Name: CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学ぶCD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の検出法。細胞死経路とアポトーシスネットワークの動的解析に応用可能な実験ワークフローを解説します。

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我々は、ウィルヘルム・サンダー財団(2017.008.02)、EUプログラムERDF(欧州地域開発基金)、DFG(LA 2386)が資金を提供するダイナミックシステムセンター(CDS)が当社の活動を支援することを認めます。私たちの実験を支援してくれたカリーナ・グテクに感謝します。私たちは、私たちに原発性T細胞を提供したダーク・クラインホルド教授(OvGU、マクデブルク)を認めます。

T細胞実験は、倫理協定42502-2-1273 Uni MDに従って行った。
1. 実験用の細胞の準備
注: この免疫沈降の平均細胞数は 1 × 107です。 被着細胞は実験の日に107 個の細胞×されるように、実験の1日前に播種する必要があります。
<ol><li>実験用の接着細胞の準備<ol>
<li>種子5〜8×、実験開始の前日に14.5cmの皿の各条件について、培地20mL(組成用材料表を参照)で106個の付着細胞を10個含みます。</li>
		<li>実験の日に、細胞が80-90%コンフルエントであり、皿に付着していることを確認してください。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験用の懸濁液細胞の準備<ol>
<li>実験開始直前に14.5cmの皿に10mLの培養培地(組成用材料表を参照)に1個の×を慎重に配置します。</li>
		<li>プライマリセルを使用する場合は、前述の手順21に従ってプライマリT細胞を単離する。1 μg/mL フィトヘマグルチニンを 24 時間、続いて 25 U/mL IL2 処理を 6 日間治療します。</li>
		<li>実験開始直前に14.5cmの皿の条件ごとに1×108原T細胞を10mLの培養培地に入れてください(組成の材料表を参照)。 注: これらのセルは小さいため、このより多くのプライマリ T セルをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD95L刺激
<ol><li>CD95L(20または市販の(材料表を参照)で細胞を刺激する。 注意: CD95Lの濃度と刺激時間は細胞タイプ依存13、15、22、23、24、25です。1つの刺激条件を2回準備して、ビーズコントロールサンプルを並列に生成します。<ol>
<li>選択したCD95L濃度で接着細胞を刺激します。プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペットします。</li>
		<li>リガンド溶液を細胞懸濁液にピペット化して、CD95Lで細胞の懸濁を刺激します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞の収穫とリシス
<ol><li>氷の上にセル皿を置きます。 メモ:メディアを破棄しないでください。死にかけている細胞は培地に浮かび、分析にとって重要です。</li>
	<li>10 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を細胞懸濁液に加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50 mLチューブにセル懸濁液を回収します。</li>
	<li>冷たいPBSの10 mLでセル皿を2回洗い、洗浄液を同じ50mLチューブに入れます。500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。</li>
	<li>上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を1.5mLチューブに移します。</li>
	<li>500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、冷たいPBSの1 mLで細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>500×gで細胞懸濁液を5分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、細胞ペレットを1mLのリシスバッファー(4%プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で再懸濁します。氷の上で30分間インキュベートします。</li>
	<li>最大速度(約17,000×g)で15分間、4°Cの間、最大速度でリゼートを遠心分離します。</li>
	<li>清浄なチューブに上清(lysate)を移します。ペレットを捨てます。別のチューブに50μLのライセートを取ります。ブラッドフォードアッセイでタンパク質濃度を分析し、バイアル中のタンパク質25μgに相当するリゼートの量を取ります。バイアルにロードバッファ( コンポジションの材料表 を参照)を追加します。-20 °Cで、ライセートコントロールとして保管してください。</li>
</ol>4. 免疫沈降(IP)
<ol><li>2 μLの抗 APO-1 抗体と 10 μL のプロテイン A セファローズビーズ (メーカーが推奨するように調製) をライセートに加えます。ビーズの10 μLのみを、リセート(刺激されたサンプル)を含む別のチューブに加えることで、「ビーズコントロール」を生成します。 注:タンパク質Aセファローズビーズを扱いながら、チップをカットするか、IPのための特別なヒントを購入することによって、広いオリフィスでピペットのヒントを使用してください。</li>
	<li>4°Cで一晩穏やかな混合と抗体/タンパク質Aセファロースビーズとのリゼートの混合物をインキュベート。 500 ×g の抗体/プロテインAセファローズビーズを用いたリゼートを4分間、4°Cで遠心分離する。 上清を捨て、1mLの冷たいPBSをビーズに加え、このステップを少なくとも3回繰り返します。</li>
	<li>上清を捨てます。50 μL のハミルトンシリンジを使用してビーズを吸引することが好ましい。</li>
</ol>5. ウェスタンブロット
<ol><li>ビーズに20 μLの4倍のローディングバッファ(組成 用材料表 を参照)を加え、95°Cで10分間加熱します。95°Cで5分間、ライセートコントロールを加熱します。</li>
	<li>12.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲル(ゲル調製のための 材料表 を参照)に、ライセート、IP、およびタンパク質標準をロードし、80 Vの一定電圧で動作します。</li>
	<li>SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移す。 注:ここでは、対象のタンパク質に最適化された半乾燥技術を、12分(25V;2.5 A=定数)以上の移動に使用しました。ニトロセルロース膜と2つのミニサイズの転写スタックを電気泳動バッファーに浸し(構成用 の材料表 を参照し、メーカーの指示に従って準備してください)、ウェスタンブロッティングの前に数分間浸します。</li>
	<li>ブロット膜を箱に入れ、ブロッキング溶液(PBS(PBS(PBS)+5%ミルクで0.1%Tween-20)で1時間ブロックします。穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液で膜をインキュベート.</li>
	<li>膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。</li>
</ol>6. ウェスタンブロット検出
<ol><li>示された希釈液に最初の一次抗体を加え( 材料表を参照)、穏やかな攪拌で4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。</li>
	<li>20 mLの二次抗体(PBST+5%乳で希釈)を室温で1時間穏やかに振って膜をインキュベートします。</li>
	<li>膜をPBSTで3回洗浄し、洗浄を5分間行います。</li>
	<li>PBSTを廃棄し、約1mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ基材を膜に加えます。</li>
	<li>化学発光シグナルを検出します( 材料表を参照)。 注:露光時間と撮影画像の数は、細胞内のタンパク質の量と使用される抗体の特異性によって異なります。検出に使用する抗体ごとに経験的に確立する必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD95%2FFas+signaling+at+the+DISC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li>
<li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+and+death+in+peripheral+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li>
<li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li>
<li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms%2C+caspase-8%2Fa+and+caspase-8%2Fb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li>
<li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD%3ACaspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex%3A+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li>
<li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+%5B2%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li>
<li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8%2C+p30%2C+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li>
<li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling%3A+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li>
<li>Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+%28c-FLIPs%29%3A+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li>
<li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-FLIPR%2C+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li>
<li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8%3A+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li>
<li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li>
<li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li>
<li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li>
<li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8%2Fc-FLIPL+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li>
<li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li>
<li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li>
<li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC%3A+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li>
<li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CD95+threshold+signaling%3A+Triggering+of+CD95+%28FAS%2FAPO-1%29+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li>
<li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li>
<li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).</li>
<li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity-dependent+APO-1+%28Fas%2FCD95%29-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+%28DISC%29+with+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li>
<li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis%3A+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li>
<li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23(2014).</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

このアプローチは、Kischkelら27 によって最初に記述され、それ以来いくつかのグループによって開発されました。この複合体における効率的なDISC-免疫沈降およびモニタリングカスパーゼ-8処理に関しては、いくつかの重要な問題を考慮する必要があります。
まず、免疫沈降の間に全ての洗浄工程に従う必要があります。特に重要なのは、セファロースビーズの最終洗浄工程とセファロースビーズの乾燥です。これは、免疫沈降のシグナル/ノイズ比を高めるために正しく行われ、DISCでカスパーゼ-8の採用と処理を検出することを可能にする必要があります。しかし、いくつかの研究は、この事前清算ステップは、ウェスタンブロッティング7、23によるDISCへのカスパーゼ-8募集の検出には不可欠ではないことを示している。しかしながら、前述のように、免疫沈降の終わりにビーズの洗浄は信頼できる結果を得るために不可欠である。豊富な細胞タンパク質のセファロースビ...

最もよく研究された死の受容体(DR)の1つはCD95(Fas、APO-1)である。外因性アポトーシス経路は、DRと同結合リガンドとの相互作用から始まり、CD95LはTRAIL-Rsに結合するCD95またはTRAILと相互作用する。この結果、対応するDR. DISC での DISC の形成は、CD95、 FADD、 プロカスラーゼ-8/-10、および c-FLIP タンパク質1,2からなる 。さらに、DISCは、CD95やFADDなどの死ドメイン(DD)含有タンパク質、およびFADD、プロカスパス-8/-10、およびc-FLIPなどのDED含有タンパク質との相互作用によって組み立てられる(図1)。Procaspase-8は、そのDEの関連付けを介してオリゴマー化を行い、その結果、DEDフィラメントの形成、続いてプロカスパス8の活性化および処理を行う。これは、カスパーゼカスケードをトリガーし、細胞死(図1)3、4につながる。従って、プロカスパス症−8は、CD95またはTRAIL−Rsによって媒介される外因性アポトーシス経路の中心イニシエーターカスパーゼであり、対応する高分子プラットフォームDISCで活性化される。
プロカスパスゼ-8の2つのアイソフォーム、すなわちプロカスパス-8a(p55)および-8b(p53)は、DISC5に採用することが知られている。両方のアイソフォームは、2つのDEを含む。DED1およびDED2は、触媒p18およびp10ドメインが続く、プロアスパス症-8a/bのN末端部分に位置する。プロアスパス症-8DEの詳細なクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)分析は、プロサスパス8タンパク質のDEDフィラメント4,6と呼ばれる糸状構造への組み立てを明らかにした。驚くべきことに、リニアプロアスパス8鎖は、最初は二量体化に従事し、続いてDISCでプロスパパス8活性化に従事することが示唆された。さて、これらの鎖は、プロカスパス-8DEDフィラメントの一部構造に過ぎず、後者は三重らせん3、4、6、7に組み立てられた3つの鎖を含むことが知られている。
DEDフィラメントでの二量体化の際、プロカスパス8a/bの立体構造変化は、プロアスパス-8の活性中心の形成と、その活性化3、8を導く。これに続いて、2つの経路を介して媒介されるprocaspase-8処理が続きます:最初のものはp43 / p41切断産物の生成を介して行き、2番目のものはp30切断産物の初期生成を介して行きます。p43/p41経路はAsp374でのプロスパパス-8a/bの切断によって開始され、p43/p41およびp12切断産物を生じる(図2)。また、これらの断片は、Asp384およびAsp210/216で自動触媒的に切断され、活性カスパーゼ-8ヘテロトラマーの形成を生じさせる、p10 2/p1829、10、11。また、p43/p41処理経路と並行して、プロカスパス-8a/bもAsp216で切断され、C末端切断生成物p30の形成につながり、続いてp10およびp1810に対するタンパク質分解が行われることが示された(図2)。
DEDフィラメントにおけるプロカスパス症-8a/b活性化はc-FLIP12というタンパク質によって厳密に調節される。c-FLIPタンパク質は、c-FLIPLong (c-FLIP L)、c-フリップショート(c-FLIPS)、c-FLIPラジ(c-FLIPR)の3つのアイソフォームで発生します。3 つのアイソフォームはいずれも、N 端子領域に 2 つの DE を含んでいます。c-FLIPLはまたC末端触媒的に不活性なカスパーゼ様ドメイン12、13を有する。c-FLIP-c-FLIPSとc-FLIPRの両方の短いアイソフォーム-DISC6、14、15でDEDフィラメント形成を妨害することによって抗アポトーシス的な方法で作用する。さらに、c-FLIPLは濃度依存的な方法でカスパーゼ-8の活性化を調節することができる。これは、プロと抗アポトーシス効果16、17、18の両方をもたらすことができます。触媒活性プロアスパスを形成することによって-8/c-FLIPLヘテロダイマー、c-FLIPLは、プロアスパス8の活性中心の安定化とその活性化をもたらす。c-FLIPLのプロまたは抗アポトーシス関数は、DEDフィラメントにおけるその量および後に組み立てられたプロスパパス症-8/c-FLIPLヘテロダイマー19の量に直接依存する。DISCでのC-FLIPLの低濃度または中間濃度は、カスパーゼ-8の活性化をサポートするDEDフィラメントで十分な量のプロスパパス酵素-8/c-FLIPLヘテロ二量体をもたらす。対照的に、c-FLIPLの増加量は、直接DISC20でその抗アポトーシス効果につながります。
まとめると、DISCでのprocaspase-8a/bの活性化と処理は、いくつかのステップを伴う高度に規制されたプロセスです。本論文では、DISCにおけるプロカスパス8処理の測定と、この複合体の組成の分析について議論する。これは、例示的なDR複合体としてCD95 DISCを使用して提示されます。

<table><tbody><tr><td>12.5% SDS ゲル</td><td>セルフ メイド</td><td></td><td>2 つの分離ゲル用: 3.28 mL 蒸留 H2O 2.5 mL トリス; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL アクリルアミド 100 &micro;L 10% SDS 100 & マイクロ;L 10% APS 7.5 & マイクロ;L TEMED 2 つの収集ゲル用: 3.1 mL 蒸留 H2O 1.25 mL Tris;pH 6.8;1.5 M 0.5 mL アクリルアミド 50 &micro;L 10% SDS 25 & マイクロ;L 10% APS 7.5 & マイクロ;L TEMED</td></tr><tr><td>14.5 cmの細胞皿</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>のアクリルアミド</td><td>のカールRoth</td><td>A124.1</td><td></td></tr><tr><td>のエーロゾル フィルター高い回復フィルターおよび広いオリフィス</td><td>VWR</td><td>46620-664 (北アメリカ)または732-0559 (ヨーロッパ)</td><td>にピペットで餌を分けるために使用されて ライセート</td></tr><tr><td>の反アクチンAb</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2103</td>の希釈へのビーズをピペッティングするために使用<td>:PBSTの1:4000 + 1:100 NaN3</これらの</td></tr><tr><td>実験でP.クラマー教授によって提供されたsub</td>><td>anti-APO-1 Ab</td>、または免疫<td>沈降にのみ使用される</td>Enzo <td>ALX-805-038-C100</td>によって購入可能</tr><tr><td>抗カスパーゼ-10 Ab</td><td>Biozol</td><td>MBL-M059-3</td><td>希釈:PBSTで1:1000 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>-anti-caspase-3 Ab</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9662 S</td><td>希釈:PBSTで1:2000 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>これらの実験でP.Krammer教授によって提供された</td><td>抗カスパーゼ-8 Ab C15</td>、またはENZO <td>ALX-804-242-C100</td>で購入可能 <td>希釈率:PBSTで1:20 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anti-CD95 Ab</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-715</td><td>希釈:PBSTで1:2000 + 1:100 NaN3</sub</td></tr><tr><td>>anti-c-FLIP NF6 Ab</td><td>P.Krammer教授によってこれらの実験で提供され、またはENZO</td><td>ALX-804-961-0100</td><td>で購入できます希釈:PBSTで1:10 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anti-FADD 1C4 Ab</td>は、<td>これらの実験でP.Krammer教授によって提供されたか、ENZO</td><td>ADI-AAM-212-E</td>で購入できます <td>希釈:PBSTで1:10 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>anti-PARP Ab</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9542</td><td>希釈:PBSTで1:1000 + 1:100 NaN3</td></tr><tr><td>APS</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>カール・ロス</td><td>4227.2</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード solution タンパク質アッセイ 染料試薬濃縮物 450ml</td><td>バイオ ラッド</td><td>500-0006</td><td>メーカーの指示に従って使用</td></tr><tr><td>CD95L</td> P<td>. Krammer教授によるこれらの実験で提供された、またはENZO</td><td>ALX-522-020-C005</td><td></td></tr><tr><td>化学発光検出器 Chem Doc XRS+</td><td>Bio Rad によって購入できます。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11 836 145 001</td><td>製造元の指示に従って調製</td></tr><tr><td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>希釈 1:10、H2O で希釈、冷蔵庫での保管</td></tr> 栄養<tr><td>相</td>バッファー <td>自作</td><td></td><td>10倍電気泳動バッファー: 60.6 g Tris 288 g グリシン 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 希釈前</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>カール・ロス</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG1 HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-05</td><td>希釈率 1:10.000 in PBST + 5%</td></tr><tr><td>ミルク ヤギ抗マウス IgG2b HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-05</td><td>希釈率 1:10.000 inPBST + 5% ミルク</td></tr><tr><td>ヤギ アンチウサギ IgG-HRP</td><td>SouthernBiotech</td><td>4030-05</td><td>希釈 1:10.000 PBST + 5% ミルク</td></tr><tr><td>インターロイキン-2 ヒト (hIL-2)</td><td>メルクグループ/ロシュ</td><td>11011456001</td><td>T 細胞の活性化</td></tr><tr><td>KCl</td><td>カール ロス</td><td>6781.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>カール ロス</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>ローディングバッファー 4x Laemmli サンプルバッファー、10 mL</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td>メーカーの指示に従って調製</td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP 基質</td><td>Millipore</td><td>WBLUFO500</td><td></td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td>自作</td><td></td><td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 960 mL H2</td></tr>O <tr><td>軟体細胞用培地 DMEM F12 (1:1) w 安定型グルタミン、&nbsp; 2,438 g/L</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41154</td><td>10% FCS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、0.0001% ピュロマイシン</td></tr>を<tr><td>初代 T 細胞用培地</td>に添加 <td>gibco by Life Technologie</td><td>21875034</td><td>10% FCS と 1% ペニシリン-ストレプトマイシンを中</td></tr><tr><td>程度粉乳</td><td>Carl Roth</td><td>T145.4</td><td></td></tr> <tr><td>に添加Na2HPO4</td><td>Carl Roth</td><td>P030.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td>自作</td><td></td><td>20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O 希釈 使用前 1:20</td></tr><tr><td>前 PBST + 5%</td><td>牛乳自作</td><td></td><td>50 g 粉乳 + 1 L PBST</td></tr><tr><td>PHA</td><td>T 細胞活性化のための</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R30852801</td></tr><tr><td>Power Pac HC</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td><td>Bio Rad</td><td>161-0373</td><td>3-5 とマイクロの間で使用。L</td></tr><tr><td>プロテインAセファロース CL-4B ビーズ</td><td>Novodirect/ Th.Geyer</td><td>GE 17-0780-01</td><td>アフィニティー樹脂ビーズ メーカーの指示に従って調製</td></tr><tr><td>スクレーパー</td><td>VWR</td><td>734-2602</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>カールロス</td><td>4360.2</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>ハイドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>カールロス</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>Trans Blot Turbo ミニサイズトランスファースタック</td><td>Bio Rad</td><td>170-4270</td><td>メーカーの指示に従って使用</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo 5x トランスファーバッファー</td><td>Bio Rad</td><td>10026938</td><td>メーカーの指示に従って調製</td></tr><tr><td>TransBlot Turbo ミニサイズニクロセルロースメンブレン</td><td>Bio Rad</td><td>170-4270</td><td>メーカーの指示に従って使用</td></tr><tr><td>Trans-Blot-Turbo</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Chem Solute</td><td>8,08,51,000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Pan Reac Appli Chem</td><td>A4974,1000</td><td></td></tr></tbody></table>

cd95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

外因性アポトーシスは、CD95/Fas/APO-1または腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体1/受容体2(TRAIL-R1/R2)などの死受容体(DR)の活性化によって媒介される。これらの受容体を同一性リガンドで刺激すると、死を誘発するシグナル伝達複合体(DISC)の組み立てにつながる。DISCはDR、アダプタータンパク質Fas関連タンパク質と死ドメイン(FADD)、プロサスアーゼ-8/-10、および細胞FADD様インターロイキン(IL)-1β変換酵素阻害タンパク質(c-FLIP)を含む。DISCは、プロカスパス8の処理とアクティベーションのプラットフォームとして機能します。後者 は、DISC で組み立てられたデスエフェクタードメイン(DED)フィラメントにおける二量体化/オリゴマー化によって生じる。 
procaspase-8 の活性化は、その処理が続いて、いくつかのステップで発生します。本研究では、この複合体におけるDISC形成およびプロアスパス8の処理を測定することを可能にする確立された実験ワークフローについて説明する。このワークフローは、ウェスタンブロット分析でサポートされている免疫沈降技術に基づいています。このワークフローは、DISCとその処理に対するprocaspase-8採用の異なるステップを注意深く監視することを可能にし、外因性アポトーシスの分子メカニズムを調査するために非常に関連性が高い。

本論文では、CD95 DISCにおけるDISCへのカスパーゼ-8の採用と処理を分析するために、CD95 DISCのIPとウェスタンブロット分析を組み合わせた古典的なワークフローについて説明する。これにより、CASPASE-8活性化の複数の主要な機能をDISCで検出できます:カスパーゼ-8活性化高分子プラットフォームの組み立て、PROCASAS-8のDISCへの採用、およびこのイニシエーターカスパーゼの処理(図1 および 図2)。このワークフローは、時間依存的な方法でCD95Lを有する感受性細胞の治療を含み、その後、それらのリシス、抗CD95(抗APO-1)抗体を用いた免疫沈降、およびそれに続くウェスタンブロット分析(図3)を用いた。
子宮頸癌HeLa-CD95細胞をDISC形成26を解析する例として用いた。CD95Lによるこれらの細胞の刺激は、CD95-免疫...

ここでは、死誘導シグナル伝達複合体(DISC)で直接カスパーゼ-8処理を検出し、この複合体の組成を決定する実験的ワークフローを提示する。この方法論は、細胞死経路の分子機構の解明からアポトーシスネットワークの動的モデリングまで幅広い応用を有する。

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

アポトーシス開始は、マーカー分子プラットフォームでのカスパーゼの活性化によって媒介される。カスパーゼ8活性化のプラットフォームとなる重要な開始細胞死複合体DISCの検出を提示する。この技術の利点は、この複合体におけるcaspase-8処理に関する情報を提供するとともに、アセンブリおよびDISC複合体の組成の検出を可能にすることです。80%〜90%コンフルエントで、皿に付着した細胞で実験を開始します。培地を捨て、接着細胞に新鮮な培地を加えます。次に、プレートを斜めに保持し、接着細胞に触れることなくリガンドを培地にピペット処理することで、選択したCD95L濃度で細胞を刺激します。細胞を収穫するには、氷の上に細胞皿を置きます。細胞懸濁液に冷たいPBSの10ミリリットルを加え、取り付けた細胞をプレートから削り取ります。50ミリリットルチューブに細胞懸濁液を集める。冷たいPBSの10ミリリットルで細胞皿を2回洗い、同じ50ミリリットルのチューブに洗浄液を加えます。その後、セル懸濁液を摂氏4度で5分間500倍Gで遠心分離する。上清を捨て、冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。その後、細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を遠心分離し、再び冷たいPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。遠心分離をもう一度繰り返し、細胞ペレットを1ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、氷の上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、最大速度でリセートを摂氏4度で15分間遠心し、上清をきれいなチューブに移します。ペレットを捨てて、タンパク質濃度を決定するために、別のチューブにライセートの50マイクロリットルのサンプルを集めます。免疫沈降の場合、2マイクロリットルの抗APO1抗体と10マイクロリットルの調製プロテインAセファロースビーズをライセートに添加します。ビーズの10マイクロリットルを、ビーズコントロールとして機能するリゼートを含む別のチューブに単独で加えます。リゼート、抗体、タンパク質Aセファローズビーズを含む混合物を穏やかな混合で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、500倍Gで摂氏4度で4分間遠心する。上清を捨て、冷たいPBSを1ミリリットル加えてビーズを洗浄し、遠心分離後に上清を捨てます。この手順を少なくとも 3 回繰り返します。最後のPBS洗浄を廃棄した後、好ましくは50マイクロリットルのハミルトンシリンジでビーズを吸引する。ウエスタンブロットを実行するには、ビーズに20マイクロリットルの4Xローディングバッファを加え、摂氏95度で10分間加熱します。同時に、95°Cで5分間、lysateコントロールを加熱します。ライセート、免疫沈降剤、およびタンパク質標準物を12.5%SDSゲルにロードし、一定電圧80ボルトで動作します。ゲルの実行が完了したら、SDSゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を移します。移管が完了したら、ブロット膜を箱に入れ、穏やかな攪拌の下でブロッキング溶液に1時間インキュベートし、PBSTで5分間膜を3回洗浄します。タンパク質を検出するには、示された希釈液で最初の一次抗体を膜に加え、穏やかな攪拌で摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、膜を5分間のPBST洗浄を3回洗浄し、20ミリリットルの二次抗体で膜を室温で1時間穏やかに揺らしてインキュベートします。再びPBSTで膜を3回洗います。最後のPBST洗浄を廃棄した後、約1ミリリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ基板を膜に加え、化学発光シグナルを検出します。CD95Lによる子宮頸癌HeLa-CD95細胞の刺激は、CD95免疫沈降を介して監視される高レベルのCD95 DISC形成をもたらした。CD95、FADD、プロカスパス-8、プロアスパス-10、およびc-フリップは、効率的なDISC形成を示すこれらのCD95免疫沈降法において観察された。p43-FLIPおよびp22-FLIPの切断産物は、カスパーゼ-8活性化を示す免疫沈降で検出された。C-FLIPを過剰発現するHeLa-CD95細胞をCD95 DISC形成の解析に用いた。親のHeLa-CD95細胞と同様に、FADD、プロカスパス-9、プロアスパス-10、c-FLIPタンパク質、およびPARP1の募集は、CD95L治療なしでこれらの細胞からの免疫沈降法で検出されなかった。活性化された一次T細胞は、抗CD95免疫沈降においてCD95、FADD、プロスパパス-8、プロアスパス-10、およびc-FLIPSの高レベルを特徴とした。この技術は、DISCでのカスパーゼ-8の処理を含む、分子DISC形成の解析を可能にする。すべての洗浄ステップは非常に重要です。また、刺激ポイントとインキュベーション時間は真剣に取り組むべきです。これは DISC 複合体上のアセンブリを測定する唯一の方法です。しかし、カスパーゼ8活性化を測定するために、カスパーゼ-8活性アッセイを実施することもできる。このアプローチは、アポトーシス開始に関する新しい洞察を得ることを可能にしました。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、免疫沈降したライセートの化学発光に基づくウェスタンブロッティングについて説明しています。この技術は、タンパク質のプロセシングと活性化を決定するのに役立ちます。検出される化学発光シグナルは、その活性化中のタンパク質プロセシングのレベルに比例します。...

タンパク質プロセッシングのための化学発光ウェスタンブロットアッセイ

マルチプレックスアッセイは、基本的な細胞メカニズムのための有益な情報を提供し、試薬および不必要な反復実験の無駄をなくすことができます。我々は、パルミチン酸との酸化的チャレンジ後のin vitroモデルの視床下部での細胞生存率を決定するために、蛍光及び発光に基づく方法を用いて、ここに多重化カスパーゼ3/7活性アッセイを記載する。...

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。...

インビボでのバイオセンサーは、 ショウジョウバエの非アポトーシスカスパーゼ活性を追跡します

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT...

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。...

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

ここでは、極低温固体ミリングによって、哺乳動物細胞を破壊し、得られた細胞粉末から細胞抽出物を生成し、そして抗体結合ミクロンスケールの常磁性ビーズ上にアフィニティー捕捉により、目的のタンパク質複合体を単離するためのプロトコルを説明します。...

Cryomilled哺乳動物細胞からのタンパク質複合体の親和性のキャプチャ

学ぶCD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の検出法。細胞死経路とアポトーシスネットワークの動的解析に応用可能な実験ワークフローを解説します。

CD95死誘導シグナル複合体の組成とプロスパスパーゼ-8の処理の測定

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