SR/FST/LSII-039/2015)を認めます。我々は、理工学研究委員会(SERB)(グラントNo.SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608およびSERB-IPA/2020/000094)、DBT(グラントNo.1)からの財政支援を認める。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)。クライオEMグリッド、クライオEMデータ収集、 材料表の準備をしてくれたイシカ・プラマニックさんに感謝します。また、スマン・ミシュラ氏のクライオEM画像処理と、フィギュアの準備を手伝ってくれたことに感謝します。ラガヴァン・バラダラジャン教授は、この研究のために精製スパイクタンパク質サンプルを入手するのを助けてくれたことに感謝します。

<ol><li>Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cryo-EM+enabled+by+user-free+preprocessing+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines.</a> Structure. 28 (7), 858-869 (2020).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryoEM+data+acquisition+and+analysis+of+284+742+particles+of+GroEL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL.</a> Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+in+electron+microscopy-30+years%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).</li>
<li>Biyani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus%3A+The+interface+between+data+collection+and+data+processing+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM.</a> Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detective+quantum+efficiency+of+electron+area+detectors+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy.</a> Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).</li>
<li>Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+Anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+Implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+High-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CisTEM%2C+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> eLife. 7, 35383(2018).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+with+a+Tecnai+12+electron+microscope%3A+Applications+for+molecular+imaging+by+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy.</a> Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).</li>
<li>Lei, J., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+acquisition+of+cryo-electron+micrographs+for+single+particle+reconstruction+on+an+FEI+Tecnai+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope.</a> Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+A+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+controlled+cryo-electron+microscopy+-+TOM2+a+software+package+for+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications.</a> Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).</li>
<li>Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Script-Assisted+Microscopy+%28SAM%29+package+to+improve+data+acquisition+rates+on+FEI+Tecnai+electron+microscopes+equipped+with+Gatan+CCD+cameras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras.</a> Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).</li>
<li>Marsh, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+software+platform+for+low-dose+electron+microscopy+and+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography.</a> Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JADAS%3A+A+customizable+automated+data+acquisition+system+and+its+application+to+ice-embedded+single+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles.</a> Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Pramanick, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+flexibility+and+structural+variability+of+SARS-CoV2+S+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein.</a> Structure. , (2021).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+neutralization+of+SARS-CoV-2+by+an+antibody+from+a+convalescent+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).</li>
<li>Hillen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+replicating+SARS-CoV-2+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase.</a> Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).</li>
<li>Wrapp, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+2019-nCoV+spike+in+the+prefusion+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.</a> Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).</li>
<li>Thoms, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+translational+shutdown+and+immune+evasion+by+the+Nsp1+protein+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2.</a> Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).</li>
<li>Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+approach+for+preparing+graphene+oxide+tem+grids+for+stained+and+vitrified+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules.</a> Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).</li>
</ol>

著者は、宣言する競合や財政的な利益相反はありません。

Latitude-S は直感的なユーザー インターフェイスで、2 日間で何千もの高解像度の顕微鏡写真やムービー ファイルを自動的にセットアップして収集する環境を提供します。それは格子を渡る容易な運行を提供し、顕微鏡段階の位置を維持し、低倍率から高倍率に移動する。Latitude-S によるデータ取得の各ステップは、シンプルなユーザー インターフェイス、最大 4.5 GB/秒の速度での高速データストリーミング、取得時のデータの同時表示などの機能を備えた時間効率が高くなります。さらに、事前調整された線量分画、線量率、焦点、倍率のパラメータを簡単に再ロードして、データ自動取得の新しいセッションを開始し、時間を節約しました。
常時監視が行われず、データ セットの品質を損なうことなく、データを自動的に取得することは、困難で時間のかかる作業です。緯度Sソフトウェアを使用した自動データ収集は、時間とリソースが大きな制約である場合、特にこのパンデミックの間に便利です。しかし、SARS-CoV-2の様々なタンパク質のいくつかのクライオEM構造は、製薬会社がワクチンを開発するのに役立つ、過去数ヶ月で解...

単粒子クライオEMは、生体高分子の高分解能構造決定のための主流の構造生物学技術となっています1。単粒子の再構築は、2次元(2D)粒子画像を抽出するために膨大な数のガラス化サンプルの顕微鏡写真を取得することに依存し、その後、生物学的高分子の3次元(3D)構造を再構築するために使用されます。DEDの開発前に、単粒子の再構成から達成された分解能は4から30Å4,5の範囲に及んだ。最近、単粒子クライオEMからの達成可能な解像度は1.8 Å6を超えています。DEDおよび自動データ収集ソフトウェアは、データ収集のための人間の介入が最小限に抑えられるこの解決革命7の主要な貢献者となっています。一般に、クライオEMイメージングは、低電子線量率(20-100 e/Å2)で行われ、生体試料の電子ビームによる放射線損傷を最小限に抑え、画像内の低信号対雑音比(SNR)に寄与します。この低いSNRは、単粒子分析を用いた生体高分子の高分解能構造の特性解析を妨げる。
新世代の電子検出器は、CMOS(相補的な金属酸化物半導体)ベースの検出器で、これらの低いSNR関連の障害を克服することができます。これらの直接検出CMOSカメラは、カメラが優れた点広がり機能、適切なSNR、および生体高分子のための優れた探偵量子効率(DQE)に寄与するため、信号の高速読み出しを可能にします。直接検出カメラは、記録された画像に高いSNR8と低ノイズを提供し、その結果、検出器が画像にどれだけのノイズを追加するかを測定する探偵量子効率(DQE)の定量的な増加をもたらします。これらのカメラは毎秒数百フレームの速度で映画を録画し、高速データ取得を可能にします 9,10.これらの特性はすべて、低線量のアプリケーションに適した高速直接検出カメラを作ります。
動補正スタック画像は、RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14、EMAN215などの様々なソフトウェアパッケージを使用して、2D分類を計算し、高分子の3D密度マップを再構築するためにデータ処理に使用されます。ただし、単一粒子解析では、高解像度の構造を実現するためには膨大なデータセットが必要です。したがって、自動データ取得の通行料は、データ収集に非常に重要です。大規模なクライオEMデータセットを記録するために、過去10年間にいくつかのソフトウェアパッケージが使用されてきました。AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS、EPUなどの専用ソフトウェアパッケージが自動データ取得用に開発されています。
これらのソフトウェアパッケージは、低倍率画像を高倍率画像に相関させることによって、自動的に穴位置を見つけるためにルーチンタスクを使用し、低線量条件下で画像取得のための割り当て氷の硝子体氷で穴を識別するのに役立ちます。これらのソフトウェアパッケージは、繰り返しのタスクの数を減らし、オペレータの物理的な存在を中断することなく、数日間連続して高品質のデータの膨大な量を取得することにより、クライオEMデータ収集のスループットを向上させます。Latitude-S は、単一粒子分析のための自動データ収集に使用される同様のソフトウェア パッケージです。しかし、このソフトウェアパッケージはK2/K3 DEDsにのみ適しており、これらの検出器を備えています。
このプロトコルは、200 keV cryo-EMを搭載した直接電子検出器を備えたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の自動画像取得におけるLatitude-Sの可能性を示しています( 材料表を参照)。このデータ収集ツールを使用して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の3,000のムービーファイルが自動的に取得され、さらにデータ処理が行われ、3.9-4.4Å分解能スパイクタンパク質構造を得ます。

<table><tbody><tr><td>あぶらとり紙</td><td>テッド・ペラ社</td><td>47000-100</td><td>EM試料作製品</td></tr><tr><td>カプセル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9432 909 97591</td><td>EM検体調製ユニット</td></tr><tr><td>カセット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1020863</td><td>EM検体調製ユニット</td></tr><tr><td>Cクリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1036171</td><td>EM検体作製品</td></tr><tr><td>Cクリップ挿入ツール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>9432 909 97571</td><td>EM試料作製ツール</td></tr><tr><td>Cクリップリング</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1036173</td><td>EM試料作製アイテム</td></tr><tr><td>EMグリッド(Quantifoil)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q3100AR1.3</td><td>R 1.2/1.3 300 メッシュ・ゴールド</td></tr><tr><td>グロー 放電機</td><td>Quorum</td><td>N/A</td><td>Quorum GlowQube グロー放電機</td></tr><tr><td>K2 DED</td><td>Gatan Inc.</td><td>N/A</td><td>クライオ電子顕微鏡データ収集装置(カメラ)</td></tr><tr><td>Latitude S Software</td><td>Gatan Inc.</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>ローディングステーション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1130698</td><td>EM試料調製ユニット</td></tr><tr><td>タロス 200 kV 北極圏</td><td>サーモサイエンティフィック&トレード;</td><td>N/A</td><td>クライオ電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td>EM試料作製ユニット</td></tr></tbody></table>

単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy

過去数年間、単粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の技術と方法論的進歩は、生物学的高分子の高解像度構造決定のための新しい道を開きました。クライオEMの著しい進歩にもかかわらず、単粒子分析ワークフローの様々な側面において改善の余地が依然として存在する。単粒子分析では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージが必要です。過去8年間に単粒子クライオEM用の自動イメージング用に、いくつかの自動データ取得ソフトウェアパッケージが開発されました。本論文は、低用量条件下でのガラス化生体分子に対する完全自動画像取得パイプラインの適用を提示する。 
これは、cryo-EMデータを完全、自動的、および正確に収集できるソフトウェアパッケージを示しています。さらに、さまざまな顕微鏡パラメータは、このソフトウェアパッケージによって容易に制御されます。このプロトコルは、直接電子検出器(DED)を搭載した200 keVクライオ電子顕微鏡を用いた重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイクタンパク質の自動イメージングにおけるこのソフトウェアパッケージの可能性を示しています。1回のセッション(48時間)で約3,000枚のクライオEMムービー画像を取得し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の原子分解能構造を生み出しました。さらに、この構造研究は、スパイクタンパク質が開いた1-RBD(受容体結合ドメイン)およびすべてのRBD閉鎖された立体構造の2つの主要な立体構造を採用することを示している。

現在のパンデミック状況では、CRYO-EMはSARS-CoV-226-226,27,28,29の様々なタンパク質の構造を特徴づける上で重要な役割を果たしており、ウイルスに対するワクチンや薬剤の開発に役立つ可能性があります。2019年のコロナウイルス病に対抗するために、限られた人材を持つ迅速な研究努力が急務です。単粒子クライオEMでのデータ取得は、高分子の構造決定において時間がかかりますが、重要なステップです。クライオEM自動データ取得の最近の発展は、データ収集における限られた人間の干渉を可能にしました。Latitude-S ソフトウェアは、精製された SARS-CoV2 スパイクタンパク質の自動データ収集にここで使用される重要な自動データ取得ソフトウェア パッケージです。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質のクライオEMデー...

単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。

In the past several years, technological and methodological advancements in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) have paved a new avenue for ...

自動データ収集ソフトウェアは、生物学的高分子の構造特性を得るための膨大な量のクライオデータを収集するために非常に必要です。ここでは、自動データ取得ソフトウェアパッケージを使用して、病原体生物学に直接関連する様々な生体高分子の構造を特徴付けます。例えば、マイコバクテリウム、HIVおよびSASCO 2。まず、スタートメニューからDigitalMicrographをクリックして、Latitude-S自動データ収集ソフトウェアを起動します。次に、テクニック マネージャを選択し、単一パーティクル自動データ収集の Latitude-S アイコンを選択します。前のセッション設定に基づいてセッションを作成するには、パレットの前のセッションチェックボックスをオンにして、新しいボタンを選択するか、既存のセッションを続行するには、続行ボタンを押します。まったく新しいセッションを開始するには、パレットの新しいタブをクリックします。継続するセッションを含むフォルダを選択し、データを保存するフォルダを選択します。次に、設定アイコンをクリックし、表示される管理状態の探索ボックスで、状態を追加し、TEM 条件、カメラの状態、および画像またはストック オプションを設定します。状態に名前を付けるか、状態設定の概要を開いて保存設定を開きます。次に、アトラス状態パレットをクリックしてアトラス状態を設定し、拡大率、照明条件、カメラ露出時間のパラメータを設定し、[次の状態に移動する]をクリックします。次に、グリッド状態パレットをクリックしてグリッド状態を設定し、顕微鏡イメージング光学、照明条件、カメラ露出時間のパラメータを設定し、[次へ]をクリックします。穴パレットをクリックして穴の状態を設定し、イメージング光学、照明条件、ビニング、カメラ露出時間パラメータを設定します。次にクリックした後、フォーカスパレットをクリックして次のフォーカス状態を設定し、光学、照明条件、ビニング、カメラ露出時間の顕微鏡設定を行います。次に、穴の近くのアモルファスカーボン領域に焦点を合わせ、次の状態に移動するために次をクリックします。データパレットをクリックしてデータ状態を設定し、顕微鏡設定のパラメータを設定してから、[次へ]をクリックします。フォーカス解除値の範囲と指定したタブのステップサイズを指定してフォーカス構成パレットをクリックし、次のボタンを押して次のステップに進みます。グリッド上の必要な機能に焦点を当てて、キャプチャ ボタンをクリックします。次に、異なる状態の各画像上の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。視野がアトラスおよびグリッドの状態よりも大きいため、フォーカス、データ、ホールの状態から開始します。次に、アトラスとグリッドの状態を拡大して、同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。5 つの異なる状態の間の位置とオフセットを計算し、出力ウィンドウに位置とオフセットを反映するには、計算ボタンをクリックします。キャプチャ パレットをクリックし、要件に基づいてグリッド全体またはグリッドの一部をカバーする Atlas のサイズを選択します。アトラスをキャプチャするには、アトラス上を移動し、氷の厚さに基づいてグリッドの正方形を選択します。目的のグリッド四角形を選択したら、スケジュール ボタンをクリックし、グリッドの正方形がキャプチャされるごとに、グリッドの正方形のタイルがいっぱいに表示されます。集計ボタンをクリックしたら、穴の位置を追加して、グリッドの正方形の代表穴を選択します。穴のイメージが取得されたら、データとフォーカス位置を定義し、テンプレートとしてレイアウトを保存します。自動検索をクリックし、穴のサイズを入力し、自動的に直径に基づいて穴を見つけるためにプログラムで検索ボタンをクリックします。グリッドの正方形と氷の汚染から穴を除去するために強度を設定します。そして、自動検索を介して選択され、黄色のマークツールを追加した後、緯度タスクのスケジュールボタンをクリックします。cisTEMソフトウェアを用いたマイクログラフを修正したモーションの初期手動スクリーニングに従って、データのほとんどは所望の信号範囲内にあることが判明した。また、デフォーカス範囲で収集された画像も、cisTEMによって手動でチェックした。スパイク粒子は手動で選択して構造ビジュアライゼーションの 2D クラス平均を計算しましたが、これは強く示唆されましたが、それぞれのデータセットを使用して高解像度の構造特性を考え出しました。3D分類は、スパイクタンパク質が開いた確認で1RBDを有し、ダウンクローズ確認で他のすべてのRBDを有することを示した。スパイクタンパク質の1RBDアップオープン確認は、C1対称性を用いて再構築された。スパイクタンパク質マップは、側面の上と下のビューで表されます。そして、EMマップは、サイドチェーンのより良い視覚化のための原子構造が取り付けられています。RBDダウンクローズ確認は、C3対称性と、図のように原子構造を取り付けたスパイク3D精製モデルとEMマップで洗練されました。S2サブドメインとして同定されたスパイクタンパク質の中間確認とは、個々のアミノ酸残基の側鎖を示した。その結果、Latitude-Sは生体高分子の高解像度クライオEMデータを収集できることが示唆された。この自動データ収集ソフトウェアは、データを自動的に収集するために、他の電子顕微鏡システムに使用することができます。

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単粒子クライオ電子顕微鏡用のユーザーフレンドリー、ハイスループット、および完全自動データ収集ソフトウェア

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