Name: バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぶBSL-3条件下でのヒト消化管オルガノイドの病原体感染と単一細胞RNAシーケンス法。この手法により、ウイルス感染に対する個々の細胞タイプの応答を詳細に解析し、宿主と病原体の相互作用を解明できます。

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メーガン・スタニファーとスティーヴ・ブーラントは、ドイツ・フォルシュングスゲコインシャフト(DFG)の研究助成金によって支えられました(プロジェクト番号240245660、 278001972、415089553、そしてスティーブ・ブーラントへの272983813とメーガン・スタニファーへの416072091、バーデン・ヴュルテンベルク州、ブンデスミニウム・フュル・ビルドゥン・ウント・フォルシュンBMBFからMSと01KI20198Aおよび(NUM-COVID 19、オルガノ・ストラット01KX202)がSBに作成された。

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<li>Hernandez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+interleukin+22+act+synergistically+for+the+induction+of+interferon-stimulated+genes+and+control+of+rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection.</a> Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).</li>
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著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

腸内病原体は、腸管の内腔に面した上端側から腸上皮細胞に感染することによって、そのライフサイクルを開始することが最も多い。オルガノイドは、腸上皮の細胞の複雑さと組織を再現するための良いモデルであるとよく認識されているが、その組織は三次元、閉じた構造として、その頭膜を病原体にアクセスできないようにする。このプロトコルは、彼らの補助側、そのそば側側、またはBLS-3病原体との両方から腸器官に感染する方法を説明した。これらのプロトコルは、以下に示すいくつかの重要なステップに従うことによって、BSL-2またはBLS-3封じ込めまたは他のオルガノイドモデルの下で任意の腸病原体を研究するために容易に適応することができる。上記の方法は、ドイツの規制に従って単細胞液滴の単離および調製を目的としている。免責事項として、このプロトコルはBSL-3条件下で作業する必要があるバイオセーフティの取り扱い措置(標準的な操作手順)を記述していません。また、他の国では規制が異なる可能性があり、すべての現地規制が尊重されるように地方自治体に連絡する必要があることを主張することも重要です。
有端感染のためにオルガノイドを2次元で播種する上で重要なステップの1つは、古典的な3次元オルガノイドとして成長したときと同様に細胞が分化することを制御することです。腸内病原体に応じて、トロピズムは非常にまれな細胞または高度に分化する必要がある細胞に制限される可能性があります。この場合、完全に分化しなかった2次元オルガノイドを使用すると、この腸内病原体は腸内オルガノイドに感染することができないという誤った結論を生じる可能性があります。可能であれば、このプロトコルの3つの構成を使用して感染を行うことが示唆されている:有端な感染症のための2Dオルガノイド(セクション2)、有端およびバソラテラ感染のための開いた3Dオルガノイド(セクション3)、およびバソラテラ感染のための完全な3Dオルガノイド(セクション3)。このアプローチは、病原体の進入経路(有端 対 バソラテラ)を識別するのに役立ち、同様のレベルの分化が達成されたことを制御します。2Dアプリカル感染の代替手段は、3Dオルガノイドを使用するが、病原体を補助側に直接送達するマイクロインジェクションである(詳細についてはBartfeldら27 を参照)。この方法は、病原体が適切に配置され、オルガノイドがそのまま残っていることを確認するために熟練した注射器を必要とします。マイクロインジェクションは、BSL-2封じ込めで一般的に使用され、BSL-3封じ込めには適さない場合があります。
2Dシードオルガノイドでの感染実験を行う場合の追加の重要な考慮事項は、最終的な細胞密度です。ステップ2.3で述べたように、100-150オルガノイドは48ウェルプレートの1つの井戸または8ウェルガラス底チャンバースライドの1つの井戸に播種されます。オルガノイドラインとオルガノイドを扱う人に応じて、これらのオルガノイドの大きさは有意に異なる場合があります。これは48ウェル版または8-wellガラス底の部屋のスライドの非常に異なった細胞密度をもたらすかもしれない。腸内ウイルスに応じて、一部のウイルスはよりまばらな細胞を好むが、他のウイルスはコンフルエント細胞に感染することもできる。異なる細胞合流のための感染性のこのような違いの分子起源は明らかではない。したがって、選択した腸病原体に最適な細胞密度を見つけることを目的としたパイロット実験は、さらに下流特性を実行する前に行われるべきである。
FACSの選別は、単細胞液滴エマルジョンを行う前に行われることが多い。このステップは、多くの場合、生細胞と単一細胞からダブレットから死んだ細胞を分離するために使用されます。BSL-3病原体を扱う場合、施設には適切なFACSソーターが装備されている必要があり、これはしばしばそうではありません。また、オルガノイド内のすべての細胞が同じサイズを持つわけではないため、多くの場合、ダブレットまたはより大きな細胞を区別することが困難であり、特定の細胞タイプに対して否定的に選択される危険性があります。また、各サンプルの5,000から10,000の間でソートに必要な時間が個々の細胞の転写プロファイルの大幅な変更をもたらす可能性があるかどうかについては、まだ現場で議論があります。単細胞シーケンシングと互換性のある細胞固定法(例えば、メタノールおよびRNAassist)が記載されているが、これがシーケンシング18の品質の低下につながることが観察された。最後に、細胞死マーカーを使用して細胞を選別することもバイアスにつながる可能性があると考えられています。クリルの先端に、クリの先端に、クリを流して放出される最も分化した細胞は、クリル軸を介した細胞の指向性増殖と分化を考えると、これらの細胞は、しばしば細胞死経路の異なるマーカー(例えば、アポトーシス、 壊死、およびネクロトーシス)に陽性である。しかし、マウス腸のロタウイルス感染を見ると、絨毛の先端が最も感染した領域28である。したがって、死のマーカーに陽性に見える細胞をフィルタリングすると、生理学的感染を表す可能性のある感染細胞の否定的な選択が生じる。現在、単一細胞シーケンシングの前にオルガノイドを選別し、固定するための良い解決策はありません。適切な代替プロトコルを見つけるためにさらなる研究が必要であるため、ライブを使用して、並べ替えられていないセルをお勧めします。
単一細胞シーケンシングは、細胞応答の評価方法に革命をもたらしています。この技術は、基底状態と病原体感染の両方で細胞系に特異的な応答を同定することを可能にする。このメソッドは、以前は一括読み出しによって制限されていた多くのフィールドでドアを開いています。この方法は非常に強力ですが、制限があります。重要な制限は、シーケンシングの下流で必要とされる広範なバイオインフォマティクス分析です。これは、組織を分析し、現在注釈がないセルタイプを割り当てる場合に特に重要です。熟練したバイオインフォマティクスを有することは、全ての単細胞研究を支援するために必要である。
このプロトコルは、ヒト腸器官を播種し、処理し、腸内病原体に感染し、scRNAeqを行う方法を記述する。オルガノイドモデルシステムは、ほとんどの臓器のために開発されているとして、他の臓器にこのアプローチを適応させることが可能になりました。肺と肝オルガノイドは腸内オルガノイドと同様に組織化されており、同様のアプローチを用いてこれらのオルガノイドに転置することができる。重要な制御は、2次元で成長するか、開いたひび割れ時に、これらのオルガノイドが3Dオルガノイドと同様の分化を達成することを検証することです。分化された状態を定義する特定の特徴と遺伝子は、各臓器モデルに固有です。腎臓および血管オルガノイドのような他のオルガノイドモデルは、大きな密な構造、単一細胞にこれらの構造を連続的に解体するための追加の方法が必要になる。

ヒト腸ウイルスに対する細胞型特異的な栄養刺激性と細胞型特異的免疫応答の研究は、ヒトの原発性細胞モデルの欠如により歴史的に困難であった。この制限は、オルガノイド1の開発に伴って部分的に根絶されました。胃腸管の場合、胃および腸のオルガノイドモデルは、ヒトおよび他のいくつかの種(例えば、ネズミ、ウシ、ネコ、コウモリ)2、3、4、5、6のために開発されている。腸器官は、ヒト腸上皮の構造アーキテクチャを再現し、陰窩および絨毛様構造、機能的な腸系統を含み、これまで知られていなかった細胞系統を同定するためにも使用されてきた。腸のオルガノイドを成長させるために2つの異なるアプローチを使用することができます。まず、クリプトを含む腸幹細胞は組織切除または生検から分離され、特定の培養条件(例えば、Wnt3A、R-spondin、Noggin、EGF)で増殖し、次いで幹細胞をほとんどの腸細胞系統(例えば、腸球、パネチ細胞、ゴブレット細胞、腸内腸切分)に分化する。この方法は、消化管のすべてのセクション(例えば、胃、十二指腸、精腸、腸管)からオルガノイドの分離を可能にする。第2の方法は、ヒトが誘導する多能性幹細胞または胚性幹細胞に依存し、その後、腸上皮細胞8に段階的なプロセスで分化される。これらの誘導幹細胞ベースのオルガノイドは、患者由来のオルガノイドと比較して、本質的により胚性であるとしばしば説明される。これらのオルガノイドモデルはすべて腸管を形成するために必要な発達的手掛かりを解明するために重要であったが、感染症研究におけるその使用はまだ初期段階にある。
腸管ウイルスは、ピコルナウイルス(例えば、EV-71)、レオウイルス(例えば、ロタウイルス)、カリシウイルス(例えば、ノロウイルス)9のような胃腸管を介して感染するすべてのウイルスをカバーする広い用語である。腸ウイルスは汚染された食物および水の摂取を通じて感染性のライフサイクルを開始し、開発途上国の人々は、未処理の廃棄物の環境への排出および感染の発症後の医療不足によるリスクが高いままにする。病原体の種類によっては、腸内膜の漏れによる胃腸炎、嘔吐、水漏れにつながる可能性があります。ヒトノロウイルスは、非常に流行し、感染性の高い腸病原体であり、世界中で6億人以上の感染と1500万人の入院につながる。オルガノイドは、ヒトノロウイルスの感染および複製をサポートするため、ノロウイルス研究の鍵となってきましたが、以前は標準的な細胞培養モデル12では培養できませんでした。
過去20年間で、コロナウイルスは主要なヒト病原体13として出現した。このファミリーには、高病原性MERS、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2が含まれており、これらのウイルスの研究を行う際に厳格な安全レベルの封じ込めが必要です。興味深いことに、これらの3つの病原体はすべて、主に誘発された呼吸器症状と苦痛のために認識されているが、これらのウイルスは気道だけでなく他の器官にも感染しないことが明らかである。呼吸困難以外の感染患者であるSARS-CoV-2に誘発される重要な病理は、胃腸症状14の存在である。SARS-CoV-2感染患者の一部は、非常に軽度から重度の下痢に至るまで、このような症状を示しています。さらに、SARS-CoV-2ゲノムは、感染した患者15の便および胃腸管生検で検出することができる。重要なことに、胃腸症状の存在は、MERSおよびSARS-CoV-1感染患者においても観察されたSARS-CoV-2に限定されない。SARS-CoV-2が消化管苦痛を誘発し、消化管内のSARS-CoV-2のトロピズムを正確に同定する方法を理解するために、ヒト腸器官は重要なツールであり、現在この病原体16,17に対する細胞型特異的応答を解明するために利用されている。
細胞集団の転写プロファイリング(バルクRNAシーケンシング)は、オルガノイドと同様に不死化細胞株の両方の病原体感染を評価する際に標準的な習慣であった。これにより、病原体(サイトカインのアップレギュレーションなど)に対応して世界的な変化を判断することができますが、バルクRNAseqは、集団内の特定の細胞が他の細胞よりも感染しやすい理由を判断することを可能にしません。単細胞RNAシーケンシング(scRNAeq)は、細胞系分別転写プログラムを解明する強力なツールとなっており、これらのプログラムがウイルス感染をサポートまたは抑制する方法を決定するために使用することができる18,19。scRNAeqの最初の説明は2009年であり、マウスブラストミア20に見られる異なる細胞の転写プロファイルを評価するために使用された。これらのテクノロジは現在拡張され、複数の異なるプラットフォームを通じて実装できます。この技術の初期のバージョンでは、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を使用してシーケンシング用の個々の細胞を分離し、96-または384ウェルプレートに制限されることが多く、これにより、サンプル21あたり300個の細胞を分析する。これらの方法は、ビーズを含むバーコードを含む個々の液滴に単一の細胞をカプセル化するためにマイクロ流体デバイスを使用する単一細胞シーケンシングプラットフォームによって進められている。この技術により、サンプル条件ごとに最大10,000個の細胞をキャプチャできます。
オルガノイド技術とscRNAEqを組み合わせることで、腸内病原体が細胞型特異的な方法で胃腸管にどのような影響を与えるかを研究することができます。ただし、技術的およびバイオセーフティに関する考慮事項を考慮する必要があります。まず第一に、古典的なオルガノイド培養方法(3次元(3D)オルガノイドは、細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた)、表皮細胞のバソラショナル側をオルガノイドの外側に露出させる。腸内病原体が汚染された食物/水の摂取によって感染を開始するにつれて、感染は最も頻繁にこれらの3D腸器官ではアクセスできない細胞の有端側から開始される。したがって、オルガノイドは、2D播種を介して、直接細胞の補助側を露出、またはマイクロインジェクション22、23を介して、病原体感染のために有端側をアクセス可能にする準備が必要である。第二に、感染した生体試料のscRNAeqを行うためには、それらの感染性を考慮することが重要である。その後のRNAEqに対する単細胞分離の前に細胞を固定し、病原体を不活性化する方法が提案されているが、これらの方法はしばしばシーケンシング品質18の低下を招く。以下のプロトコルは、感染側(経腸対バソララル感染)を考慮した腸内ウイルスに腸内オルガノイドを感染させるいくつかのアプローチを説明する(図1)。さらに、このプロトコルには、scRNAEqの高病原性ウイルスに感染したオルガノイドから単一細胞を解離および分離するワークフローが含まれる。このプロトコルは、エアロゾルの発生や汚染の可能性を避けるために、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の封じ込め条件下で作業する際に実装する必要がある重要なステップを強調します。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;組換えマウス noggin</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル非細胞培養処理プレート</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルガラス底チャンバースライド</td><td>iBIDI</td><td>Cart#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Controller &Next GEM Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>シングルセル溶液の調製およびゲルビーズインエマルジョン(GEM)の調製に使用</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G シングルセルキット</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>シングルセル溶液の調製およびゲルビーズインエマルジョン(GEM)の調製に使用</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Single Cell 3&prime;キットv3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>単一細胞溶液の調製およびゲルビーズインエマルジョン(GEM)の調製に使用</td></tr>ヒト<tr><td>胎盤からのコラーゲン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A forward</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>プライマー 分化チェックに使用</td></tr><tr><td>CYP3A4 逆</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>分化チェックに用いたプライマー</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 カウンティングスライド</td><td>バイオシグマ</td><td>キャット# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>胎児 Bovein Serum (FBS)</td><td>山羊座</td><td>キャット#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>キャット# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>この細胞株は、Wnt 3A、R-Spondin、Nogginを含むコンディショニング培地を作るために使用されます。コンディショニングされた培地の製造に関するプロトコルは、manufacteruresのサイトでご覧いただけます。</td></tr><tr><td>マトリゲル。GFR, LDEV free</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 フォワード</td><td>ユーロフィン</td><td>TGTAGGCATCGCTCTTCTCA</td><td>分化チェックに使用</td></tr><tr><td>MUC-2 リバース</td><td>ユーロフィン</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>分化チェックに使用</td></tr><tr><td>N-アセチル-システイン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 フォワード</td><td>ユーロフィン</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>分化をチェックするために使用されるプライマー</td></tr><tr><td>OLMF4 逆</td><td>ユーロフィン</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>分化をチェックするために使用されるプライマー</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF 基本的な</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IGF-1</td><td>BioLegend</td><td>Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス EGF</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI フォワード</td><td>ユーロフィン</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>プライマー 分化のチェックに使用</td></tr><tr><td>SI リバース</td><td>ユーロフィン</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>プライマー 分化のチェックに使用</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>カタログ#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>ケイマンケミカル</td>ズ <td>Cat#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

バイオセーフティレベル3(bsl-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

ヒト腸器官は、消化管の病原体感染を研究するのに最適な細胞モデルを構成する。これらのオルガノイドは、消化管のすべてのセクション(胃、十二指腸、十二指腸、結腸、直腸)から誘導され、分化時に、各個々のセクションに自然に見られる細胞タイプのほとんどを含むことができる。例えば、腸管オルガノイドは、栄養吸収エンテロサイト、分泌細胞(ゴブレット、パネス、および腸内分泌)、幹細胞、ならびにすべての系統特異的分化中間体(初期または未熟な細胞タイプ)を含む。消化管由来のオルガノイドを使用して感染症を研究する最大の利点は、腸内病原体が標的とする細胞型を正確に特定し、胃腸管の異なる切片とその特定の細胞型が同様に病原体の課題に対応するかどうかに対処する可能性である。過去数年間、胃腸モデルは、他の組織からのオルガノイドと同様に、ウイルス性の栄養と病因のメカニズムを研究するために採用されてきました。しかし、高病原性ウイルスを使用する際にオルガノイドを使用することの利点をすべて利用することは技術的な課題であり、厳格なバイオセーフティの考慮事項が必要です。さらに、オルガノイドは3次元で成長することが多いため、細胞のバソラショナル側はオルガノイドの外側に向き、その補助側はオルガノイドの内側(内腔)に向いています。この組織は、多くの腸内感染が摂取後に細胞の有端/明るい側から開始するので、腸内病原体にとって課題となっています。以下の原稿は、ヒト腸器官を腸内病原体に感染させる準備をするための包括的なプロトコルを提供する。この方法は、オルガノイドの調製と、バイオセーフティレベル3(BSL-3)の封じ込め条件下でこの作業を行うために必要な考慮事項を詳述する。

単細胞シーケンシング用オルガノイドの調製 単一細胞のシーケンシング結果は、良質の細胞を使用することに大きく依存しています。オルガノイドの品質を確保するために、オルガノイドを適切に維持し、分割する準備ができている時期を決定するために、毎日観察する必要があります(図2)。オルガノイドを分割するタイミングはドナー依存です。一部のドナーはより迅速に成長し、5日ごとに分割する必要がありますが、他のドナーは遅く、10日ごとに分割する必要があります。平均して、オルガノイドは、中心が暗くなるときに週に1回分割されます(図2B)。オルガノイドが大きくなりすぎて、中央に死んだ細胞が多すぎると、オルガノイドは死んでしまいます。
オルガノイドは、Wnt3Aの量が多いメディアで維持されます。これは幹細胞ニッチをサポートし、成長し、増殖し続けるためにオルガノイドを促進します。これらの成長条件下では、オルガノイドには大量の幹細胞とトランジット増幅細胞が含まれ、成熟した腸球、ゴブレット細胞、腸内分泌細胞などの分化された細胞集団が少ない。しかし、ヒトの腸内で見られる細胞の複雑さを模倣するには、細胞分化を推進し、これらの細胞の多くを産生することが重要である。これは、メディア条件を変更し、Wnt3Aを削除し、R-SpondinとNogginを減らすことによって達成されます(表1)。通常、腸球、ゴブレット細胞、および腸内分泌細胞に対する細胞分化は、4日間分化培地を必要とする(図3)。良い差別化を得ることが重要です。そうでない場合は、病原体のトロピズムと細胞型特異的応答の評価が困難になります。
BSL-3病原体の不活性化の確認 完全な不活性化は、選択した病原体と確認し、BSL-3からcDNAを除去しても安全であることを検証する必要があります。SARS-CoV-2の場合、ウイルスの完全な不活性化は、SARS-CoV-2の100 μLを取り、85°Cで5分間PCRマシンでインキュベートすることによって検証されました。 その後、ウイルスをナイーブVero細胞に戻し、ウイルス感染を24時間、48時間、および72時間の感染後の免疫蛍光およびプラークアッセイによって非熱処理ウイルスと比較し、すべての粒子が感染しなくなったことを確認した。これらの結果は、地元の規制機関に送信され、その承認に応じて、単一細胞実験とcDNA処理が行われました。
単一セルのシーケンスの結果 SARS-CoV-2がヒト結腸およびイレナムオルガノイドに感染する方法を評価するために、単一細胞シーケンシングを行った。オルガノイドは上述のように調製し、SARS-CoV-2による有端感染を可能にする2D形式で感染した。感染細胞は、感染後12時間および24時間で採取し、上記のように単細胞シーケンシング用に処理した。単一細胞シーケンシングデータの解析により、ヒト腸上皮細胞の亜集団(未熟腸球2)のみがSARS-CoV-2の感染を支持していることを判断することができた(図4)。さらに、集団内のすべての細胞が感染したわけではないので、感染した細胞と非感染した傍観者細胞の両方を分析した(図5)。これらの結果は、SARS-CoV-2が感染細胞に伝播する炎症促進シグナルを誘導し、非感染した傍観者細胞がインターフェロン媒介免疫応答を示したことを示した。さらに、scRNA-Seqは、感染した細胞がウイルス媒介経路の閉塞によるインターフェロンを感知できないことを示した(図5)。バルクRNAシーケンシングを使用する場合、この情報を得ることができませんでした。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg"> 図1:腸内病原体に感染するためにヒト腸器官を準備する3つの異なる方法を描いた概略図。 有限性感染症は、腸内オルガノイドを2Dで播種することによって達成することができる。3Dオルガノイドを破壊することによって、有端およびバソララル感染を行うことができる。最後に、バソラテラのみの感染は、無傷の3D腸器官に感染することによって行うことができる。これらの各メソッドを使用して、単一セルのシーケンスのサンプルを生成できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg"> 図2:オルガノイド維持回路図と代表的な明視野画像( A)ヒト腸器官の維持及び通過のための概略図(B) 1 日、3 日目、5 日目、7 日目のスプリット後の明視野画像を表します。7日目までに、オルガノイドは死んだ細胞の蓄積のために大きくて暗くなり、分割する準備ができています。スケールバーは25 μmを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg"> 図3:ヒト腸器官の代表qPCRは分化培地への切り替え後4日後に行った。 腸管オルガノイドは、成長培地で維持されたか、または4日間分化培地に切り替えた。RNAを採取し、幹細胞(OLFM4)、パネス細胞(LYZ)、ゴブレット細胞(MUC2)、および腸球(SI)のマーカーに対してqPCRを行った。N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg"> 図4: SARS-CoV-2に感染した細胞集団の同定ヒト結腸およびイリウム由来オルガノイドは、SARS-CoV-2に感染した。12時間および24時間後に、感染後の細胞を採取し、単細胞RNAシーケンシングを行い、SARS-CoV-2感染を支持した細胞集団を同定した。ウイルス感染は時間の経過とともに増加し、主に未熟な腸球2に感染することが判明した。この図は、Trianaら19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg"> 図5: 本来の自然免疫応答の決定ヒト結腸由来オルガノイドはSARS-CoV-2に感染した。12および24時間後に、感染後の細胞を採取し、単一細胞RNAシーケンシングを行い、ウイルス感染細胞および非感染性の傍観者細胞の両方における本質的な自然免疫応答を決定した。SARS-CoV-2感染細胞は強い炎症反応を示し、非感染した傍観者細胞はインターフェロン媒介応答を示した。トリアナら19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">成長メディア</td>
		</tr>
<tr>
<td>化合物</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>広告 DMEM/F12</td>
			<td>グルタマックス (1X)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+グルタマックス</td>
			<td>ヘペス 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ヘペス</td>
			<td>ペン 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>ストレップ 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-WRN</td>
			<td>ボリュームで50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-アセチルシステイン</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>IGF-1</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF 基本</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガストリン</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">差別化メディア</td>
		</tr>
<tr>
<td>化合物</td>
			<td>最終濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>広告 DMEM/F12</td>
			<td>グルタマックス (1x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+グルタマックス</td>
			<td>ヘペス 1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ヘペス</td>
			<td>ペン 10 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>+P/S</td>
			<td>ストレップ 10 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-アセチルシステイン</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-スポンディン</td>
			<td>ボリュームで5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>頭</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ガストリン</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>A83-01</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:成長および分化媒体のためのメディア構成

このプロトコルは、単一細胞RNAシーケンシング(scRNAEq)技術を用いて、単細胞レベルで宿主/病原体相互作用を特徴付けるために、彼らの補助的またはバソラターレ側からヒト腸器官に感染する方法を説明する。

バイオセーフティレベル3(BSL-3)条件下での病原体感染と単一細胞シーケンシングに対する消化管オルガノイドの適応

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

このプロトコルは、ウイルス感染に対するヒト腸上皮応答に存在する個々の細胞型を理解することを可能にする。ここでは、ヒト腸器官を播種する3つの独立した方法を提示し、感染経路が細胞の反応にどのような影響を与える可能性があるかについて説明します。我々は、カテゴリー3病原体と協力する際に尊重される必要がある生体安全規制を考慮した単一細胞RNAシーケンシング用のサンプルを調製する方法を強調する。この方法は、他の病原体およびオルガノイド培養物に容易に適応させることができる。最も重要な考慮事項は、オルガノイドモデルが選択した播種方法と完全に区別され、ウイルス感染をサポートできることを確認することです。感染したオルガノイドを収穫する前に、マイナス80°Cから単一細胞ゲルビーズを取り除き、室温まで温めます。また、RT試薬、還元剤B、およびRT酵素Cを室温に平衡化し、メーカーの指示に記載されているようにテンプレートスイッチオリゴを再中断します。次に、BSL-3病原体に感染した3Dオルガノイドを収集し、培養器から細胞培養プレートを取り出し、細胞培養フードに入れる。次にP1000ピペットを使用して、24ウェルプレートの各ウェルから分化培地を取り出し、各ウェルに500マイクロリットルの氷冷PBSを加え、室温で3分間インキュベートします。次に、細胞外マトリックス溶液を完全に破壊し、ピペットを10回上下してPBS、細胞外マトリックス、およびオルガノイドを再懸濁し、再中断されたオルガノイドを15ミリリットルの円錐管に移し、チューブを氷の上に置く。各感染状態を別々の15ミリリットル円錐形管で収集する。手袋を交換した後、チューブの外側を清掃し、細胞培養フードからチューブを取り外します。サンプルを5分間回転させます。チューブを細胞培養フードに戻し、PBSを取り除き、チューブの底部からオルガノイドのペレットの再懸濁を避けます。次に、ペレットを解離酵素の1ミリリットルで再懸濁する。手袋を交換し、チューブを洗浄し、30分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーション中に、チューブを10分ごとに細胞培養フードに戻し、上下にピペットを入れることによってオルガノイドを再中断します。オルガノイドが単一細胞に解離されているかどうかを判断するには、P10ピペットを使用して使い捨てプラスチックセルカウンタースライドにオルガノイド懸濁液の10マイクロリットルを入れ、透明なテープでサンプル入力ポートを密封します。手袋を交換した後、セルカウンターの外側を清掃し、ブライトフィールド顕微鏡を使用して、単一の細胞懸濁液が作成されることを確認します。単一細胞懸濁液の確認後、10%FBSとピペットを含むDMEM F12培地を1ミリリットル加えて消化を10回停止する。その後、手袋を交換し、チューブをきれいにし、サンプルを回転させます。遠心分離後、解離酵素を含む培地を慎重に除去し、底部の細胞ペレットを乱さないよう注意する。その後、0.1%BSAを含むPBSの最小体積の単一細胞を再中断します。大きな塊を除去するためにフィルターを通してFACSチューブに細胞懸濁液を渡した後、チューブを氷の上に置きます。次に、マイクロリットル当たりの細胞数を決定し、使い捨てプラスチックセル計数室に10マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。次に、細胞培養フードからサンプルを取り出す前に、透明なテープでサンプル入力ポートを密封します。手袋を交換し、細胞計数チャンバーを清掃し、ブライトフィールド顕微鏡を使用して細胞の数を数えます。次に、細胞培養フードの内部に、実験中のサンプル数に応じて、1.5ミリリットル管内にRT試薬、テンプレートスイッチオリゴ、還元剤B、RT酵素Cのマスターミックスを調製する。各サンプルについて、マスターのアリコート33.4マイクロリットルをPCRチューブに混合し、ターゲットセル数に従ってマスターミックスに細胞と水を加えます。手袋を交換した後、単一のセルコントローラを細胞培養フードに移動し、チップを準備します。次に、チップホルダーにシングルセルチップを追加し、未使用のレーンを50%グリセロールで満たします。メーカーの指示に従ってサンプルを含むレーンにマスターミックス、ビーズ、仕切り油を追加し、ガスケットでチップをカバーします。チップをコントローラにロードしたら、プログラムを起動します。プログラムが完了したら、チップとガスケットを取り外し、次にマルチチャネルピペットを使用して、100マイクロリットルのエマルジョンをPCRチューブを洗浄する。各エマルジョンは、完全なエマルジョンが発生したことを示す均一な白色を持っていることを確認します。手袋を交換してチューブを洗浄した後、PCRチューブをPCRマシンに移し、プログラムを開始します。PCR の実行が終了すると、エンベロープウイルスのほとんどが不活性化されます。1日目、3日目、5日目、7日目のスプリット後のオルガノイドの代表的なブライトフィールド画像をここに示しています。平均して、オルガノイドは、中心が暗くなる週に1回分割されます。メディア条件を変更し、Wnt-3aを除去し、R-spondinとnogginを減らすことによって、人間の腸内で見つかった細胞の複雑さを模倣することができます。通常、パネス細胞、ゴブレット細胞、および腸球に対する細胞分化には4日間の分化培地が必要である。感染したヒト大腸およびイリウム由来オルガノイドのSARS-CoV-2感染による単一細胞シーケンシングデータの分析によると、ヒト腸上皮細胞の亜集団のみが12時間および24時間後にSARS-CoV-2の感染を支持した。SARS-CoV-2感染した大腸由来オルガノイドにおける自然免疫応答の分析は、SARS-CoV-2が感染細胞にカスケードする炎症促進シグナルを誘導し、非感染した傍観者細胞がインターフェロン媒介免疫応答を示したことを示した。さらに、単一細胞RNAシーケンシングは、感染した細胞がウイルス媒介経路の閉塞のためにインターフェロンを感知できないことを示した。オルガノイドは、よく分化し、健康でなければなりません.これは、感染前のqPCRによる細胞分化マーカーのレベルを決定することによって制御することができる。細胞が十分に分化されていない場合、彼らはウイルス感染をサポートせず、有益な結果につながります。この技術は、私たちは、光と組織側の両方から粘膜に感染することができます。これは、粘膜表面が使用するメカニズムを解明して、一方の側の汚れた環境と他方の無菌環境を許容することができるため、非常に重要です。

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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