Name: 細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶdSTORMを用いた細胞外小胞のナノメートル分解能3次元可視化法。SARS-CoV-2などのウイルス粒子やエクソソームの構造解析、病態バイオマーカー探索に応用可能な超解像顕微鏡技術を習得できます。

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オックスフォード・ナノイメージングの建設的なフィードバックと指導に感謝します。この作業は、5UM1CA121947-10からR.P.Mに、1R01DA040394からD.P.D.に資金提供されました。

1 細胞株の伝播と維持
<ol><li>ヒト骨肉腫細胞(U2OS)を取得し、10%エキソソームフリーウシ胎児血清および1xペニシリン/ストレプトマイシン溶液を添加した成長培地に細胞を入れる。 注:エキソソームフリーの胎児ウシ血清は、マクナマラで提示されたプロトコルに従って生成されました。al.26.</li>
	<li>U2OS細胞を銅被覆インキュベーターの37°Cで5%CO2、T175フラスコ26,27の通過細胞に維持する。細胞は、亜集団が生じるのを防ぐために、または静止期中にアポトーシスの破片の蓄積から、中対数成長期に維持されなければならない。</li>
</ol>2 エキソソームの分離と精製
<ol><li>U2OS細胞株を10個のT175フラスコでフルコンフルに成長させ、フラスコあたり50 mLのメディアを使用します。細胞上清を取り除き、0.45 μmおよび0.22 μmの真空ろ過装置を通して連続的に通過させる。</li>
	<li>より小さなタンパク質または代謝物28を除去するために、750 kDa中空繊維カートリッジを備えた濾過システム上に、上清をクロスフロー濾過(接線流ろ過量とも呼ばれる)を供する。<ol>
<li>30psiの一定の前方圧力で接線流ろ過演算子を通して上清を通過し、10以上のpsiのΔ圧力を生成するために<20psiの保持圧力を維持しながら。リテンテートタンクに磁気攪拌棒を入れ、150 rpm26に設定します。</li>
		<li>供給速度を40 mL/min以上に保つ。貯水池に透過物を収集し、それを処分します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上清を30mLに濃縮し、4巻の1x PBSで平衡化する。50 mL円錐管で、クロスフローをフィルタして平衡化した溶液を収集します。</li>
	<li>40mg/mLポリエチレングリコールの最終濃度4,000 Da.遠心分離機でEVを4°Cで1時間4°Cで1,200 x g、500 μLで再懸濁します。 </li>
	<li>50 μg/mLの光切り替え可能な赤膜インターカレル染料と50 μg/mLのRNase Aを4°Cで4°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>分画コレクターに取り付けられたタンパク質精製システム上のカラムを通して余分な染料を除去する。UV吸光度を介してEV画分を識別し、マイクロ遠心チューブ26にそれらをプールします。</li>
	<li>1x PBSで平衡化されたアンチCD81磁気ビーズを使用して、合計200μLのEVをアフィニティ選択します。<ol>
<li>1x PBSで100μLの抗CD81磁気ビーズを1mLの全容に希釈し、連続揺れが続く2 mLマイクロ遠心分離チューブで4°Cで2時間結合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x PBSでアンチCD81ビーズとEVを3回洗浄します。37°Cで30分間pH 2.0で100 mMグリシンを用いた溶液からCD81+EVをエリュートします。</li>
	<li>精製したCD81+EVを1x PBSのpH 7.5で等量の100 mM Tris-HClにピペットします。 注:精製されたCD81+EV溶液のアリコートは、溶液の純度およびEV26の存在を確認するために、ナノ粒子追跡分析または電子顕微鏡のために予約されてもよい。</li>
</ol>3 固定と準備
<ol><li>全容200μLのガラス底μスライド8ウェルプレートに親和性精製EVを配置し(1x PBSでpH 7.5で100mM Tris-HClでEVサンプルを希釈することができます)、4°Cで一晩表面に付着させることができます。</li>
	<li>8ウェルプレートから既存の溶液を取り除かずに、各ウェルのEV含有溶液に1x PBSに4%パラホルムアルデヒドの200 μLを加えてプレートにEVを固定し、室温21で30分間インキュベートできるようにします。</li>
	<li>EVを乱さないために、マイクロピペットでパラホルムアルデヒドと過剰溶液を慎重に除去します。余分なパラホルムアルデヒドを除去するために1x PBSでEVを洗浄します。洗浄手順を3回行います。余分な1倍のPBSを取り除きます。</li>
	<li>250 μLのdSTORM B立方体バッファー溶液を、メーカーのプロトコルごとにイメージングバッファー(パートB)で希釈した5 mM原テクテクチエオキシゲナーゼ(パートA)の溶液を作成して、サンプルごとに調製します。 注:光の漂白が発生した場合、バッファー内の酵素の濃度は10 mMに倍増することがあります。<ol>
<li>調製したバッファーの 250 μL をメーカーのプロトコルごとに、室温で 20 分間ずつ追加してから、酸化分子を清掃します。 注:EVはすぐに見るか、4°Cで最大1週間保存することができます。ビジュアライゼーションの前に、ストレージに続くバッファーを交換してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 直接確率的光学再構成顕微鏡校正
<ol><li>100 nmマイクロスフィアを分子生物学グレードの水濃度0.5%に希釈し、ガラス底μスライド8ウェルプレートの各ウェルに200 μLをピペット化して、超解像顕微鏡のキャリブレーションに必要なビーズを準備します。<ol>
<li>ビーズを室温で1時間ウェルに落ち着かせる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>既存の溶液を取り除かずに、PBSに4%パラホルムアルデヒドを200 μL加えて、各ウェルをキャリブレーションビーズ溶液に加え、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>慎重にビーズを邪魔しないようにマイクロピペットでパラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSでビーズを3回洗浄します。ステップ 3.4 に従ってバッファーを準備します。</li>
	<li>1x PBSを取り出し、準備したバッファの250 μLを各ウェルに追加します。ビジュアライゼーションの前にバッファを 20 分間待機させます。</li>
	<li>ステージ上に何かを置く前に、顕微鏡ボタンを接続して3D 顕微鏡に接続 します。目的に100x油を加え、目的の上に井戸の中心を置きます。取得設定 で 、473 および 640 nm の励起レーザーをオンにして、[ 表示] をクリックします。<ol>
<li>3-D レンズをアクティブにせずに、[イメージ表示]オプションでフォトン数をクリックして、フォトンの彩度設定の下にビーズを表示します。最初のレーザーパワーを473 nmレーザーの場合は8.4 mW、640 nmレーザーでは11.6 mWに設定します。</li>
		<li>レーザーの焦点を-300 nm前後、またはキャリブレーションビーズの焦点面に下げ、個々のビーズの明確な解像度を生成します。Z面が焦点を合わせられたら、レーザーパワーレベルを調整して、各視野の変動を考慮します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>計器機能の下で、3次元マッピングキャリブレーションとチャンネルマッピングキャリブレーションを完了して、X軸、Y軸、Z軸の誤差を取得します。FOV の最大数を 20、目標ポイント数を 4,000、チャネル間の最大距離を 5.0 ピクセルに設定し、チャネルマッピングのキャリブレーション中にチャネル間の除外半径を 10.0 ピクセルに設定します。</li>
	<li>キャリブレーションにより、ポイントカバレッジが>90%、マッピング品質が良好であることを確認します。将来の画像取得のために、指定されたキャリブレーションデータを保存します。</li>
</ol>5 3次元でのEVの可視化
<ol><li>目的に100x油を加え、準備したEVを顕微鏡に入れます。3Dレンズが作動しない場合は、640 nmの励起レーザーをオンにし、信号の強度と視野に応じて1.2mWから12.5mWの間に最初に上げて、赤色膜間の色素染色されたEVを励起させます。<ol>
<li>[ イメージ表示 ]オプションで、表示方法をフォトン飽和からパーセンタイルに切り替えて、EV をより適切に視覚化します。信号を最大化しながら、ノイズを最小限に抑えるためにレーザーパワーを調整します。他のすべてのパラメーターを維持します。</li>
		<li>Z 軸の上または下のアイコンをクリックして、Z 平面のフォーカスを調整します。 注: Z 平面は -200 ~ -350 nm の間に焦点を合わせる必要がありますが、視野によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>露光時間を20 ms、フレームキャプチャを10,000フレームに、初期レーザーパワーを1.2 mW~12.5 mWの間に設定するか、または、信号と視野の強度に応じてステップ5.1で決定したレーザーパワーを設定します。<ol>
<li>アイコンを使用して3Dレンズをアクティブにし、取得ボタンをクリックして 取得 を開始します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像取得中は、1000 フレームごとに 10 ずつ、または高い信号対雑音比を維持するのに十分な単位でレーザーパワーを上げます。取得中に Z 平面を調整しないでください。 メモ:レーザーは最大90mWのレーザーパワーまで上げてもよい。</li>
</ol>6 取得後の変更と EV トレース
<ol><li>画像の取得後、[ 分析] 表示ウィンドウに切り替えます。フィルタされていない画像に対してドリフト補正を実行し、フィルタをアクティブにします。 表 1に従って、フォトン数、ローカリゼーション精度、シグマ、およびフレームインデックスを調整します。</li>
	<li>XYZ 平面ビュー ツールを、ビューおよびエクスポート のフィールドから個々の EV の X 軸に沿ってオーバーレイします。写真スイッチングイベントのCSVファイル。</li>
	<li>X by Y 視野の XY 軸上の個々の EV を二分する場合、ライン ヒストグラム ツールを使用して、フォトスイッチング イベントを設定された距離グループにビン分割します。</li>
	<li>単一のEVの画像を撮り、.tiffファイルとして保存します。</li>
	<li>3-D 視覚化ツールを使用して、個々の EV の 3D ビデオを作成し、Z 軸に沿った配置に従って色を設定します。</li>
</ol>

M.G..Cは宣言する利益相反はありません。R.P.MとD.P.D.は、オックスフォードナノイメージング(ONI)社とシティバ社(旧GEヘルスケア)から材料サポートを受けています。R.P..MとD.P.D.は、提示された情報の一部の商業化の可能性について競合する利益を宣言します。これらはノースカロライナ大学によって管理されています。資金源は、この原稿の解釈や執筆には関与していなかった。

EVは、多くの細胞内プロセスおよび細胞間シグナル伝達1,30において重要な役割を果たしているため、研究分野として人気となっている。しかし、その小さなサイズが光顕微鏡の回折限界を下回るので、その視覚化は困難であることが判明した。直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、個々の蛍光体の光スイッチングイベントを経時に捉え、これらの点滅イベント21,31に基づいて画像を再構築することによって回折限界をバイパスする可視化の直接的な方法である。超解像顕微鏡は、アクチンフィラメント、微小管、原形質膜に埋め込まれた受容体、および感染細胞32、33、34、35、36のウイルスタンパク質などのいくつかの細胞構造に対して3-Dで正常に行わ...

細胞外小胞(EV)は、全ての細胞タイプによって放出される膜結合小胞である。脂質、タンパク質、代謝産物、核酸を含み、細胞間で細胞間で局所的に、組織と器官の間で遠位に移動します。EV には、アポトーシス体、微小小胞、エキソソーム1、2という 3 つの主要なサブタイプがあります。ここでは、エキソソームとその関連タンパク質に焦点を当てます。
エキソソームは、初期の子宮体の内出から多胸体(MVB)に由来する小胞を分泌する。MVBは、その後、細胞膜と融合し、エキソソームを細胞外空間に放出して、他の細胞3、4に移動する。エキソソームは40~150nmの範囲の大きさのスペクトルに存在し、テトラスパニン(CD9、CD63、CD81)、輸送に必要な膜結合性内膜選別複合体(ESCRT)、および脂質いかだ関連タンパク質1、2、5、6、7と呼ばれる内皮貫膜タンパク質で富化される。
エキソソームの生化学的構成を特徴付け、研究者が機能性をよりよく理解する人気の分野となっています。ナノスケールフローサイトメトリー、ナノ粒子追跡解析(NTA)、走査・透過電子顕微鏡(TEM)、表面プラズモン共鳴、抵抗パルスセンシング、従来の光顕微鏡など、エキソソームの視覚化と特徴付けには多くの方法があり、それぞれに本質的な長所と短所8,9が含まれています。TEMとcryo-EMはナノメートルベースの分解を達成することができるが、しばしば脱水および凍結破壊ステップを必要とし、それによってEV10、11を収縮またはライシングする。NTAは光散乱に依存し、一度に数百個のEVの特性を持たせることができますが、粒子サイズの間接的な測定であり、EV、ウイルス、およびタンパク質凝集体12、13、14、15、16を容易に区別することはできません。ナノスケールフローサイトメトリーは励起路からの光散乱を採用し、その後サイズ測定に変換することができるが、新たな技術であり、様々な機器12、17、18の検出の線形範囲内にある粒子のサイズについてはほとんどコンセンサスがない。
蛍光タンパク質や色素を用いた従来の光顕微鏡は、細胞内の細胞内コンパートメント、タンパク質複合体、およびシグナル伝達機械を可視化するために最も採用されている技術の1つであった。この技術は、複合体の局在化を可視化するのに有用であることが証明されるが、従来の光顕微鏡(250〜400nm前後)の回折限界は、エキソソーム(40-150 nm)12、19、20の典型的なサイズ範囲におけるタンパク質または構造の明確な分解能を防ぐ。
超解像顕微鏡、すなわち直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、特定の蛍光ホルの光スイッチ可能な特性を採用し、これらの点滅事象を検出してナノメートル精度21まで画像を再構築することによって、従来の光顕微鏡と区別する。光スイッチングイベントは、数万個の個別露光の過程で高フレームレート検出カメラを用いて収集され、ポイントスプレッド関数は、光スイッチング蛍光体19、20、22の正確な位置を高い信頼度でマッピングするために使用される。これにより、dSTORMは光顕微鏡の回折限界をバイパスすることができます。いくつかのグループは、エキソソームおよび関連するタンパク質22、23、24、25を視覚化および追跡するための超解像技術の使用を報告している。最終的な分解能は、フルオロフォアの生物物理学的性質に依存しますが、多くの場合、XY軸に沿って+/-10-100nmの範囲であり、単一分子分解能を可能にします。
XY軸でこのスケールで個々の蛍光体を解決する能力は、顕微鏡に革命を起こしました。しかし、エキソソームの3次元(3次元)dSTORMに関するデータはほとんどありません。そこで、3次元のエキソソームからナノメートルの精度を含む、精製EVのdSTORMベースの可視化と特性評価のための標準的な操作手順(SOP)を確立することを求めました。

<table><tbody><tr><td>15 &micro;-スライド 8 ウェルプレート</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>1X ペニシリン ストレプトマイシン溶液</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>Thermo Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 0.22 &micro;m 真空ろ過装置</td><td>ジェネゼー</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>750 kDa 中空糸カートリッジ カットオフフィルター</td><td>サイティバ</td><td>29-0142-95</td><td></td></tr><tr><td>AKTA フラックス S</td><td>サイティバ</td><td>29-0384-37</td><td></td></tr><tr><td>AKTA スタート</td><td>サイティバ</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>アンチCD81磁気ビーズ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10616D</td><td></td></tr><tr><td>Bキューブバッファ</td><td>ONI</td><td>&nbsp;</td><td></td>BCA0017</tr><tr><td>CellMask Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Dubelco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Frac 30 Fraction collector</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>グリシン pH=2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap CaptoCore 700 カラム</td><td>Cytiva</td><td>17548151</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレード ウォーター</td><td>コーニング</td><td>9820003</td><td></td></tr><tr><td>ナノイメージャー</td><td>オックスフォード ナノイメージング</td><td>カスタム</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>プロメガ</td><td>A797C</td><td></td></tr><tr><td>T175 フラスコ</td><td>ジェネシー</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>テトラスペック マイクロスフェア</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>トリス - HCl pH=7.5</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>ユニコーン V</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

細胞外小胞(EV)は、細胞の種類を全て放出し、細胞シグナル伝達や恒常性に重要な役割を果たす。EV の視覚化には、通常の光顕微鏡の回折限界を超える小径 (40 ~250 nm) による間接的な方法が必要な場合が多い。我々は、2次元と3次元の両方で回折限界をバイパスするEVの超解像顕微鏡ベースの視覚化を開発しました。この方法を使用すると、XY 軸での解像度 +/- 20 nm 以内、Z 軸に沿った解像度 +/- 50 nm の解像度に、EV の 3 次元の形状を解決できます。結論として、我々は、超解像顕微鏡をエキソソームを含むEVの特性評価方法として、また、エンベロープウイルスとして考慮することを提案する。

本研究の目的は、3次元(3次元)のナノメートル分解能を有する個々のEVを可視化する上での超解像顕微鏡の有効性を評価することであった。個々のEVの形状と大きさを解析するために、光切り替え可能な色素を採用し、遠赤色の膜インターカラット色素でEVをインキュベートし、クロマトグラフィー29を介して過剰な色素を除去した。アフィニティキャプチャー抗CD81および赤色染色されたEVは、640 nm励起レーザー下の超解像顕微鏡で見た。XY軸で16nm、Z軸で38nmの平均誤差を生み出した顕微鏡のキャリブレーション(図1A、B)に続き、精製されたU2OS EVはXY軸上で最大20nm、Z軸に沿って50nmの分解能で正常に視覚化されました。
レーザーパワーが増加し、取得した画像で容易に明らかであったとき、3D光交換3DフォトスイッチでdSTORMを介して視覚化された個々のEV(図2A、B)。Z平面の取得後画像補正、フォトン数、シ...

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

このプロトコルは、超解像顕微鏡、特に直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORMとも呼ばれる)を採用し、回折限界を迂回し、ナノメートル精度のEVを3次元で可視化します。dSTORMの1つの顕著な利点は、EVの生化学的性質を変化させるステップを損傷することなく、光の回折レベルの下の粒子を直接視覚化する能力です。多くの進化的に異なるウイルスはEVシグナル伝達を採用しているため、疾患バイオマーカーや進行性のEVを特徴付けるとともに、SARS-CoV2などの個々のウイルス粒子を可視化するためにdSTORMを用いることができる。まず、アフィニティ精製、細胞外小胞、またはEVをガラス底、マイクロスライド、8ウェルプレートの合計体積200マイクロリットルに配置し、摂氏4度で一晩表面に付着させることから始めます。8ウェルプレートから既存の溶液を取り除かずに、各ウェルのEV含有溶液に1X PBSに4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを加えてプレートにEVを固定し、プレートを室温で30分間インキュベートできるようにします。慎重に、パラホルムアルデヒドと余分な溶液をマイクロピペットで除去し、EVを乱さない。1X PBSでEVを洗浄し、過剰なパラホルムアルデヒドを除去します。洗浄手順を3回行います。余分な1X PBSを取り除きます。メーカーのプロトコルに従ってイメージングバッファーで希釈した5ミリモル原作ジオキシゲナーゼの溶液を作成することにより、サンプル当たり250マイクロリットルのdSTORM Bcubedバッファー溶液を調製します。製造したバッファーの 250 マイクロリットルをメーカーのプロトコルに従ってそれぞれに加え、室温でプレートを 20 分間インキュベートしてから、酸化分子を清掃します。EVは、すぐに視覚化したり、摂氏4度で1週間保存することができます。超分解能顕微鏡の較正に必要なビーズを調製するために、分子生物学グレードの水の濃度0.5%に100ナノメートルのマイクロスフェアを希釈し、ピペット200マイクロリットルをガラス底、マイクロスライド、8ウェルプレートの各ウェルに入れます。ビーズを室温で1時間井戸に落ち着かせる。既存の溶液を除去することなく、PBSに4%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルを各ウェルに加えて、キャリブレーションビード溶液に加え、室温で30分間インキュベートします。マイクロピペットでパラホルムアルデヒドを慎重に取り出してビーズを邪魔しないようにし、1X PBSでビーズを3回洗います。原稿に記載されているとおりにバッファを準備します。1X PBSを取り出し、準備したバッファーの 250 マイクロリットルを各ウェルに追加します。バッファーをビジュアライゼーションの前に 20 分間待機させます。ステージ上に何かを配置する前に、3D顕微鏡に接続するには、「顕微鏡を接続」ボタンを使用します。目的に100X油を加え、目的の上に井戸の中心を置きます。取得設定で、473および640ナノメートルの励起レーザーをオンにして、[表示]をクリックします。3D レンズをアクティブにすることなく、[イメージ表示オプション]の[フォトン数]をクリックして、フォトンの彩度設定の下にビーズを表示します。最初のレーザーパワーを473ナノメートルレーザーの場合は8.4ミリワット、640ナノメートルレーザーでは11.6ミリワットに設定します。レーザーの焦点をマイナス300ナノメートルまたはキャリブレーションビーズの焦点面に下げ、個々のビーズの明確な解像度を生成します。Z面が焦点を合わせられたら、レーザーパワーレベルを調整して、各視野の変動を考慮します。インストゥルメント関数で、3D マッピングキャリブレーションとチャネルマッピングキャリブレーションを完了して、X、Y、Z 軸の誤差を取得します。ビューの最大フィールド数を 20、目標のポイント数を 4,000、チャネル間の最大距離を 5.0 ピクセルに設定し、チャネルマッピングのキャリブレーション中にチャネル間の除外半径を 10.0 ピクセルに設定します。キャリブレーションにより、90%を超えるポイントカバレッジと、良好なマッピング品質が得られます。将来の画像取得のために、指定されたキャリブレーションデータを保存します。目的に100X油を加え、準備したEVを顕微鏡に置きます。3Dレンズを有効にすることなく、640ナノメートルの励起レーザーをオンにし、最初に赤い膜を励起する視野の信号の強度に応じて1.2〜12.5ミリワットに上げます。[イメージ表示オプション] で、表示方法をフォトン飽和から百分位数に切り替えて、EV をより適切に視覚化します。信号を最大化しながらノイズを最小限に抑え、他のすべてのパラメータを維持するためにレーザーパワーを調整します。Z 軸の上または下のアイコンをクリックして、Z 平面のフォーカスを調整します。露出時間を 20 ミリ秒、フレーム キャプチャを 10,000 フレームに、初期レーザーパワーを 1.2 ~ 12.5 ミリワットに設定します(信号の強度と視野の表示範囲に応じて)。アイコンを使用して3Dレンズをアクティブにし、取得ボタンをクリックして取得を開始します。画像取得プロセス全体を通して、1000 フレームごとに 10 ずつ、または高い信号対雑音比を維持するのに十分な単位でレーザーパワーを上げます。取得中に Z 平面を調整しないでください。画像の取得後、[分析] 表示ウィンドウに切り替えます。フィルタされていない画像に対してドリフト補正を実行し、フィルタをアクティブにします。原稿で述べたように、フォトン数、ローカリゼーション精度、シグマ、フレームインデックスを調整します。X、Y、Z 平面ビュー ツールを、視野から個々の EV の X 軸に沿ってオーバーレイし、フォトスイッチング イベントの個々の csv ファイルをエクスポートします。ライン ヒストグラム ツールを使用して、X、Y 軸の X、Y 軸上の個々の EV を 2 分、X 座標方向の視野を使用して、フォトスイッチング イベントを設定された距離グループにピンで固定します。単一のEVの画像を撮り、tifファイルとして保存します。3D 視覚化ツールを使用して、個々の EV の 3D ビデオを作成し、Z 軸に沿った配置に従って色を指定します。X、Y軸、38ナノメートルの平均誤差をZ軸で生成した顕微鏡のキャリブレーションに続いて、精製されたu20s EVは、X、Y軸、Z軸に沿って50ナノメートルまでの解像度で正常に視覚化されました。3D光光交換でdSTORMを介して可視化された個々のEVは、レーザーパワーが増加するにつれて10,000フレーム露光を通して、取得した画像で容易に明らかであった。Z平面における取得後の画像補正、フォトン数、シグマ、および再構成された画像のローカリゼーション精度は、3DでのEVの明確な解像度をもたらしました。EV は、右上隅の凡例に見られるように、最初の 7,000 フレームの間だけ光スイッチを入れました。ヒストグラムは、光スイッチングイベントの大半が半径100ナノメートル以内で発生したことを確認し、可視化されたEVがエキソソームであり、小径のEVの分離が成功したことを検証する。ラインヒストグラムツールとX,Y,Z平面ビューツールを使用して、他の個別にトレースされたEVで行われたサイズ分布解析により、ほとんどの光スイッチングイベントが中心の半径100ナノメートル以内で発生したことを確認しました。Z軸に沿った誤差が増加し、軸軸に沿ったEVの細長い最終画像が生成されました。光スイッチングイベントはEVサイズと相関しておらず、dSTORMベースの特性化がエキソソームや直径100ナノメートル未満の小さなエンベロープウイルスのような小さなEVに使用できることを実証しました。dSTORMを実行している間は、最初のレーザーパワーを非常に低く設定し、光の漂白を防ぐために画像取得全体を通してゆっくりと上げることを覚えておくことが重要です。開発以来、dSTORMは、典型的な光顕微鏡の回折限界のために以前は視覚化が不可能であったサブ細胞構造の形態をよりよく理解することを可能にしました。

direct-stochastic-optical-reconstruction-microscopy-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ネガティブ染色電子顕微鏡（EM）を用いて生体高分子の三次元（3D）再構成を得るために標準的な方法を説明します。このプロトコルでは、我々はランダムな円錐形の傾斜の再構成法（RCT）を使用して中解像度でサッカロマイセスセレビシエエキソソーム複合体の立体構造を取得する方法について説明します。...

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細胞外小胞取り込みアッセイ:3D蛍光イメージング技術を使用して細胞外小胞の細胞取り込みを可視化および定量化する方法

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4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

このビデオプロトコルでは、改良された2光子顕微鏡の軌道追跡法を使用して、生細胞内の蛍光標識されたリソソームを高速かつ3次元で追跡します。...

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。...

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

チップベースの超分解能光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡検査の新しいアプローチであり、費用対効果とスループットの利点を提供します。ここでは、チップ調製およびイメージングのためのプロトコルをTIRF顕微鏡および局在化ベースの超解像顕微鏡用に示す。...

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

この記事では、細胞骨格タンパク質を内包した巨大な単層小胞を迅速に生産するための簡単な方法を紹介します。この方法は、閉じ込めおよび細胞骨格 - 膜相互作用における細胞骨格構造のボトムアップ再構成に有用であることが証明されている。...

巨大な単層小胞内の再構成された細胞骨格の迅速なカプセル化

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。...

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

このプロトコルでは、単一対物レンズのライトシート蛍光顕微鏡の構築方法と、細胞骨格ネットワークを可視化するためのその使用法について詳しく説明します。...

細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

学ぶdSTORMを用いた細胞外小胞のナノメートル分解能3次元可視化法。SARS-CoV-2などのウイルス粒子やエクソソームの構造解析、病態バイオマーカー探索に応用可能な超解像顕微鏡技術を習得できます。

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

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