Name: RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶシルクフィブロインマイクロカプセル調製法。DNAプラスミドを封入し、RNAアプタマーとリボスイッチ機能を維持する生体適合性バイオセンサーを作製。GFPa1発現を用いた遺伝子活性化動態の研究に応用可能です。

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この研究は、空軍科学研究局からのLRIR 16RH3003J助成金、および米国国防次官研究工学事務所の軍事環境応用研究のための科学技術優先事項の進歩(ARAP)プログラムの支援を受けました。
ThyRSのプラスミドベクター配列(pSALv-RS-GFPa1、3.4 kb)は、J. Gallivan博士によって寛大に提供されました。 ボンビックスモリ のカイコの繭は、マサチューセッツ州タフツ大学のD.L.カプラン博士から寛大に寄贈されました。

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<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
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<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly%28Ethylene+Glycol%29+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li>
<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
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<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+layer-by-layer+assembly%3A+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M%C3%B6hwald%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li>
<li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504(2021).</li>
<li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li>
<li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046(2018).</li>
<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
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<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
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ここに提示された見解および意見は著者のものであり、必ずしも国防総省またはそのコンポーネントの見解を表すものではありません。

様々なタイプのDNAコードセンサー設計を装填した選択透過性ヒドロゲルマイクロカプセルは、このプロトコルに従って調製することができる。LbLアプローチの特徴の1つは、ボトムアップアセンブリ中にマイクロカプセルの複雑さを調整できることであり、これは通常、犠牲テンプレートへの分子種の吸着から始まります。初期成分の濃度、pH条件、および層数を注意深く調整することにより、異なるDNA負荷パラメータ、機能性、および調整可能な透過性を有するマイクロカプセルを調製することができる23。カプセルの汎用性を増幅するために、AuNPおよびIgGによるシェル表面のさらなる機能化を達成して、 in vivo 診断用の生体適合性センサーキャリアを実装することができます。これらの代替経路は両方とも、絹フィブロインの独特の分子構造に依存しています。最適な還元バッファーの存在下で金属イオンを還元できるチロシン残基(5.3%モル)の存在により、Au3+ イオンのin situ還元を達成できます。AuNPs機能化タンパク質マイクロカプセルの表面への特異的抗体の結合は、カルボジイミド活性化...

合成生物学の分野は、微生物によって進化した自然のメカニズムを利用して環境と潜在的な脅威を監視することにより、センシング機能を開発するユニークな機会を提供します。重要なことに、これらのセンシングメカニズムは通常、これらの微生物を有害な曝露から保護し、遺伝子発現を調節して悪影響を軽減したり、有毒物質の摂取を防止したりする応答に関連しています。これらの微生物を操作して、これらの自然な応答を利用して全細胞センサーを作成するが、新しいターゲットを認識したり、定量目的で測定できる測定可能なシグナルを生成したりするようにリダイレクトする多大な努力がなされてきました(通常は蛍光)1,2。現在、遺伝子組み換え微生物(GMO)の使用に関する懸念は、特に環境または人体に放出する場合、ポリマーマトリックスにカプセル化されていても、細胞全体またはその遺伝物質の一部の漏出により、これらのセンシングアプローチを利用する別の方法が必要であることを示唆しています3。
GMOの展開を心配することなく微生物ベースのセンシングの利点を活用するための強力なアプローチは、in vitro転写/翻訳(IVTT)システムの使用です。実用的な観点から、IVTTシステムは、超音波処理、ビーズビートなど、さまざまな手段で細胞から「抽出」された活性状態の細胞成分のほとんどを含む混合物で構成されています4。このプロセスの最終生成物は、転写と翻訳を実行するためにすでに最適化された生化学反応混合物であり、細胞全体の使用に関連する制約(膜拡散、形質転換効率、細胞毒性など)なしに、「オープンベッセル」フォーマットでさまざまなセンサーをテストするために使用できます。重要なのは、さまざまなセンサーコンポーネントを定量的に追加でき、その効果をさまざまな光学的および分光的手法で研究できることです(5)。IVTTシステムのパフォーマンスに一貫性がない可能性があることがわかっています。しかし、最近の研究では、それらの準備と特性評価を標準化するアプローチが示されており、センサー設計6での性能を研究する際に非常に役立ちます。最近、重金属イオン、薬物、クォーラムセンシング素子などの検出を含む、紙マトリックス中の成分の凍結乾燥を通じて紙ベースのアッセイを作成するために使用するIVTTシステムの多くの例が実証されています7,8,9。IVTTベースのセンサのエキサイティングなアプリケーションスペースは、土壌、水、人体など、さまざまなタイプの環境でのセンシングアプリケーションでの使用です。これらのIVTTシステムをこれらの困難な環境に展開するには、IVTTコンポーネントを封じ込め、劣化から保護するためのカプセル化アプローチを実装する必要があります。
IVTTシステムのための最も一般的なカプセル化アプローチには、脂質カプセル、ミセル、ポリマーソーム、および他の緊密に密閉されたマイクロ容器の使用が含まれる10、11、12。このアプローチの欠点の1つは、外部環境との通信を可能にし、センシング機能を提供するために、容器の内外に材料を輸送するためのパッシブまたはアクティブメカニズムのいずれかを組み込む必要があることです。これらの問題のいくつかを克服するために、この研究では、IVTTシステムで表現されるさまざまなセンサー設計のエンコード材料をカプセル化するためのシンプルで効果的なアプローチを提供する方法を報告します。このアプローチは、目的のプラスミドの存在下でバイオポリマーをレイヤーバイレイヤー(LbL)堆積して、高い多孔性の中空マイクロカプセルを作成することに基づいており、保護された遺伝物質が選択したIVTTのさまざまなコンポーネントと相互作用できるようにします。この研究は、カプセル化されたプラスミドが、プラスミドコードされたアプタマーとリボスイッチの対応する標的への応答で示されるように、このポリマーマトリックス内で活性化されると転写と翻訳を指示できることを実証しました。さらに、このLbLコーティングは、特別な保存条件なしでプラスミドを数ヶ月間保護します。

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-2-メチル-1-(2,2,2-トリフルオロエチル)-1H-イミダゾール-5(4 H)-オン (DFHBI-1T)</td><td>ルツェルナ</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 DNAリガーゼ緩衝液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Blue Gel Loading Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, black circular</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent、分子生物学用、低EEO</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>粉末または結晶、BioReagent、細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>BlpI制限酵素</td><td>ニューイングランドBioLabs</td><td>R0585S</td><td></td></tr><tr><td>コーニング使い捨て真空フィルター/保管システム</td><td>FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS試薬、&ge;99.9%</td></tr><tr><td>DNAプラスミド、pET28c-F30-2xブロッコリー(5.4 kb)、BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>DyLightTM550 抗体ラベリングキット (Invitrogen)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>E. coli S30 extract system for circular DNA</td><td>Promega</td><td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Conical centrifuge tubes, 15 mL</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Conical centrifuge tubes, 50 mL</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand微量遠心チューブ、1.5 mL</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>フッ化水素酸、HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS 試薬、48%</td></tr> <tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Kanamycin A (主成分) とカナマイシン B および C</td></tr><tr><td>KpnI 制限酵素の</td>混合物 <td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>LB寒天プレートに100&microを補充。g/mL アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>注光済み寒天プレート 100 &micro;g/mL アンピシリン</td></tr><tr><td>LB 寒天プレートに 50 μ を添加。g/mL カナマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>注入済み寒天プレート 50 &micro;g/mL カナマイシン</td></tr><tr><td>LB ブロス (レノックスグレード)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>臭化リチウム、LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus、&ge;99%</td></tr><tr><td>最大効率 DH5-&alpha; 有能な大腸菌株</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>322415</td><td>無水, 99.8%</td></tr><tr><td>ミリQ-水</td><td>EMD ミリポア</td><td></td><td>ミリ-Q 基準浄水システム</td></tr><tr><td>MinElute PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩酸塩、EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS、pH 7.4</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimine, branched</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>average Mw ~25,000</td></tr><tr><td>PURExpress In Vitro タンパク質合成キット</td><td>New England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp;27104</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load 2-Log DNA Ladder (0.1-10.0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? silica microspheres, 4.0 & micro;m</td><td>Polysciences, Inc. (英語)</td><td>24331-15</td><td>10% 水溶液</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 透析カセット、3.5K MWCO、15 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム、Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>ACS試薬、無水、&ge;99.5%, 粉末</td></tr><tr><td>スペクトル Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 透析装置</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (5 U/&micro;L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>テオフィリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T1633</td><td>無水、&ge;99%、粉末</td></tr><tr><td>トリスアセテート-EDTAバッファー(TAEバッファー)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T6025</td><td>40 mMトリス-アセテートと1 mM EDTAが含まれています、pH 8.3。</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II プラスミド MaxiPrep キット</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

rnaアプタマーおよびリボスイッチをコードするdnaプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

犠牲球状コア上でのLayer-by-layer(LbL)アセンブリ法によるDNA含有絹フィブロインマイクロカプセルの調製のためのプロトコルを紹介します。プライム層とDNAプラスミドの吸着に続いて、単一のシルク層の急性脱水中にシルク二次構造にβシートを誘導することにより、堅牢なマイクロカプセルの形成を促進しました。したがって、層状化は複数の水素結合と疎水性相互作用を介して発生しました。多層シェルを吸着すると、コアシェル構造を金ナノ粒子(AuNP)および/または抗体(IgG)でさらに機能化して、リモートセンシングおよび/またはターゲットデリバリーに使用できます。ポリマープライマーの存在、DNAとシルクタンパク質の濃度、および多数の吸着層など、シリカコアへの主要な高分子の順次堆積中にいくつかの重要なパラメーターを調整すると、透過性とDNA負荷が変化する生体適合性のDNAを含むマイクロカプセルが得られました。シリカコアの溶解時に、プロトコルは、カプセル膜の内面に固定化されたDNAプラスミドを有する中空で堅牢なマイクロカプセルの形成を実証した。DNAプラスミドと外部環境との間に選択的に透過性の生体適合性膜を作成することで、長期保存中にDNAを保存し、空間的に閉じ込められたプラスミドからの出力応答の改善に重要な役割を果たしました。DNAテンプレートの活性とそのアクセシビリティを、 in vitro 転写および翻訳反応(無細胞系)中にテストしました。RNAライトアップアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドは、卵殻膜における蛍光標識RNA転写物またはGFPa1タンパク質の局在化中に視覚化されたように、対応するアナライトで正常に活性化されました。

ここでは、絹タンパク質カプセルにカプセル化した後、さまざまなセンサー設計(2種類のRNA調節転写/翻訳要素)をコードするDNAテンプレートの機能について説明します。マイクロカプセルは、主要成分であるプライム層、センサー設計をコードするDNAプラスミド、および絹フィブロインバイオポリマーのテンプレート化されたレイヤーバイレイヤー(LbL)アセンブリを介して調製されました(図2)。層状に高分子を堆積させることで、吸収層とシェルの厚さとの間の分子間および分子内相互作用に基づいてカプセル膜の透過性を制御することができます。システムの調整可能な透過性は、カプセル膜20を通る大きな望ましくない巨大分子の拡散を制限しながら、必須分子の拡散を制御する可能性を提供した。
プロトコルに適切に従うと、均質なサイズ(4.5 μm)で、シェルの厚さが~500 nm(20層)の堅牢なシルクフィブロインマイクロカプセルを水和状態で製造できます(図3</strong...

このプロトコルは、堅牢で生体適合性のあるDNAを含むマイクロカプセルの形成を、いくつかのリガンドを追跡できるマルチプレックス 化されたin vitro バイオセンサーとして説明しています。

RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

このプロトコルの重要性は、DNAプラスミドテンプレートを半透過性の生体適合性マイクロカプセルに固定化することにより、DNAコード化されたセンサーを機能させる手段を提供することです。提案されたDNA固定化技術は用途が広いです。これにより、異なるin vitro活性化メカニズムを持つ多機能バイオセンサーの作製が可能になります。これらのマイクロカプセルは、適切なセンシング素子と組み合わせることで、バイオフィルムや臓器などのさまざまな環境でのシグナル伝達分子の放出など、さまざまな生物学的プロセスを研究できると考えています。この手法は、ミクロスケールでの生物学的システム、特にDNAの固定化と分子の混雑が遺伝子活性化の速度論とメカニズムにどのように影響するかについての洞察を提供します。まず、2ミリリットルの微量遠心チューブ内の300マイクロリットルの微粒子に1ミリリットルのポリエチレンイミン溶液を添加することにより、犠牲シリカ(SiO2)微粒子にポリエチレンイミン素層を堆積させます。ThermoMixerで混合物を周囲条件で毎分800回転で攪拌します。ミクロ粒子を室温で0.2gで1分間遠心分離して回収し、上清を慎重に取り除きます。15分後、0.2gで室温で1分間遠心分離することにより、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない脱イオン水で微粒子を4回洗浄し、各遠心分離後に上清を廃棄します。次に、DNaseおよびRNaseを含まない蒸留水でDNAプラスミドの濃度を1マイクロリットルあたり50〜200ナノグラムに調整し、調製した溶液の1ミリリットルを使用して、ポリエチレンイミンプライミングされた微粒子にDNAを沈着させます。ThermoMixer上で微粒子混合物を摂氏4度、800rpmで15分間静かに撹拌し、次いで0.2gで1分間遠心分離して微粒子を回収します。テオフィリンリボスイッチをコードするDNAプラスミドをGFPa1と結合してThyRS-GFPa1として、ブロッコリーアプタマーをコードするDNAプラスミドをBrocAptとしてチューブに印を付けます。上清を慎重に除去し、前に示したように、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で微粒子を4回洗浄し、各遠心分離後に上清を廃棄します。絹フィブロイン層を堆積させるには、DNA吸収された微粒子に再溶解した絹フィブロイン水溶液を1ミリリットル加え、ThermoMixer上で混合物を750rpmで10°Cで15分間穏やかに攪拌します。遠心分離によって微粒子を回収し、前に説明したように、1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で1回洗浄します。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。0.5ミリリットルのDNaseとRNase蒸留水を加え、微粒子をボルテックスして混合します。次に、微粒子を0.5ミリリットルの100%メタノールで摂氏10度でThermoMixerで5分間処理します。遠心分離により微粒子を回収した後、ThermoMixer上で100%メタノールで粒子を100%メタノールで処理し、毎分750回転、摂氏10°C、βシート形成を行います。混合物を0.2 gで摂氏4度で1分間遠心分離し、微粒子を回収してから、前に示したように1ミリリットルのDNaseおよびRNaseを含まない蒸留水で粒子を2回洗浄します。ペレット状にしたコアシェル微粒子に8%フッ化水素酸溶液を添加することにより、微粒子のSiO2コアを溶解します。溶解した粒子溶液を透析装置に移し、ビーカー内で脱イオン水に対して透析します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、透析装置からのシルクマイクロカプセル懸濁液を新しい2ミリリットルの微量遠心チューブに収集します。100マイクロリットルのマイクロカプセルサンプルを8ウェルチャンバーガラススライドの1つのウェルに移し、カプセルを20〜30分間沈殿させてから、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を使用してイメージングします。カプセルの懸濁液100マイクロリットルをチャンバーガラススライドの各ウェルにピペットで移します。各ウェルに、分子量が小さいものから高いものまで異なる300マイクロリットルの蛍光色素溶液を順次加えます。ピペッティングで上下させて混合物を混合し、蛍光色素溶液の拡散が平衡に達するまで室温で1時間インキュベートします。その後、スライドをCLSMに移し、励起波長488ナノメートルの100倍油浸対物レンズを使用して各ウェルをイメージングします。焦点面を調整して対象領域を特定し、最大直径の円の形で表示されるカプセルに焦点を合わせます。マイクロカプセルのサンプルに無細胞成分を順次添加し、チューブを摂氏30度で4時間インキュベートすることにより、in vitro転写/翻訳反応を行います。励起波長488ナノメートル、GFP/FITCフィルターの発光波長約510ナノメートルを用いて、プレートリーダーで蛍光を確認します。最後に、488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用して、CLSMシステム上のシルクマイクロカプセルをイメージングします。本研究では、約4.5マイクロメートルの均質なサイズと約500ナノメートルのシェル厚を持つ堅牢なシルクフィブロインマイクロキャップを作製しました。中空シルクフィブロインカプセルシェルの透過性は、分子量カットオフ法に従って分析されました。ポリエチレンイミン素層の濃度が増加すると、透過性の高いシェルを持つマイクロカプセルのコロイド安定性が増加しますが、プライム層を排除すると、透過性の低いシェル膜を持つカプセルが凝集します。ThyRS活性化中のGFPa1発現速度は、絹のマイクロカプセルにロードされたDNAプラスミドからのGFPa1遺伝子の活性化が、コントロールの非カプセル化DNAよりも高いことを明らかにしました。代表的な解析では、in vitro転写・翻訳系におけるインキュベーション前後のDNAコピー1カプセルあたり32個のDNAコピーを充填したsilk fibroinカプセルのCLSM画像を表示しています。シルクフィブロインカプセルの断面強度プロファイルは、GFPa1の発現を示しました。カプセルあたり30個のDNAコピーをロードした20層状のシルクマイクロカプセルの転写速度を、対照の非カプセル化DNAと比較しました。絹マイクロカプセルからの高出力シグナルは、同等濃度の非カプセル化DNAサンプルよりも高かったため、絹マイクロカプセルの有効性が確認されました。このプロトコールに続いて、いくつかの高解像度顕微鏡法を、固定化状態でのDNAエンタングルメントおよびin vitroでの分離遺伝子活性化プロセスの画像化に適用することができます。この手法は、最小限の人工細胞における分子レベルのダイナミクスに答えるために応用できます。具体的には、適切な遺伝子要素と組み合わせることで、マイクロカプセルは細胞間コミュニケーションの研究に使用できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。...

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

配信は、低分子干渉RNA（siRNA）の治療的実施のための主要な課題である。このプロトコルは、アルギニン及びポリエチレンイミングラフト化多孔質シリコン微粒子からなる多機能性および生体適合性siRNA送達プラットフォームの使用を含む。...

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

本発明者らは、検出可能なオフターゲット効果なしに遺伝子サイレンシングのより効率的な時空間制御のために光反応性ブロックコポリマーを使用する新規な方法を提示する。さらに、遺伝子発現の変化は、単純なsiRNA放出アッセイおよび単純な運動モデルを用いて予測することができる。...

光応答性高分子ナノキャリアからのsiRNA放出の時空間制御による遺伝子サイレンシングの予測

ここでカチオン性 nanoliposomes、ドライ フィルム法に基づいており、安全のため使用することができますの生成のためのプロトコルについて述べるし、体外の効率的な配信は、メッセンジャー RNA...

体外の効率的な配信のカチオン性 Nanoliposomes の生成は、メッセンジャー RNA を転写

本研究では、可逆添加断片化鎖伝達(RAFT)法を介したメチオニン機能性生体適合性共重合体(mBG)の調製を提示する。得られたmBGとそのトランスフェクション効率のプラスミドDNA複合能も調べられた。RAFT法は、特殊な官能基を含むモノマーを重合するために非常に有益である。...

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

ここでは、DNA 折り紙系ナノ構造天然カチオン性多糖類のキトサンと合成線形ポリエチレンイミン (LPEI) コーティングを使用して Mg 枯渇やヌクレアーゼ リッチ ・...

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

効果的な in vitro および in vivo のオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子の合成を示します。ポーラス シリコンのナノ粒子は、シェルを形成する押し出しによる融合ペプチド脂質によるコーティングの核を形成する siRNA...

合成、機能化、およびオリゴヌクレオチド配信の融合性ポーラス シリコンのナノ粒子のキャラクタリゼーション

インビトロ転写反応を調節する新規DNAつながされたT7...

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

ここでは、ポリ(βアミノエステル)ポリマーに基づいてmRNAナノ粒子を製造するための簡単なプロトコルが提示され、カプセル化されたmRNAを変更することによって容易に調整できる。また、ポリマー、ナノ粒子、およびそれらの インビトロ...

mRNAを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価

両親媒性DNAナノスターからなる合成生体分子凝縮体を、その構成DNAオリゴヌクレオチドから調製するためのプロトコールを提示します。縮合物は、単一のナノスター成分または2つの成分から産生され、埋め込まれたDNAテンプレートからのRNAの in vitro 転写を維持するように修飾されます。...

両親媒性DNAナノ構造からの合成凝縮物と細胞様構造

ここで紹介するのは、カイコ Bombyx mori...

Chitosan/dsRNAナノ粒子送達によるカイコ Bombyx mori の幼虫RNA干渉

学ぶシルクフィブロインマイクロカプセル調製法。DNAプラスミドを封入し、RNAアプタマーとリボスイッチ機能を維持する生体適合性バイオセンサーを作製。GFPa1発現を用いた遺伝子活性化動態の研究に応用可能です。

RNAアプタマーおよびリボスイッチをコードするDNAプラスミドを装填した多機能シルクベースのマイクロカプセルの調製

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