光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

このプロトコルは、細胞核の個々の機械的特性を解剖し、細胞の偏光、分化、および移動のための機械的ゲージにします。この技術の主な利点は、機械的特性を測定し、膜または皮質細胞骨格の外部摂動なしに細胞下コンパートメントに力を加えることができるということです。このプロトコルは、異なる細胞株や動物モデルの核力学を研究するために、他の生物の他の細胞内のビーズを操作するために容易に適応することができる。

直接力センサーの位置合わせは、光トラップを作成し、残すすべての光をキャプチャするために重要です。これは、細胞の粘弾性媒体で正確な光運動量測定を保証します。プラスチック製のパスツールピペットを使用してE3培地を含むガラス皿に球ステージ胚を受精後4時間置くことによって、単細胞調製を開始する。

次に、ビーズに陽性である胚を選択し、mRNA注射の場合には蛍光タンパク質を発現する。鉗子を使用して手動で胚を減色させ、ガラス製のパスツールピペットの助けを借りて約10〜15個のデクリオン化胚を1.5ミリリットルの反応容器に移します。チューブからE3培地を取り出し、500マイクロリットルの事前温め付き二酸化炭素非依存組織培養培地を添加します。

気泡の形成を避けてチューブを穏やかに振り、細胞が目に見える大きな塊を持たない解離するので、チューブの内容物が濁るようにします。その後、チューブを200倍Gで3分間遠心する。遠心分離後、上清を取り除き、ペレットを採取して細胞染色を進める。

核にラベルを付けるには、作製したDNAHoechst色素染色液をチューブに500マイクロリットル加えて細胞を再懸濁させる。暗い中で7分間、染色した細胞をインキュベートします。次に、先に述べたように細胞を遠心分離し、懸濁液中のサンプルの場合は50マイクロリットルのDMEMまたは20マイクロリットルのDMEMでペレットを再懸濁させる。

懸濁液中の細胞を用いた実験のための光学トラップまたはOTチャンバーの調製のために、中央に約10ミリメートルで10ミリメートルの正方形の穴を持つ両面スコッチテープの一部を切断する。テープの保護層の1つを剥がし、テープの覆い隠された側を1.5Hガラス底皿の中央に置きます。テープを軽く押して、気泡を避けながらテープの表面をすべてガラスに貼り付け、テープの残りの保護層を剥がします。

1ミリリットルあたり0.5ミリグラムで100マイクロリットルのコンカナリアニンAで表面を30分間インキュベートします。その後、コンカナリンAのドロップを削除し、DMEMで表面をすすいでください。細胞を含む溶液の30マイクロリットルをキャビティ表面に加えます。

その後、22 22ミリメートルのカバーガラスで非常に穏やかにチャンバーを閉じます。必要に応じてメスや鉗子を使用してください。次に、光ピンセットの起動に向けて、出力電力の安定性を最適化するために、実験の前に少なくとも30分間、レーザーをかなり高い電力でオンにします。

完了したら、光学マイクロ操作と力測定ユニットの電子モジュールをオンにします。光学力センサーを位置合わせする前に、60X 1.2の水浸し目的に水滴を置き、細胞を含むチャンバーをステージ上に置きます。細胞サンプルが置かれるチャンバの下面に焦点を合わせます。

カバーガラススライドの上に液浸油の液滴をサンプルを覆う後、オイル液滴に接触するまで力センサユニットの集水レンズを下げる。光学力センサーの位置合わせの標準的な手順に従って、AT の位置を決めるために使用される補助カメラのサンプルプレーン画像を見てから、そのフィールド停止がサンプル平面に結合されて表示されるまで光学力センサーを下げます。ベルトランレンズで気泡を確認するには、補助カメラを通して撮像経路を観察します。

汚れや気泡が見える場合は、説明したように手順を繰り返す前に、レンズとチャンバーをダストフリーレンズ組織で洗浄し、浸漬油を追加します。光学力センサーのホルダーに置かれた横ねじを使用して、視野停止を視野の中に中央に配置します。精度を高めるには、ほぼフィールドストップを開いて、補助カメラに表示される視野を占有します。

試料を顕微鏡に配置し、光学力センサを位置合わせした後、核の剛性や細胞間構造が不明な場合は、回転半波板を使用して初期トラップパワーを200ミリワットに設定する。完了したら、顕微鏡ステージソフトウェアコントローラを使用して、送信されたBrightfield顕微鏡を介して1つまたは2つのビーズを持つセルを探します。数値シートに、その後の軌道ステップの変位と時間を書き込みます。

あるいは、補助材料からテーブルS1をロードする。応力/緩和実験では、台形荷重を適用するようにプログラムします。OTソフトウェアで、光トラップをアクティブにします。

マイクロスフィアをトラップするには、イメージプレーンを顕微鏡ステージソフトウェアコントローラでビーズの少し上に設定します。校正された補助カメライメージングウィンドウでポリスチレンマイクロビーズをクリックします。オプティカルトラップによるビードの閉じ込めに成功すると、ビーズの動きが強く低下します。

ビーズをクリックして細胞質を横切ってドラッグし、核エンベロープから約2ミクロンの距離に置きます。ビードのインデントが核膜に対して垂直になるように、軌跡が設定されていることを確認します。セットアップの準備ができたら、イメージングソフトウェアに移動し、取得ボタンをクリックして画像取得を開始します。

リアルタイムの強制読み取りウィンドウを開き、データをクリックして、リアルタイムの強制読み取りウィンドウで保存して保存します。トラップ位置を開始し、測定データを強制します。ビードを右クリックし、開始軌道を選択して、以前にロードされた軌道を開始します。

軌道が終了し、システムが安定するまで待ってから、トラップフォース測定データの記録を終了します。画像取得を停止し、後処理ソフトウェアで結果をプロットします。代表的な分析では、核に近い単一の微小球を有する単一のゼブラフィッシュ前駆細胞が表示される。

胚内部の注射後5時間のポリスチレン微小球の分布をモニタリングした。ブライトフィールドと蛍光画像は、ビーズが胚組織全体に分散していることを示しています。同じ領域における共焦点蛍光Z-スタックの最大投影とサブスタックの最大投影は、深部の細胞の大部分が1~2個のビーズを含んでいたことを確認します。

受精後24時間で、ビーズは胚の全身に分布した。1つまたは2つの注入ビーズを有する閉じ込められた細胞上の懸濁細胞のブライトフィールド顕微鏡写真が得られた。さらに、複数の蛍光標識により、核間膜、原形質膜、DNA、トランスジェニックラインなどの細胞のさまざまな側面の調査が容易に行なわれています。

代表的なスナップショットは、光学的に閉じ込められた微小球でインデントの5秒前/中および5秒後にHoechst標識核を記述した。浮遊細胞および閉じ込められた細胞のインデント実験の間に核の遠位および近位の境界の3つの異なるフレームおよび軌道のためのインデントセグメントに沿った強度プロファイルを研究した。繰り返し核のインデント実験の間に光学的に閉じ込められた微小球によって経験された閉じ込められた軌道および力を測定した。

懸濁液および閉じ込め中の細胞の核力学は、閉じ込めが予想面積の拡大と核剛性の有意な変化をもたらしたことを確認した。ビーズが1つの細胞段階の胚に注入された場合、それらはおそらく後の段階で均等に分配される。ビーズは安定して閉じ込められなければならないことを覚えておいてください。

ビードがオプティカルトラップをエスケープする場合は、軌道を再定義するか、レーザーパワーを増加させます。これらの実験は、1つの細胞内の複数のマイクロビーズに簡単に行われ、アクティブなマイクロロジー測定まで拡張することができます。