Name: 結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶ マクロファージ内Mycobacterium tuberculosisの自動液体培養システムを用いた増殖定量法。FDA承認薬の宿主向け治療薬への再定位スクリーニングを効率化し、結核研究の労力と時間を削減する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、アイルランド科学財団(SFI 08 / RFP / BMT1689)、アイルランドの健康研究委員会[HRA-POR/2012/4およびHRA-POR-2015-1145]およびダブリン王立病院トラストによって資金提供されました。

このプロトコルで概説されている実験は、封じ込めレベル2の実験室で処理できるMtbの弱毒化H37Ra株を使用して実施されました。生きたマイコバクテリアのすべての操作は、クラスII生物学的安全キャビネット(BSC)で行われました。実験手順は、エアロゾルの発生を最小限に抑えるように設計されました。真核細胞培養(THP-1細胞)もクラスII BSCで行った。研究所はリスク評価を実施し、すべての手順が制度的および国の生物学的安全規制に沿って実施されていることを確認しました。ヒト単球性THP-1細胞株を、記載された方法を実行するために使用した(ステップ1)。細胞は、マイコバクテリアに感染する前に、ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA)による刺激後にマクロファージに分化します。
1. 細胞培養
<ol><li>H37Raシードストックを、アルブミン-デキストロース-カタラーゼ(ADC)濃縮(10%)および0.05%ポリソルベート80を添加したミドルブルック7H9(MB)ブロスでログフェーズに増殖させます。H37Raストックを1 mLアリコートに入れて-80°Cの冷凍庫に最長1年間保管します。</li>
	<li>Mtb-H37Raの1 mLバイアルを解凍し、計画された実験の約1週間前に、9 mLのMB添加ブロスを含むフィルターキャップ付きのT25フラスコに移します。静的インキュベーター内で37°Cで5〜7日間インキュベートします。</li>
	<li>非加熱死体10%ウシ胎児血清(完全(c)RPMI)を添加したRPMI-1640でTHP-1細胞を、5%CO2/37°CのCO2加湿インキュベーター内のT75フラスコ内で増殖させ、継代培養を週に2回、1 x 106細胞/mL未満の密度を維持します。</li>
	<li>感染の3日前に、T75フラスコ内の血清学的ピペットを使用して細胞を数回穏やかにピペッティングし、塊を分散させ、50 mLのコニカルチューブに入れて、THP-1細胞をマクロファージに分化させます。</li>
	<li>細胞を室温で300 x g で10分間遠心分離し、上清をデカントオフし、ペレットを2 mLのRPMIに静かに再懸濁します。細胞数を実行して細胞/mLを推定します。</li>
	<li>2 mLのTHP-1マクロファージを12ウェル組織培養プレートに100,000細胞/mLの密度でcRPMI溶液に100 ng/mL PMAで72時間播種します。細胞からPMA含有培地を除去し、Mtb感染前に新鮮なcRPMIを補充します。</li>
	<li>必要な時点ごとに個別のプレートを設定します。</li>
	<li>2ウェルガラスチャンバースライドに同じ密度(100,000細胞/mL)の細胞を播種し、感染多重度(MOI)を測定します。</li>
	<li>5%CO2 加湿インキュベーターに37°Cで3日間入れます。</li>
</ol>2. Mtb取り込み量の定量化
<ol><li>マクロファージによるMtb取り込み量(MOI)の測定
	<ol><li>感染当日にクラスII生物学的安全キャビネット(BSC)を設置し、こぼれたものをキャッチするために2層のティッシュペーパーで作業します。地域の規制に従って廃棄物廃棄コンテナを設定します。</li>
		<li>T25フラスコから6〜8 mLのマイコバクテリア培養物を取り出し、15 mLのポリプロピレンチューブに移します。 注:より小さな実験には、より小さな体積のチューブを使用できます。</li>
		<li>ベンチトップ遠心分離機でチューブを室温で2890 x gで10分間遠心分離します。</li>
		<li>チューブを遠心分離機から慎重に取り外し、生物学的安全キャビネットに移します。バクテリアが落ち着くまで1分待ちます。<ol><li>上清を消毒剤廃棄容器、リキャップチューブに注ぎ、チューブの側面を軽くたたいて残りの培地に細菌を再懸濁します。バクテリアが落ち着くまで1分待ちます。</li>
		</ol></li>
		<li>2 mLの予熱したcRPMIを加え、穏やかに混合し、50 mLのコニカルチューブに移します。</li>
		<li>25 Gの針と5 mLの注射器を使用して、マイコバクテリアを非常に注意深く再懸濁します。.再懸濁するには、マイコバクテリア懸濁液をシリンジに引き込み、エアロゾルの生成を最小限に抑えるためにチューブの側壁を非常に穏やかに排出します。6〜8回繰り返します。 注:これはマイコバクテリアの高密度培養であるため、細心の注意を払ってください。針刺しによる怪我のリスクを回避するために、可能な限り鈍い針を使用し、ルアーロックシリンジを使用してください。</li>
		<li>針とシリンジをBSCの鋭利な容器に廃棄します。</li>
		<li>懸濁液を2 mLマイクロフュージチューブ(ねじ込み式キャップ付き)に移し、室温で100 x g で3分間遠心分離して、残りの塊をペレット化します。チューブを安全キャビネットに戻し、バクテリアが落ち着くまで1分間待ちます。</li>
		<li>上清の上部1〜1.5 mLを新しいチューブに移します。消毒剤の入った廃液バケツに元のチューブを廃棄します。よく混合し、さまざまな量のマイコバクテリア懸濁液(5、25、50、150μLなど)を2ウェルガラスチャンバースライドに加え、37°CのCO2 インキュベーターで3時間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>抗速菌(AFB)の染色 注:3時間のインキュベーション後、マクロファージを洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定してマイコバクテリアを不活性化します。次に、修飾オーラミンOキット( 材料の表を参照)を使用してスライドを染色し、細胞あたりのマイコバクテリアの食作用を推定します。それらのワックス状の細胞壁のために、マイコバクテリアは酸 - アルコール洗浄後にオーラミン染料を保持する。次に、マクロファージ核をヘキストで対比染色します。この方法は、細胞あたりの食作用細菌の数をカウントすることを可能にし、マクロファージの感染多重度(MOI)を決定するために使用されます。<ol><li>上下に3回ピペッティングした後、ガラスチャンバースライドから培地を取り除き、食作用していない細菌を取り除きます。</li>
		<li>2 mLの室温PBSで1回洗浄します。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒドのストックを、PBSにアリコートで溶解し、-20°Cで最大6か月間保管します。使用直前に4%パラホルムアルデヒドのアリコートを解凍してください。.PBSで2%パラホルムアルデヒドに希釈し、ウェルあたり2 mLを加えます。</li>
		<li>室温で10分間インキュベートします。ガラスチャンバースライドは、この段階で安全キャビネットから取り外して染色することができます。</li>
		<li>穏やかな水道水でスライドを洗います。</li>
		<li>プラスチック製トランスファーピペットを使用して細胞を覆うのに十分なオーラミンをスライドに分注し、暗所で室温で1分間インキュベートします(アルミホイルで覆います)。</li>
		<li>スライドから余分な染料を水道水で洗い流し、暗所で脱色剤/クエンチャーを1分間加えます。</li>
		<li>余分なものを水道水で洗い流し、暗所でヘキスト33342(10 μg/mL PBS溶液)を使用して室温で15分間インキュベートします。</li>
		<li>水道水でヘキストの汚れを洗い流し、チャンバーを取り外し、スライドから余分な水を排出し、退色防止とカバーガラスを一滴加え、風乾します。</li>
		<li>100倍のオイル対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下でスライドを調べます。マイコバクテリアはFITCフィルターの下で緑色に蛍光を発します。核はDAPIフィルターの下で青色に蛍光を発します(図1C)。</li>
		<li>細胞あたりの食作用されたマイコバクテリアの数と感染した細胞の割合を数えることによってMOIを決定します。</li>
		<li>プレート内のウェルの表面積に基づいて、必要なMOIを達成するために必要なマイコバクテリア懸濁液の量を計算します。例えば、本実験で用いたガラスチャンバースライドの表面積は4cm2である。低MOI(約1〜2バチル/細胞)は、数日間(例えば、5日間)にわたって実施される実験には望ましい。</li>
	</ol></li>
	<li>マクロファージの感染
	<ol><li>マイコバクテリア懸濁液をよく混合し、目的のMOIを達成するために必要な量が決定されたら、12ウェルプレート上の細胞に必要な量を追加します。</li>
		<li>37°Cで3時間インキュベートして、マイコバクテリアを貪食させます。</li>
		<li>温かいRPMIまたはHBSSのいずれかでウェルを数回洗浄することにより、細胞外細菌を除去します。</li>
		<li>1つのウェル(3時間サンプル)でマクロファージを溶解し、以下のステップ3で概説するように、最初の接種材料(3時間サンプル)の陽性までの時間(TTP)の割合を決定します。</li>
		<li>新鮮なcRPMIと必要な薬物用量またはビヒクルコントロールを残りのウェルに加え、CO2 インキュベーター内のプレートを37°Cで必要な時間インキュベートします(実験デザインによって異なりますが、通常は1〜8日間のいくつかの間隔で)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 液体培養検出システム用サンプル採取
注:感染当日、細胞外抗酸菌を洗浄により除去し、マクロファージの1ウェル(3時間サンプル)を溶解して細胞内抗酸菌を回収し、感染のベースラインコントロールとして貪食された初期量を決定します。その後、培地、細胞溶解液、および洗浄液の両方を組み合わせて、マイコバクテリアの総増殖を測定します。細胞外および細胞内増殖も、必要に応じて別々に評価することができる。
<ol><li>TTPを決定するための3時間サンプルの収穫
	<ol><li>ステップ2.3.3で概説されているように、感染の最初の3時間後にすべてのウェルから細胞外マイコバクテリアを洗い流します。1 mLの新鮮な培地を3時間コントロールウェルに追加して、ライセート量を後の時点のものと均等にします。 注:細胞外マイコバクテリアを分析から除外する場合は、ステップ3.2.7を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプル収集
	<ol><li>MBブロスと器具培養ボトルを温めて室温にします。</li>
		<li>培地を12ウェルプレートから対応するラベル付きコニカルチューブに移します。</li>
		<li>500 μLの滅菌溶解バッファー(滅菌0.2 μmフィルターでろ過したPBS中の0.1%Triton x-100)を各ウェルに10分間加えます。</li>
		<li>滅菌スクレーパーでウェルから細胞を静かにこすり落とし、適切な円錐形チューブ内の培地と混ぜ合わせます。</li>
		<li>ウェルを0.5 mLの滅菌PBSで洗浄し、適切なチューブに移します。</li>
		<li>各サンプルを針とシリンジ(25 G)に6〜8回静かに通して、塊を砕きます。サンプルをMBブロスで1:10に希釈します。100 μL サンプル + 900 μL MB 培地。</li>
		<li>必要な時間/日(通常は1〜8日)で、上記の手順3.2.1〜3.2.6に従って残りのサンプルを収集します。 注:研究者は、細胞外マイコバクテリアを分析から除外することを好む場合があり、その場合、上記のステップ3.2.2では、各ウェルからの培地を廃棄し、マクロファージを数回洗浄してから溶解バッファーを追加します。</li>
	</ol></li>
	<li>器具培養ボトルの接種と装填 注意: 液体培養装置および関連する消耗品の詳細は、 材料の表に記載されています。<ol><li>器具培養瓶のゴムキャップを70%アルコールに浸したティッシュペーパーで滅菌し、風乾させます。 注: この手順は BSC で実行する必要があります。</li>
		<li>すべてのサンプルに十分な栄養補助食品を円錐形のチューブ(0.5 mL /ボトル)に移してボトルを準備します。針と注射器を使用して、0.5 mLの栄養補助食品を機器培養ボトルに注入します。</li>
		<li>希釈したサンプル500 μL(1:10)を1 mLのV底チューブにピペットで入れます。</li>
		<li>針とシリンジを使用して、500 μLのサンプルを割り当てられた機器培養ボトルに注入します。</li>
		<li>器具培養瓶のゴムキャップを70%アルコールに浸したティッシュペーパーで滅菌し、風乾させます。BSCから取り出す前に、70%アルコールに浸したティッシュペーパーでボトルを拭いてください。</li>
		<li>ボトルをバイオセーフティキャビネットから機器に慎重に輸送して積み込みます。</li>
		<li>自動微生物検出システムのローディングボタンを押します。</li>
		<li>機器培養ボトルのバーコードをスキャンし、ボトルを37°Cの検出システムインキュベーターに最大42日間入れます。機器の画面から陽性に達するのにかかった時間を読んで記録します。 注意: バーコードを使用すると、機器はボトルを識別し、反射率の読み取り値を特定のボトルにリンクできます。</li>
		<li>最初の細胞内接種源(0日目)のTTPを、指定された時間培養されたマクロファージのTTPと比較することにより、陽性になるまでの時間(TTP)を計算します。TTP率の正の変化は、マイコバクテリアの増殖を意味します13。 たとえば、3 日目の場合: 陽性になるまでの時間の変化率= <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62838/62838eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Tuberculosis+Report%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global Tuberculosis Report.</a> World Health Organization. , Geneva. (2020).</li>
<li>Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+the+intimate+discourse+of+a+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and the intimate discourse of a chronic infection.</a> Immunological Reviews. 240 (1), 252-268 (2011).</li>
<li>Young, C., Walzl, G., Du Plessis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+host-directed+strategies+to+improve+outcome+in+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic host-directed strategies to improve outcome in tuberculosis.</a> Mucosal Immunology. 13 (2), 190-204 (2020).</li>
<li>Angeby, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+BacT%2FALERT+3D+system+for+recovery+and+drug+susceptibility+testing+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the BacT/ALERT 3D system for recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clinical Microbiology and Infection. 9 (11), 1148-1152 (2003).</li>
<li>Asmar, S., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+culture-based+diagnosis+of+pulmonary+tuberculosis+in+developed+and+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid culture-based diagnosis of pulmonary tuberculosis in developed and developing countries.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 1184(2015).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+liquid+culture+positivity+can+substitute+for+colony+counting+on+agar+plates+in+early+bactericidal+activity+studies+of+antituberculosis+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Time to liquid culture positivity can substitute for colony counting on agar plates in early bactericidal activity studies of antituberculosis agents.</a> Clinical Microbiology and Infection. 18 (7), 711-717 (2012).</li>
<li>Diacon, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+positivity+in+liquid+culture+predicts+colony+forming+unit+counts+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+sputum+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Time to positivity in liquid culture predicts colony forming unit counts of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens.</a> Tuberculosis. 94 (2), Edinburgh. 148-151 (2014).</li>
<li>O'Sullivan, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+liquid+culture+for+quantitation+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of liquid culture for quantitation of Mycobacterium tuberculosis in murine models.</a> Vaccine. 25 (49), 8203-8205 (2007).</li>
<li>Heinrichs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Strains+H37ra+and+H37rv+have+equivalent+minimum+inhibitory+concentrations+to+most+antituberculosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Strains H37ra and H37rv have equivalent minimum inhibitory concentrations to most antituberculosis drugs.</a> International Journal of Mycobacteriology. 7 (2), 156-161 (2018).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (1), 640-645 (2016).</li>
<li>O'Leary, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+impairs+human+pulmonary+immunity+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking impairs human pulmonary immunity to Mycobacterium tuberculosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (12), 1430-1436 (2014).</li>
<li>Ryan, R. C., O'Sullivan, M. P., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+infection+induces+non-apoptotic+cell+death+of+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis infection induces non-apoptotic cell death of human dendritic cells.</a> BMC Microbiology. 11, 237(2011).</li>
<li>Keane, J., Remold, H. G., Kornfeld, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulent+mycobacterium+tuberculosis+strains+evade+apoptosis+of+infected+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Virulent mycobacterium tuberculosis strains evade apoptosis of infected alveolar macrophages.</a> The Journal of Immunology. 164 (4), 2016-2020 (2000).</li>
<li>Gao, X. F., Yang, Z. W., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjunctive+therapy+with+interferon-gamma+for+the+treatment+of+pulmonary+tuberculosis%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adjunctive therapy with interferon-gamma for the treatment of pulmonary tuberculosis: a systematic review.</a> International Journal of Infectious Diseases. 15 (9), 594-600 (2011).</li>
<li>Thorpe, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BacT%2FAlert%3A+an+automated+colorimetric+microbial+detection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system.</a> Journal of Clinical Microbiology. 28 (7), 1608-1612 (1990).</li>
<li>Gleeson, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Mycobacterium+tuberculosis+induces+aerobic+glycolysis+in+human+alveolar+macrophages+that+is+required+for+control+of+intracellular+bacillary+replication%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication.</a> The Journal of Immunology. 196 (6), 2444-2449 (2016).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microparticles+encapsulating+all-trans-Retinoic+acid+%28ATRA%29+as+a+host-directed%2C+adjunctive+treatment+for+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Inhalable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles encapsulating all-trans-Retinoic acid (ATRA) as a host-directed, adjunctive treatment for Mycobacterium tuberculosis infection.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 134, 153-165 (2019).</li>
<li>O'Connor, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharpening+nature%27s+tools+for+efficient+tuberculosis+control%3A+A+review+of+the+potential+role+and+development+of+host-directed+therapies+and+strategies+for+targeted+respiratory+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sharpening nature's tools for efficient tuberculosis control: A review of the potential role and development of host-directed therapies and strategies for targeted respiratory delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 102, 33-54 (2016).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Ortalo-Magne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+outermost+capsular+material+of+the+tubercle+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus.</a> Microbiology. 141, Reading. Pt 7 1609-1620 (1995).</li>
<li>Stokes, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glycan-rich+outer+layer+of+the+cell+wall+of+Mycobacterium+tuberculosis+acts+as+an+antiphagocytic+capsule+limiting+the+association+of+the+bacterium+with+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The glycan-rich outer layer of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis acts as an antiphagocytic capsule limiting the association of the bacterium with macrophages.</a> Infection and Immunity. 72 (10), 5676-5686 (2004).</li>
<li>O'Sullivan, M. P., O'Leary, S., Kelly, D. M., Keane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-independent+pathway+mediates+macrophage+cell+death+in+response+to+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1984-1993 (2007).</li>
<li>Cheon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 901-907 (2002).</li>
<li>Nathan, C., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TB+drug+development%3A+immunology+at+the+table%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">TB drug development: immunology at the table.</a> Immunological Reviews. 264 (1), 308-318 (2015).</li>
<li>Bowness, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+Mycobacterium+tuberculosis+MGIT+time+to+positivity+and+cfu+in+sputum+samples+demonstrates+changing+bacterial+phenotypes+potentially+reflecting+the+impact+of+chemotherapy+on+critical+sub-populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The relationship between Mycobacterium tuberculosis MGIT time to positivity and cfu in sputum samples demonstrates changing bacterial phenotypes potentially reflecting the impact of chemotherapy on critical sub-populations.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (2), 448-455 (2015).</li>
<li>Basu Roy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auto-luminescent+fluorescent+BCG+whole+blood+assay+to+enable+evaluation+of+paediatric+mycobacterial+responses+using+minimal+blood+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">An auto-luminescent fluorescent BCG whole blood assay to enable evaluation of paediatric mycobacterial responses using minimal blood volumes.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 151(2019).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), 1000645(2009).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 92 (6), Edinburgh. 453-488 (2012).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

著者らは、このプロトコルに記載されている液体培養法を使用して、単球由来のマクロファージと肺胞マクロファージ、およびPMA11、16、17で分化したTHP-1細胞のMtb増殖を監視しました。この技術は、非接着性細胞12と共に使用するために改変することもできる。最近では、この装置は、TB17のHDTとして吸入されたオールトランスレチノイン酸(AtRA)を評価するための前臨床試験でも使用されました。プロトコルの重要なステップには、(1)薬物前処理による食作用差などの要因を軽減し、より低いMOIで起こりにくい細胞死を最小限に抑えるために、AFB染色によるMtbの取り込みを制御すること、(2)MOIに応じて、アッセイのダイナミックレンジを最大化するために細胞ライセートを希釈する必要がある場合があります。約5〜12日のTTPを目指すと、再現性のある結果が得られました。<...

結核の原因物質である結核菌(Mtb)は、2019年に世界で最も重要な感染症キラーでした1。宿主防御を回避するために、Mtbはマクロファージや樹状細胞(DC)などの自然免疫細胞のマイコバクテリア活性を覆し、細胞内で持続して複製できるようにします2。成人の肺結核を予防するための効果的なワクチンの欠如と薬剤耐性株の出現の増加は、新しい治療法の緊急の必要性を浮き彫りにしています。
補助的な宿主指向療法(HDT)は、治療時間を短縮し、耐性を克服するのに役立つ可能性があります3。マクロファージ内のマイコバクテリア活性を決定するためのHDT候補のin vitroでの前臨床評価は、多くの場合、固体寒天プレート上のコロニー形成ユニット(CFU)によるMtb増殖の定量に依存しています。これは、薬物の迅速なスクリーニングには適さない、遅く、労働集約的なアッセイです。市販の自動ブロスベースの微生物検出システムは、臨床微生物学ラボで、臨床検体中のMtbおよびその他のマイコバクテリア種の検出および薬剤感受性試験に一般的に使用されています4。これらの機器は、培養培地の物理的変化(CO2またはO2レベルまたは圧力の変化)をもたらす細菌代謝活性に基づいて間接的に増殖を測定し、経時的に監視する5。測定値は陽性になるまでの時間(TPP)であり、これは治療に反応した結核患者の喀痰標本6,7および感染したマウス肺および脾臓の溶解物8のMtb CFUと相関することが以前に示されています。さらに、液体培養検出システムは、アクセニック培養および培養マクロファージにおけるマイコバクテリアの増殖に対する従来の病原体指向療法の効果を測定するために使用されてきた9,10。この装置は、樹状細胞および肺胞マクロファージがMtb11,12の細胞内増殖を制御する生来の能力を調べるためにも使用されています。この実験プロトコルは、液体培養診断システムが、培養マクロファージにおける結核に対するHDTの前臨床スクリーニングを実行するように適合できることを示しています。CFU列挙と比較して、この技術の主な利点は、細胞内マイコバクテリアの増殖/生存を定量化するために必要な実験労力と時間を大幅に削減できることです。この技術は、宿主の免疫を高めるために細胞機能を標的とする幅広い薬理学的試薬で処理された免疫細胞における細胞内マイコバクテリアの生存を評価するために使用できる自動培養装置へのアクセスに依存しています。

<table><tbody><tr><td>IX51 蛍光顕微鏡</td><td>Olympus, Japan</td><td>N/A</td><td>AFB detection and imaging</td></tr><tr><td>2 mL microtube, flat bottom, screw cap, sterile</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>72.694.006</td><td>Mtb infection of macropahges</td></tr><tr><td>5 mL syringe, Luer lock</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>SZR-150-031K</td><td>Mtb infection of macropahges/CFU</td></tr><tr><td>50 mL tube, sterile</td><td>Sarstedt, Northカロライナ州、米国</td><td>62.547.254</td><td>マクロパスの全</td></tr><tr><td>トランスレチノイン酸(ATRA)のMtb感染&ge;98% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>R2625</td><td>Host directed therapy candidate</td></tr><tr><td>BacT/ALERT 3D Microbial Detection System</td><td>Biomerieux ( ハンプシャー, UK)</td><td>247001</td><td>ブロスベースの比色検出システム</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP&nbsp;BACT/ALERT MP Nutrient Supplement</td><td>Biomerieux ( ハンプシャー州、英国)</td><td>414997</td><td>ブロスベースの比色検出アッセイ</td></tr><tr><td>BACT/ALERT MP培養ボトル</td><td>Biomerieux ( ハンプシャー州、英国)</td><td>419744</td><td>ブロスベースの比色検出アッセイ</td></tr><tr><td>BD BBL Middlebrook ADC Enrichment, 20 mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0553</td><td>マイコバクテリウム液体培養</td></tr><tr><td>BD BBL ミドルブルック OADC エンリッチメント,20mL</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0678</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Cell scraper, 25 cm</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>83.1830</td><td>Harvest of lmacrophage lysates</td></tr><tr><td>Corning Syringe Filter, 0.2 & micro;m</td><td>Corning Incorporated, Germany</td><td>431219</td><td>Sterilization of lysis</td></tr> buffer <tr><td>カバーガラス(ホウケイ酸), 24 x 50 mm, #1.5 thickness</td><td>VWR International Limited</td><td>631 - 0147</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide, from microbial</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>C7698</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Dako Fluorescent Mounting Medium</td><td>Agilent Technologies Ireland Limited</td><td>S3023</td><td>Antifade埋込媒体</td></tr><tr><td>Dulbecco'S Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>D8537</td><td>Mtb infection of macropahges</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>10270106</td><td>Macrophage cell culture</td></tr><tr><td>Glycerol, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>228220</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Hoescht 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>B2261</td><td>核染色</td></tr><tr><td>IFN&γ;, 組換えヒト</td><td>R&D Systems Inc, Minnesota, USA</td><td>285-IF</td><td>Host directed therapy candidate</td></tr><tr><td>Labtek 2-well chamber slide, sterile, Nunc</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>TKT-210-150R</td><td>Mtb infection of macropahges</td></tr><tr><td>L-Asparagine, anhydrous</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>A4159</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Linezolid</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>PZ0014</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>Microlance Hypodermic Needle 25 G</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>300400</td><td>Mtb infection of macropahges/CFU</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0303</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Broth Base</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>M0178</td><td>マイコバクテリウム液体培養</td></tr><tr><td>修飾オーラミン O 染色剤および脱色剤</td><td>Scientific Device Laboratory, IL, USA</td><td>345-250</td><td>AFB stain</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>158127</td><td>Mtb infection of macropahges</td></tr><tr><td>Petri dishes, 92 x 16mm (20/bag)</td><td>Sarstedt, North Carolina, USA</td><td>82.1473.001</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma Aldrich, Missouri, USA</td><td>P8139</td><td>マクロファージ細胞培養</td></tr><tr><td>Polysorbate 80, Difco</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>231181</td><td>Mycobacterium liquid culture</td></tr><tr><td>RPMI-1640, Gibco</td><td>Thermo Fisher, Massachusetts, USA</td><td>52400025</td><td>Macrophage cell culture</td></tr><tr><td>Sterile Cell Spreader, L-Shaped</td><td>Fisherbrand, Thermo Fisher, MA, USA</td><td>RB-44103</td><td>Colony Forming Units</td></tr><tr><td>T25 TC フラスコ、アングルネック、フィルターキャップ、滅菌、Nunc</td><td>Thermo Fisher、米国マサチューセッツ</td>州 <td>156367</td><td>Mycobacterium liquid culture</td></tr><tr><td>THP-1 cell line ATCC</td><td>, Virginia, USA</td><td>ATCC TIB-202</td><td>Macrophage cell culture</td></tr></tbody></table>

結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

結核(TB)の原因物質である結核菌(Mtb)は、COVID-19の出現まで、世界で最も重要な感染症のキラーでした。Mtbは、細胞内環境で持続し、宿主防御を回避し、多くの抗結核薬に対する耐性を発達させるように進化してきました。耐性を解決するための1つのアプローチは、Mtbに対する宿主の免疫応答を高める既存の承認薬を特定することです。これらの薬剤は、治療時間を短縮し、抗生物質耐性を克服するのに役立つ補助的な宿主指向性療法(HDT)として再利用することができます。
マクロファージにおける細胞内Mtb増殖の定量化は、潜在的なHDTを評価する上で重要な側面です。Mtbの成長を測定するためのゴールドスタンダードは、寒天プレート上のコロニー形成単位(CFU)をカウントすることです。これは、薬物の迅速なスクリーニングには適さない、遅く、労働集約的なアッセイです。このプロトコルでは、臨床検体中のMtbを検出するためにより一般的に使用される自動化されたブロスベースの培養システムが、宿主向け療法の前臨床スクリーニングに適合しています。HDTで処理したマクロファージにおける細胞内Mtb増殖を調べるための液体培養アッセイシステムの能力を評価した。Mtbの成長を阻害する能力についてテストされたHDTは、溶液中およびポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA)微粒子にカプセル化されたオールトランスレチノイン酸(AtRA)、およびインターフェロンガンマとリネゾリドの組み合わせでした。CFU法に対するこの自動液体培養ベースの技術の利点には、セットアップの単純さ、労働集約的な準備の軽減、および結果までの時間の短縮が含まれます(寒天プレートの21日以上と比較して5〜12日)。

この研究で使用された自動液体培養装置は、10分ごとにCO2 レベルを監視します。計器ボトルの下部にあるセンサーの色の変化は比色で測定され、反射率単位で表されます。次に、機器ソフトウェアは検出アルゴリズムを適用して、陽性になるまでの時間(TTP)、つまり接種から培養物が陽性としてフラグが立てられるまでの日数を計算します(図1A)。初期接種材料におけるTTPとlog10CFU(寒天プレート法で決定)12 の逆の関係を 図1Bに示します。薬理学的阻害剤の存在下または非存在下で1-2から5-10の範囲のMOIで感染したマクロファージ内のMtb増殖(図1C)を、記載の自動培養法または固体寒天上のコロニーの列挙によって比較したところ、両方の方法で得られた結果の間に有意な相関があった(図1D)。Mtbの成長をグラフで表示する...

結核菌の細胞内増殖を迅速かつ効率的に定量することは 、結核( TB)に対する改善された治療法を追求するために不可欠です。このプロトコルは、候補宿主指向療法で処理されたマクロファージのMtb増殖を定量するための自動液体培養システムを使用したブロスベースの比色検出アッセイについて説明しています。

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

このプロトコルの主な利点は、結核菌の細胞内増殖を推定するためにコロニー形成単位をカウントする従来の方法よりも労働集約的で時間がかからないことです。この技術により、研究者は、結核を治療するための宿主主導療法として再利用することを目的として、FDA承認薬を迅速にスクリーニングすることが容易になります。方法は非常にシンプルで簡単です。マイコバクテリアおよびEOキャリアT細胞培養技術に関する基本的な知識は、プロトコルを段階的に従うのに十分です。はじめに、6〜8ミリリットルの弱毒化マイコバクテリア培養物H37RaをT25フラスコから15ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。ベンチトップ遠心分離機でチューブを遠心分離します。チューブを慎重に取り外した後、チューブを生物学的安全キャビネットに移し、細菌が定着するまで1分間待ちます。上清を消毒剤廃棄容器に注ぎます。次に、チューブをキャップし、チューブの側面を軽くたたいて残りの培地に細菌を懸濁させ、細菌を1分間沈降させます。2ミリリットルの予熱した完全なRPMIを加えて混合し、50ミリリットルの円錐形のチューブに移します。マイコバクテリアを再懸濁するには、25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器に懸濁液を吸い込みます。次に、エアロゾルの生成を最小限に抑えるためにチューブの側壁を非常に穏やかに排出し、このプロセスを6〜8回繰り返します。針とシリンジは、バイオセーフティキャビネット内の鋭利な容器に廃棄してください。懸濁液を2ミリリットルの微量遠心チューブに移し、遠心分離機で残りの塊をペレット化します。チューブを安全キャビネットに戻し、バクテリアを1分間沈降させます。上清の上部1〜1.5ミリリットルを新しいチューブに移します。消毒剤が入っている廃棄物バケツの元のチューブを廃棄します。よく混合し、2つのウェルガラスチャンバースライドに様々な量のマイコバクテリア懸濁液を加え、そして37°Cで3時間スライドをインキュベートする。非食作用細菌を除去するために上下に3回ピペッティングした後、ガラスチャンバースライドから培地を取り出します。2ミリリットルのPBSで1回洗浄します。マイナス20°Cで保存したPBS中の4%PFAのアリコートを解凍します。アリコートを2%PFAに希釈し、各ウェルに2ミリリットルを加えます。室温で10分間インキュベートした後、染色のために安全キャビネットからスライドを取り外します。PFA化学廃棄物容器にPFAを廃棄し、穏やかな水道水でスライドを洗います。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、スライド上の細胞を覆うのに十分なオーラミンを分注し、暗所で室温で1分間スライドをインキュベートします。スライドから余分な染料を水道水で洗い流し、暗所で1分間クエンチャーを加えます。余分なクエンチャーを洗い流した後、暗所でヘキスト染色を加えて室温で15分間インキュベートします。その後、ヘキストの汚れを洗い流します。そして余分な水を排出した後、一滴の退色防止とカバースリップを追加します。100倍オイル対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下で風乾スライドを調べます。マイコバクテリアはフィッツフィルター下で緑色に蛍光を発し、核はDAPIフィルター下で青色に蛍光を発します。細胞あたりの貪食されたマイコバクテリアの数と感染細胞の割合を数えて、MOIを決定します。プレート内のウェルの表面積に基づいて、必要なMOIを達成するために必要なマイコバクテリア懸濁液の量を計算します。マイコバクテリア懸濁液を混合した後、計算された体積を12ウェルプレート上の細胞に加えて、所望のMOIを達成する。プレートを摂氏37度で3時間インキュベートして、マイコバクテリアを食作用させます。次に、ウェルを温かいRPMIで数回洗浄して細胞外細菌を取り除きます。500マイクロリットルの溶解バッファーを10分間添加して、3時間サンプルの1ウェルでマクロファージを溶解し、ライセートを収集してベースライン感染率を決定します。次に、新鮮な完全なRPMIと必要な薬物用量、またはビヒクルコントロールを残りのウェルに追加します。実験デザインに応じて、二酸化炭素インキュベーター内のプレートを摂氏37度で1〜8日間インキュベートします。3時間サンプルの初期接種材料の陽性になるまでの時間(TTP)の百分率を決定するために、ミドルブルックブロスおよび器具培養ボトルを室温に温めた。培地を12ウェルプレートから対応する標識コニカルチューブに移し、各ウェルに500マイクロリットルの滅菌溶解バッファーを加えます。10分後、滅菌スクレーパーでウェルから細胞を静かにこすり落とし、適切な円錐管内の培地と混ぜ合わせます。ウェルを0.5ミリリットルの滅菌PBSで洗浄し、培地およびライセートと合わせたら、各サンプルを25ゲージのニードルシリンジに6〜8回静かに通して塊を破ります。100マイクロリットルのサンプルに900マイクロリットルのMBブロスを加えてサンプルをMBブロスで希釈し、インキュベーション中の必要な時点で回収プロセスを繰り返します。インストルメント クラスター ボトルを準備し、ゴム製キャップを 70% アルコールで滅菌します。すべてのサンプルに十分な栄養補助食品を円錐形のチューブに移し、針と注射器を使用して0.5ミリリットルの栄養補助食品を器具培養ボトルに注入します。次いで、1ミリリットルのv底チューブに10分の1希釈サンプルの500マイクロリットルをピペットで入れる。針とシリンジを使用して、500マイクロリットルのサンプルを割り当てられた機器培養ボトルに注入します。ボトルをバイオセーフティキャビネットから機器に慎重に輸送して積み込んだ後、自動微生物検出システムの「積み込み」ボタンを押します。機器培養ボトルのバーコードをスキャンし、ボトルを摂氏37度で検出システムインキュベーターに最大42日間入れます。機器の画面から陽性に達するのにかかった時間を読み取って記録し、TTPの割合を計算します。陽性のTTPはマイコバクテリアの増殖を示します。自動液体培養装置は、10分ごとに二酸化炭素レベルを監視し、接種から培養物が陽性としてフラグが立てられるまでの日数であるTTPを計算しました。TTPと初期接種材料におけるCFUのlog(10)値との逆の関係を示した。CFUを列挙して測定したマクロファージ内の結核菌群の細胞内増殖を、記載の自動培養法と比較したところ、結果との間に有意な相関が得られた。結核菌の増殖は、マクロファージの感染後最大8日間のTTB値を初期TTP値と比較することによりグラフで提示した。CFUと液体培養の間の同様の傾向は、溶液中のオールトランスレチノイン酸(AtRA)の存在下で、またはPLGA微粒子にカプセル化されたAtRAの等量の存在下で、マクロファージにおける結核菌の増殖の有意な阻害を示しました。抗生物質リネゾリド単独、またはリネゾリドとインターフェロンガンマの組み合わせの有効性を決定するために、感染したTHP-1細胞で用量反応実験を行った。薬物間に有意な相互作用は観察されなかった。AFP染色により、低MOIを使用してマクロファージに感染する際の細胞死を最小限に抑え、使用する処理に関係なく同じMOIを確実に使用できます。このプロトコルに従って、鉛抗結核薬を特定し、さらに研究して、in vivoの有効性を調査することができます。

an-automated-culture-system-for-use-preclinical-testing-host-directed

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

結核菌の抗菌薬感受性試験は厳しいが、患者のケアのための非常に重要です。このマイクロタイタープレートフォーマットは、12抗マイコバクテリア薬のテストを提供し、適切な治療に役立つだろう最小発育阻止濃度（MIC）値を、提供します。...

マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

特定の条件下で培養すると結核菌は、薬剤耐性バイオフィルムを形成します。ここでは、培養M.ための方法を説明結核のバイオフィルムと薬剤耐性の永続化の頻度を決定する。これらのプロトコルは、M.の薬剤耐性のメカニズムにさらなる研究のために有用であろう結核...

の成長結核バイオフィルム

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in...

結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核...

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。...

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

次世代の抗結核薬の初期の医薬品開発プロセスを改善する新しいモデルとアッセイが非常に望ましいです。ここでは、結核菌に対する薬効を評価するための迅速で安価なBSL-2適合アッセイについてご説明します。このアッセイは、ハイスループットスクリーニングに容易に適応できます。...

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

コロニー形成単位(CFU)の測定は、目に見えるコロニーを形成するのに数週間かかる結 核菌...

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

この研究では、最近作成されたダブルレポーター株を用いた マイコバクテリウム・アブセッサス...

マイコバクテリアに対するハイスループット薬物スクリーニングのためのアッセイ開発

ここでは、細菌が分泌するタンパク質からなる細菌増殖培地である Mtb 培養濾液(CF)の調製を実演します。 Mtb...

結核病因理解のための 結核菌 培養濾液の調製

ここでは、4-アミノキノリン化合物の化学合成、結核菌に対する最小阻害濃度の決定、哺乳類細胞株における細胞毒性の評価を含む表現型スクリーニングを通じて潜在的な抗結核薬候補を特定するプロトコルを提示します。...

潜在的な抗結核候補の同定:哺乳類細胞における合成、MIC決定、細胞傷害評価のステップバイステップガイド

ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌...

初期血管内感染中のマウス肺における減弱型自生 性結核菌 のインバイタルイメージング

学ぶ マクロファージ内Mycobacterium tuberculosisの自動液体培養システムを用いた増殖定量法。FDA承認薬の宿主向け治療薬への再定位スクリーニングを効率化し、結核研究の労力と時間を削減する。

結核の宿主向け治療の前臨床試験に使用する自動培養システム

さらに動画を探す