バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応

このプロトコルは、ウイルス感染に対するヒト腸上皮応答に存在する個々の細胞型を理解することを可能にする。ここでは、ヒト腸器官を播種する3つの独立した方法を提示し、感染経路が細胞の反応にどのような影響を与える可能性があるかについて説明します。我々は、カテゴリー3病原体と協力する際に尊重される必要がある生体安全規制を考慮した単一細胞RNAシーケンシング用のサンプルを調製する方法を強調する。

この方法は、他の病原体およびオルガノイド培養物に容易に適応させることができる。最も重要な考慮事項は、オルガノイドモデルが選択した播種方法と完全に区別され、ウイルス感染をサポートできることを確認することです。感染したオルガノイドを収穫する前に、マイナス80°Cから単一細胞ゲルビーズを取り除き、室温まで温めます。

また、RT試薬、還元剤B、およびRT酵素Cを室温に平衡化し、メーカーの指示に記載されているようにテンプレートスイッチオリゴを再中断します。次に、BSL-3病原体に感染した3Dオルガノイドを収集し、培養器から細胞培養プレートを取り出し、細胞培養フードに入れる。次にP1000ピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルから分化培地を取り出し、各ウェルに500マイクロリットルの氷冷PBSを加え、室温で3分間インキュベートします。

次に、細胞外マトリックス溶液を完全に破壊し、ピペットを10回上下してPBS、細胞外マトリックス、およびオルガノイドを再懸濁し、再中断されたオルガノイドを15ミリリットルの円錐管に移し、チューブを氷の上に置く。各感染状態を別々の15ミリリットル円錐形管で収集する。手袋を交換した後、チューブの外側を清掃し、細胞培養フードからチューブを取り外します。

サンプルを5分間回転させます。チューブを細胞培養フードに戻し、PBSを取り除き、チューブの底部からオルガノイドのペレットの再懸濁を避けます。次に、ペレットを解離酵素の1ミリリットルで再懸濁する。

手袋を交換し、チューブを洗浄し、30分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーション中に、チューブを10分ごとに細胞培養フードに戻し、上下にピペットを入れることによってオルガノイドを再中断します。オルガノイドが単一細胞に解離されているかどうかを判断するには、P10ピペットを使用して使い捨てプラスチックセルカウンタースライドにオルガノイド懸濁液の10マイクロリットルを入れ、透明なテープでサンプル入力ポートを密封します。

手袋を交換した後、セルカウンターの外側を清掃し、ブライトフィールド顕微鏡を使用して、単一の細胞懸濁液が作成されることを確認します。単一細胞懸濁液の確認後、10%FBSとピペットを含むDMEM F12培地を1ミリリットル加えて消化を10回停止する。その後、手袋を交換し、チューブをきれいにし、サンプルを回転させます。

遠心分離後、解離酵素を含む培地を慎重に除去し、底部の細胞ペレットを乱さないよう注意する。その後、0.1%BSAを含むPBSの最小体積の単一細胞を再中断します。大きな塊を除去するためにフィルターを通してFACSチューブに細胞懸濁液を渡した後、チューブを氷の上に置きます。

次に、マイクロリットル当たりの細胞数を決定し、使い捨てプラスチックセル計数室に10マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。次に、細胞培養フードからサンプルを取り出す前に、透明なテープでサンプル入力ポートを密封します。手袋を交換し、細胞計数チャンバーを清掃し、ブライトフィールド顕微鏡を使用して細胞の数を数えます。

次に、細胞培養フードの内部に、実験中のサンプル数に応じて、1.5ミリリットル管内にRT試薬、テンプレートスイッチオリゴ、還元剤B、RT酵素Cのマスターミックスを調製する。各サンプルについて、マスターのアリコート33.4マイクロリットルをPCRチューブに混合し、ターゲットセル数に従ってマスターミックスに細胞と水を加えます。手袋を交換した後、単一のセルコントローラを細胞培養フードに移動し、チップを準備します。

次に、チップホルダーにシングルセルチップを追加し、未使用のレーンを50%グリセロールで満たします。メーカーの指示に従ってサンプルを含むレーンにマスターミックス、ビーズ、仕切り油を追加し、ガスケットでチップをカバーします。チップをコントローラにロードしたら、プログラムを起動します。

プログラムが完了したら、チップとガスケットを取り外し、次にマルチチャネルピペットを使用して、100マイクロリットルのエマルジョンをPCRチューブを洗浄する。各エマルジョンは、完全なエマルジョンが発生したことを示す均一な白色を持っていることを確認します。手袋を交換してチューブを洗浄した後、PCRチューブをPCRマシンに移し、プログラムを開始します。

PCR の実行が終了すると、エンベロープウイルスのほとんどが不活性化されます。1日目、3日目、5日目、7日目のスプリット後のオルガノイドの代表的なブライトフィールド画像をここに示しています。平均して、オルガノイドは、中心が暗くなる週に1回分割されます。

メディア条件を変更し、Wnt-3aを除去し、R-spondinとnogginを減らすことによって、人間の腸内で見つかった細胞の複雑さを模倣することができます。通常、パネス細胞、ゴブレット細胞、および腸球に対する細胞分化には4日間の分化培地が必要である。感染したヒト大腸およびイリウム由来オルガノイドのSARS-CoV-2感染による単一細胞シーケンシングデータの分析によると、ヒト腸上皮細胞の亜集団のみが12時間および24時間後にSARS-CoV-2の感染を支持した。

SARS-CoV-2感染した大腸由来オルガノイドにおける自然免疫応答の分析は、SARS-CoV-2が感染細胞にカスケードする炎症促進シグナルを誘導し、非感染した傍観者細胞がインターフェロン媒介免疫応答を示したことを示した。さらに、単一細胞RNAシーケンシングは、感染した細胞がウイルス媒介経路の閉塞のためにインターフェロンを感知できないことを示した。オルガノイドは、よく分化し、健康でなければなりません.

これは、感染前のqPCRによる細胞分化マーカーのレベルを決定することによって制御することができる。細胞が十分に分化されていない場合、彼らはウイルス感染をサポートせず、有益な結果につながります。この技術は、私たちは、光と組織側の両方から粘膜に感染することができます。

これは、粘膜表面が使用するメカニズムを解明して、一方の側の汚れた環境と他方の無菌環境を許容することができるため、非常に重要です。