Name: 短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶ 尿細菌の完全ゲノムアセンブリ法。Unicyclerを用いたハイブリッドデノボアセンブリで、コード不要で環状染色体とプラスミドを解明し、抗菌薬耐性遺伝子と定着因子を同定します。

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ムウテ・ジュバイダ・イスラム博士とルーク・ジョイス博士がこの議定書に貢献してくれたことに感謝します。また、テキサス大学ダラスゲノムセンターのフィードバックとサポートを認めたいと思います。この作品は、ウェルチ財団、N.J.D.への賞番号AT-2030-20200401、国立衛生研究所、K.P.への賞番号R01AI116610、フェレシアとジョン・ケイン女性の健康の議長によって資金提供されました。

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<li>Greig, D. R., Dallman, T. J., Hopkins, K. L., Jenkins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+bacterial+antibiotic+resistance+determinants+in+a+multidrug-resistant+strain+of+enteroaggregative+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomics%22%5BJournal%5D)">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of bacterial antibiotic resistance determinants in a multidrug-resistant strain of enteroaggregative Escherichia coli.</a> Microbial Genomics. 4 (10), 000213(2018).</li>
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<li>Couvin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRCasFinder%2C+an+update+of+CRISRFinder%2C+includes+a+portable+version%2C+enhanced+performance+and+integrates+search+for+Cas+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CRISPRCasFinder, an update of CRISRFinder, includes a portable version, enhanced performance and integrates search for Cas proteins.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 246-251 (2018).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する包括的なハイブリッドゲノムアセンブリプロトコルは、多様な尿中微生物叢および泌尿器病者の培養を成功させ、そのゲノムの完全な組み立てのための合理化されたアプローチを提供する。細菌ゲノムの成功したWGSは、ゲノムDNAを抽出するために、多様で時には潔癖性の微生物の単離から始まります。現在までに、既存の尿培養プロトコルは、多くの尿種を検出するために必要な感受性を欠いているか、または長時間および資源11を必要とする長く広範なアプローチを伴う。記載されている改変性尿培養アプローチは、潜在的に病原性または有益なコメンス種を含む17の一般的な尿属に属する細菌の正常な単離のための簡素化された包括的なプロトコルを提供し、両方の好気性または嫌気性細菌を含む。これは、細菌ゲノムの正確なシーケンシングと組み立て、および尿の健康と病気の理解に貢献する重要な石体実験に必要な出発物質を提供します。さらに、この修飾された培養アプローチは、尿検体に含まれる生存微生物のより明確な臨床診断を提供し、将来のゲノム研究のためにバイオバンキングを可能にする。ただし、このプロトコルは制限がないわけではありません。生物によっては長いインキュベーション時間が必要な場合があり、低酸素室や制御インキュベーターなどのリソースを使用する必要があり、容易に入手できない場合があります。嫌気性のGasPaksの使用は代替の解決を提供するが、これらは高価であり、常に持続的で制御された環境を作り出さない。最後に、培養バイアスとサンプルの多様性は、特定の生物や泌尿器病原体が潔癖性細菌を上回ることを可能にする可能性があります。これらの制限にもかかわらず、多様な尿細菌の培養はこのアプローチによって可能になります。
ゲノムシーケンシングは、シーケンシングデータ14,15の歩留まりと精度の両方を飛躍的に向上させた次世代シーケンシング技術の進歩に伴って人気を集めています。データ処理とデノボアセンブリのためのアルゴリズムの開発と相まって、完全なゲノム配列は、初心者や専門家の科学者の指先にある15、45。完全なゲノムによって提供される全体的なゲノム組織の知識は、遺伝子の重複、遺伝子喪失、および水平遺伝子導入14を含む重要な進化的および生物学的洞察を提供する。さらに、抗菌性および毒性に重要な遺伝子は、しばしば移動要素に局在し、一般に、ゲノムドラフトアセンブリ15,16では解決されない。
本明細書のプロトコルは、完全なゲノムアセンブリを生成するための短読み取りおよび長期読み取りプラットフォームからのシーケンシングデータの組み合わせのためのハイブリッドアプローチに従う。尿細菌ゲノムに焦点を当てる一方で、この手順は、様々な分離源からの多様な細菌に適応することができる。このアプローチの重要なステップは、適切な滅菌技術に従い、純粋な尿細菌の単離のための適切な培地および培養条件を利用することを含む。さらに、無傷で高収率のgDNAの抽出は、組み立て成功を妨げる可能性のある汚染読み取りを含まないシーケンシングデータを生成するために不可欠です。その後のライブラリ準備プロトコルは、十分な長さと深さの品質読み取りの生成に不可欠です。したがって、この技術の最大の利点は理論的な上限制限のない長い読み取りの生成であるため、特に、長期読み取りシーケンシングのためのライブラリの準備中にgDNAを注意して扱うことは非常に重要です。また、騒がしいデータを排除し、アセンブリの結果を改善するシーケンシング読み取りの適切な品質管理(QC)のセクションも概説されています。
DNAの分離、ライブラリーの調製、およびシーケンシングが成功したにもかかわらず、いくつかの種のゲノムアーキテクチャの性質は、依然として閉じたゲノムアセンブリ45,46の生成に障害を与える可能性がある。繰り返しシーケンスはアセンブリの計算を複雑にする場合が多く、長い読み取りデータにもかかわらず、これらの領域は信頼度が低い場合やまったく解決されない場合があります。したがって、長い読み取りは、ゲノムまたはカバレッジの最大のリピート領域よりも平均して長くなければなりません(>100x)19 。不完全なままで、完成するために手作業でアプローチが必要なゲノムもあります。それにもかかわらず、ハイブリッド組み立てられた不完全なゲノムは、通常、短読のドラフトゲノムよりも少ないコンティグで構成される。アセンブリアルゴリズムのデフォルトパラメータを調整するか、読み取りQCのより厳しいカットオフに従うと役立つ場合があります。あるいは、推奨されるアプローチとして、最も可能性の高いアセンブリパスの証拠を求めて、長い読み取りを不完全な領域にマッピングし、増幅領域のPCRおよびサンガーシーケンシングを利用したパスを確認する方法があります。Minimap2を使用した読み取りのマッピングが推奨され、包帯は、コンティグリンケージ47の証拠を提供する組み立てられたコンティグに沿ってマッピングされた読み取りを視覚化するための便利なツールを提供します。
完全なゲノムを生成するための追加の課題は、コマンドラインツールを使った親しみやすさと快適さにあります。多くのバイオインフォマティクスツールは、あらゆるユーザーに計算の機会を提供するために開発されています。ただし、UNIX とプログラミングの基本を理解する必要があります。このプロトコルは、以前のコマンドライン経験のない個人が閉じたゲノムアセンブリを生成し、それらにアコージンを付けるための十分に詳細な指示を提供することを目的としています。

尿マイクロバイオームは、尿路が健康な個人で無菌であるという数十年にわたる誤解を打ち砕いた研究の新興分野です。尿中微生物叢のメンバーは、尿環境のバランスをとり、尿路感染症(UTI)1、2を予防するのに役立ちます。泌尿器病原性細菌は尿路に侵入し、生体内微生物叢を置き換え、尿路上皮を植民地化し、免疫応答を回避し、環境圧力3,4に対抗する多様な病原性メカニズムを採用する。尿は、高い浸透性、限られた窒素と炭水化物の可用性、低酸素化、および低pH5、6、7によって特徴づけられる比較的栄養が限られた媒体である。尿はまた、抗菌性であると考えられ、ヒトカテリシジンLL-378のような高濃度の阻害性尿素および抗菌ペプチドから構成される。尿路の健康を理解し、UTI治療のための新しい戦略を開発するためには、尿路を植民地化するために、常駐細菌と泌尿器病原体の両方で採用されているメカニズムを調査することが重要です。さらに、第一線の抗菌療法の不全がより一般的になるにつれて、尿細菌9,10の集団内で抗菌性決定基を担う移動性遺伝要素の普及を監視することがますます重要になっている。
尿細菌の遺伝子型や型を調べるには、その培養の成功とその後の全ゲノムシーケンシング(WGS)が不可欠です。培養依存的な方法は、尿サンプル11中の生き生き微生物を検出し同定するために必要である。標準的な臨床尿培養は、5%の羊の血液寒天(BAP)とマッコンキー寒天に尿をめっきし、24時間12のために35°Cで好気的にインキュベートすることを含む。しかし、検出閾値≥105 CFU/mL13では、尿中微生物叢の多くのメンバーはこの方法では報告されない。強化された定量尿培養(EQUC)11などの改善された培養技術は、標準的な尿培養によって一般的に見逃される微生物を同定するために、異なる尿量、インキュベーション時間、培養培地、大気条件の様々な組み合わせを採用しています。このプロトコルに記載されているEQUCの改変版は、ここで修正された強化尿培養プロトコルと呼ばれ、選択的培地および最適な大気条件を使用して多様な尿細菌および泌尿器病原体の培養を可能にするが、本質的には定量的ではない。尿細菌の分離に成功すると、下流のWGSおよびゲノムアセンブリのゲノムDNA(gDNA)の抽出が可能になります。
ゲノムアセンブリは、特に完全な集合体であり、居住微生物叢および泌尿病原性細菌の両方の間でコロニー形成、ニッチ維持、および病原性に寄与し得る遺伝的要因の発見を可能にする。ドラフトゲノムアセンブリには、シーケンスエラーを含み、オリエンテーション情報が不足している連続配列(コンティグ)が多様に含まれています。完全なゲノムアセンブリでは、すべてのベースペアの向きと精度の両方が14.さらに、完全なゲノム配列を得て、ゲノム構造、遺伝的多様性、および移動遺伝子要素15に関する洞察を提供する。短い読み取りだけでは重要な遺伝子の有無を特定するが、ゲノムコンテキスト16を特定できない場合がある。オックスフォードナノポアやPacBioなどの長期読み取りシーケンシング技術を可能にすることで、細菌ゲノムのクローズドノボアセンブリを生成するには、マルチプレックスPCR17、18によるデノボアセンブリの手動閉鎖などの激しい方法が必要なくなりました。次世代の短読シーケンシングとNanoporeロングリードシーケンシング技術の組み合わせは、比較的低コストで正確で完全で閉じた細菌ゲノムアセンブリのファシリティ生成を可能にします19.短読シーケンシングは、一般的に平均40〜100個のコンティグからなる正確でありながら断片化されたゲノムアセンブリを生成し、ナノポアシーケンシングは、精度が低いが、コンティグに結合し、ゲノムシンテンションを解決するための足場として役立つ長さ約5〜100kbの長い読み取りを生成します。短読と長期読み取りの両方の技術を利用したハイブリッドアプローチは、正確で完全な細菌ゲノムを生成することができます19.
ここでは、ハイブリッドアセンブリアプローチを用いたヒト尿、ゲノムDNA抽出、シーケンシング、および完全なゲノムアセンブリからの細菌の単離および同定のための包括的なプロトコルを説明する。このプロトコルは、閉じた細菌染色体およびプラスミドなどの染色体外要素の正確な組み立てのために、短読および長読のシーケンシングによって生成される読み取りを適切に変更するために必要なステップに特に重点を置きます。

<table><tbody><tr><td>機器:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td>G29398A</td><td>オプションだが推奨</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機 エッペンドルフ</td><td>--</td><td>円錐形や微量遠心チューブ(例:モデル5810R/5424R)</td></tr><tr><td>電気泳動</td><td>BioRad Laboratories</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージングシステム</td><td>BioRad Laboratories</td><td></td><td>ChemiDoc models</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>Any CO2 インキュベーター (例: Thermo Forma model 3110)</td></tr><tr><td>Magnetic Rack</td><td>New England BioLabs</td><td>S15095</td><td>12-tube rack</td></tr><tr><td>MinION</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1002</td><td>他のIlluminaモデルは許容されます</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>--</td><td>Synergy H1</td></tr><tr><td>Qubit 蛍光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H2024</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>--</td><td>PCR用の任意のサーモサイクラー反応(例:ProFlex PCRシステム)</td></tr><tr><td><強>材料:</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>10X TBE緩衝液</td><td>--</td><td>-</td><td>-1Mトリス、1Mホウ酸、0.2M EDTA(pH 8.0)</td></tr><tr><td>1429Rプライマー</td><td>シグマアルドリッチ(カスタムオリゴ)</td><td>--</td><td>GGTTACCTTGTTACGACTT</td></tr><tr><td>1kbラ</td><td>ダーVWR</td><td>101228-494</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-Cl (pH 7.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>6x ローディング色素</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0783588</td><td></td></tr><tr><td>8F プライマー</td><td>Sigma Aldrich (カスタムオリゴ)</td><td>--</td><td>AGAGTTTGATCCTGGCTCAG</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad Laboratories</td><td>63001</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>嫌気性 ポーチ システム - GasPak EZ</td><td>BD 診断システム</td><td>B260683</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A73-500</td><td></td></tr><tr><td>脳心輸液ブロス</td><td>BD 診断システム</td><td>212304</td><td></td></tr><tr><td>CDC 嫌気性菌 5% 羊血液寒天</td><td>BD 診断システム</td><td>L007357</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagarオリエンテーション</td><td>BD診断システム</td><td>PA-257481.04</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy血液&ティッシュ</td><td>QIAGEN</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq マスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>ドライ嫌気性インジケーターストリップ</td><td>BD診断システム</td><td>271051</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E7023</td><td>分子生物学用</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP130210</td><td></td></tr><tr><td>フローセルプライミングキット</td><td>オックスフォードナノポアテクノロジー</td><td>ズ EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>フローセル洗浄キット</td><td>オックスフォードナノポアテクノロジー</td><td>ズ EXP-WSH003</td><td></td></tr><tr><td>ゲル抽出ミニプレップキット</td><td>バイオベーシック</td><td>BS654</td><td></td></tr><tr><td>ライゲーションシーケンシングキット</td><td>オックスフォードナノポアテクノロジー</td><td>ズ SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>・リサーチ・プロダクツ・インターナショナル・コーポレーション</td><td>L381005.05</td><td></td></tr><tr><td>ムタノリシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>M9901-5KU</td><td></td></tr><tr><td>ネイティブ・バーコード拡張 1-12</td><td>オックスフォード・ナノポア・テクノロジー</td><td>ズ EXP-NBD104</td><td></td></tr><tr><td>NEB ブラント/TA リガーゼ・マスター・ミックス</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>M0367L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext FFPE DNA修復ミックス</td><td>ニューイングランド・バイオラボ</td><td>M6630L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext quick ligation buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II End repair / dA-tailing module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA CD Indexes</td><td>Illumina</td><td>20018708</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA Flex Library Prep - (M) Tagmentation</td><td>Illumina</td><td>20018705</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>E6056L</td><td></td></tr><tr><td>R9 Flow cell</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sheep Blood</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DS13250</td><td></td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td>--</td><td>--</td><td>10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Software &バイオインフォマティクスツール:</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>包帯</td><td>--</td><td>-</td><td>-https://rrwick.github.io/Bandage/</td></tr> <tr><td>ゲノム疫学センター</td><td>-</td><td>---</td><td>http://www.genomicepidemiology.org/</td></tr> <tr><td>CLCゲノミクスワークベンチ12</td><td>QIAGEN</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRcasFinder</td><td>-</td><td>--</td><td>-https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>の-</td><td>--</td><td>-https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td></tr> <tr><td>Geneious Prime</td><td>Geneious</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>gVolante (BUSCO)</td><td>--</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>https://gvolante.riken.jp/ Kbase Prokka Wrapper</td><td>-</td><td>---https://kbase.us/applist/apps/ProkkaAnnotation/annotate_contigs/release</td><td></td></tr> <tr><td>Minimap2</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/lh3/minimap2</td></tr><tr><td>MinKNOW</td><td>オックスフォードNanoporeテクノロジー</td><td>ズ--</td><td></td></tr><tr><td>NanoFilt</td><td>-</td><td>--https://github.com/wdecoster/nanofilt</td><td></td></tr> <tr><td>NanoStat</td><td>--</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/wdecoster/nanostat PHASTER</td><td>--</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>https://phaster.ca/ Prokka</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/tseemann/prokka</td></tr><tr><td>QUAST</td><td>--</td><td>--</td><td>http://quast.sourceforge.net/quast</td></tr><tr><td>トリムガロア</td><td>--</td><td>--</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</td></tr> <tr><td>トリムモマチック</td><td>-</td><td>---http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td></tr> <tr><td>一輪車</td><td>--</td><td>--</td><td>https://github.com/rrwick/Unicycler#necessary-read-length</td></tr></tbody></table>

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

Hybrid De Novo Genome Assembly for the Generation of Complete Genomes of Urinary Bacteria using Short- and Long-read Sequencing Technologies

完全なゲノム配列は、尿中微生物の遺伝的多様性とユニークなコロニー形成因子を理解するための貴重なデータを提供します。これらのデータには、抗菌性の普及に寄与し、尿路感染症(UTI)の治療をさらに複雑にするプラスミドや染色体外ファージなどの移動遺伝子要素が含まれる可能性があります。ゲノム構造の微細な解決を提供することに加えて、完全な閉じたゲノムは、詳細な比較ゲノムおよび進化的分析を可能にする。完全なゲノム デノボ の生成は、利用可能なシーケンシング技術の限界のために長い間困難な作業でした。ペアエンド次世代シーケンシング(NGS)は、多くの場合、正確だが断片化したゲノムアセンブリをもたらす高品質のショート読み取りを生成します。それどころか、Nanoporeシーケンシングは、通常、エラーが起こりやすい完全なアセンブリにつながる低品質の長い読み取りを提供します。このようなエラーは、ゲノム全体の関連研究を妨げたり、誤解を招く変異体解析結果を提供したりする可能性があります。したがって、短い読み取りと長い読み取りの両方を組み合わせたハイブリッドアプローチは、高精度の閉じた細菌ゲノムを達成するための信頼性の高い方法として出現しています。本明細書に報告されているのは、多様な尿細菌の培養、16S rRNA遺伝子シーケンシングによる種同定、ゲノムDNA(gDNA)の抽出、およびNGSおよびナノポアプラットフォームによる短い読み取りおよび長い読み取りの生成に関する包括的な方法である。さらに、この方法は、全ゲノム配列の生成のための品質管理、組立、および遺伝子予測アルゴリズムのバイオインフォマティクスパイプラインを記述する。バイオインフォマティクスツールの組み合わせにより、ハイブリッドゲノムアセンブリおよびダウンストリーム解析のための高品質の読み取りデータを選択できます。このプロトコルに記載されているハイブリッド ・デ・ノボゲノム アセンブリの合理化されたアプローチは、任意の可進性細菌での使用に適応され得る。

このプロトコルは、 図 1に示す属に属する尿細菌の培養とシーケンシングに最適化されています。すべての尿細菌がこの方法でカルト的であるとはいえない。カルチャ メディアと条件は、 図 1の属によって指定されます。gDNA完全性の例示的なゲル電気泳動評価を 図2に示す。読み取り処理、ゲノムアセンブリ、および注釈のシーケンス処理のためのバイオインフォマティクス パイプラインの概要を 図 3に説明します。 図 4 に、プロトコルの理解を簡略化し、組織を成功させるためのフレームワークを提供するための、計算ディレクトリ構造のガイドが提供されています。さらに、このプロトコルによって生成された2つのクレブシエラ spp.、K.肺炎 および K.オキシトカの代表的な完全なゲノムが含まれています。これらのアセンブリの表現は 図5 に示されており、さらに不完全な例 である肺炎のゲノムを 含んでいる。完全にアコードされた各完全なゲノムの詳細な概要を 図 6に示します。最後に、読み取り統計量のシーケンシングの概要を表 1 に示し、高品質の閉じたゲノムアセンブリの生成に十分な生データとトリミングされたデータを広く理解する。さらに、2つの代表の主要パラメータはクレブシエラ sppを完了します。ゲノムがリストされています。ゲノムおよび生データは、バイオプロジェクトPRJNA683049の下でジェンバンクに堆積した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig01.jpg"> 図1:多様な尿属の尿培養を改良した。多様な尿中属を培養するために使用することができる寒天および液体のスープのための図表。全ての培養は、サブセクション1.1に記載されているように35°Cで行われることが示唆される。円は特定の属を培養するのに適したメディアを表し、色は、あるメディアタイプを別の種類と区別するために任意に選択した。CDC-AN BAP(赤)、CDCアエロベヒツヒドブラッド寒天;5%羊BAP(オレンジ)、羊の血寒天;BHI (緑), 脳の心臓の注入;TSB(黄色)、トリプティック大豆ブロス;クロマガーオリエンテーション(青)。Gardnerella膣は、HBT二層G膣上で培養されるべきである微好気球雰囲気の選択的寒天および特別なスープ培養要件44の下で。 b乳酸菌イナーは、ミクロ好気性雰囲気の中で5%のウサギ-BAPプレートとNYCIIIスープで培養する必要があります。c乳酸菌 spp.ミクロ好気条件でMRS上で培養されてもよい。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig02.jpg"> 図2:ゲノムDNA抽出アガロースゲル画像 gDNA抽出結果を描写した代表的なゲル画像。(A)レーン 1: 1 kb ラダー, レーン 2: 抽出に成功したことを表す無傷の gDNA, レーン 3: 断片化された gDNA を示す塗りつぶし.(B) レーン 1: 1 kb ラダー、レーン 2 &amp; 3: 1.5 kb と 3 kb の間の 2 つのバンドで示される rRNA 汚染。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig03.jpg"> 図3:ハイブリッドゲノム組み立てワークフロー 読み取り品質管理と前処理からアセンブリアノテーションまでの手順の概略図。読み取りトリミングは、あいまいで低品質の読み取りを削除します。Q スコアおよび長さのパラメーターが示され、保持される読み取りを表します。アセンブリは、ハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリを生成するために、短い読み取りと長い読み取りの両方を利用します。アセンブリの品質は、指定されたツールとパラメータを使用して完全性と正確性に基づいて評価されます。最終的なゲノムアセンブリは、すべての遺伝子および関心のある特定の遺伝子についてアナンスされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2.jpg"> 図4:バイオインフォマティクスのディレクトリ構造ガイド 短い読み取りと長い読み取り、ハイブリッド アセンブリ、およびゲノム注釈と QC の処理に推奨されるディレクトリとファイルの編成の概略図。主要なコマンド行データ処理ステップは、対応するファイルとディレクトリの横に強調表示されます。コマンドとフラグ (太字)、入力ファイル (青)、出力ファイルまたはディレクトリ (赤)、ファイル命名規則 (magenta) などのユーザー入力)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig05.jpg"> 図5:包帯によるゲノムアセンブリグラフ 代表の完全なゲノム組み立てグラフ (A) クレブシエラオキシトカ KoPF10 および (B) クレブシエラ肺炎の KpPF25および不完全なゲノムアセンブリ (C) クレブシエラ 肺炎の KpPF46.KoPF10の完全なゲノムは単一の閉じた染色体を示し、KpPF25の完全なゲノムは閉じた染色体と5つの閉じたプラスミドから成る。KpPF46の不完全な染色体は、2つの相互接続されたコンティグで構成されています。一輪車ハイブリッド デノボ アセンブリは、包帯によって視覚化されたアセンブリグラフを生成します。アセンブリグラフは、ゲノムの単純な概略を提供し、単一のコンティグの両端を接続するリンカーによって閉じた染色体またはプラスミドを示す。複数の相互接続されたコンティグが存在する場合、不完全なアセンブリが示されます。コンティグのサイズと深さは、包帯にも注意することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872fig06.jpg"> 図6:アナンスハイブリッドアセンブリの完全なゲノムマップGeneious Primeが(A)の完全なゲノムのために生成したアセンブリマップ(A)K.オキシトカKoPF10および(B)肺炎のKpPF25は、プラスミドの骨格に沿って色付きの矢印で示されるアノメーションされた遺伝子を示す。染色体は、単純性のためにrRNAおよびtRNA遺伝子のみを示す。ゲノム注釈は、本プロトコルの第10項に示すようにProkkaを用いて行った。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/62872fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Table 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62872/62872table1.jpg"> 表1: 代表クレブシエラspp. 完全なアセンブリ特性.K. オキシトカ株KoPF10およびK.肺炎株KpPF25.NCBI上の堆積データの加盟番号のアセンブリパラメータが提供される。トリミング前とトリミング後の両方の読み取り数は、両方のシーケンステクノロジに指定されます。N50 は、短い読み取りが制御された長さであるため、長い読み取り専用です。プラスミド・レプレコンは、プラスミドファインダー v2.1 エンテオエバクテリア科データベースを使用して、80%の同一性と60%の長さに設定されたパラメータを使用して予測しました。MLST、マルチローカスシーケンスタイプ。b CDS、コーディングシーケンス。プラスミド・レプレコンは、プラスミドファインダー v2.1腸内細菌科データベースを使用して、80%の同一性と60%の長さに設定されたパラメータを使用して予測しました。dオックスフォードナノポアテクノロジーズ(ONT)は読み取りデータを預けた。eイルミナは読み取りデータを預けました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62872/Table%201_Sharon_JoVE_Revised.xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、尿細菌の培養、シーケンシング、および デノボ ハイブリッドゲノムアセンブリのための包括的なアプローチを詳述する。それは、尿中の植民地化、病原性、および抗菌性の普及に寄与する染色体および染色体外の両方の遺伝子要素を研究するのに有用な完全な、円形ゲノム配列の生成のための再現可能な手順を提供する。

Complete genome sequences provide valuable data for the understanding of genetic diversity and unique colonization factors of urinary microbes. These data ...

この包括的なプロトコルは、多様な尿細菌の近いゲノムを生成する方法を指示し、コーディング経験のない読者が端末ベースのゲノム組み立てと分析パイプラインを正常に実装できるようにします。完全なゲノムアセンブリは、コメンサルおよび泌尿器病原性細菌の間でコロニー形成および病原性に寄与する遺伝子の発見を可能にする。近いゲノムは、ゲノムアーキテクチャと移動遺伝子要素に関する洞察を提供します。ハイブリッドゲノムアセンブリ法は、他の解剖学的部位または環境ニッチから分離された任意の耕用細菌に適用して、ゲノムコンテンツおよびアーキテクチャに同様の洞察を提供することができる。プロトコルとメーカーガイドに従って、二本鎖DNAプールを準備し、DNAプールに常磁性ビーズの2.5倍の体積を加え、チューブを軽くフリックして内容物を混ぜてクリーンアップします。サンプルをGの2,000倍で簡単に回転させ、室温で5分間回転子にサンプルを置き、次にビーズを磁石にペレットします。次に、ペレットを邪魔することなく、作りたての70%エタノールをヌクレアーゼを含まない水で250マイクロリットルで2回洗浄します。打つ間磁石の上に管を残します。各洗浄後にエタノールを吸引し、その後、サンプルをGの2,000倍に短く回転させ、磁石に戻します。残留エタノールをピペットオフし、ペレットを30秒間乾燥させます。乾燥したら、60〜70マイクロリットルのヌクレアーゼを含まない水でペレットを再懸濁し、試料を室温で2分間インキュベートし、次いで、ペレット状のペレットを磁石にペレット状にします。エリュートをきれいな1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。濃縮された二本鎖DNAプールをフルオロメーターで定量化し、65マイクロリットルの最終体積で700ナノグラムのサンプルのアリコートを準備し、アダプタライゲーションステップに進み、最初の実行が終了した後の2回目の実行のためにプールの残りの部分を摂氏4度に保持します。メーカーの指示に従ってアダプターのライゲーションを続行します。シーケンス処理を続行するには、プライミングバッファーを混合し、フローセルをプライミングします。DNAライブラリ溶液を準備し、サンプルをドロップワイズでローディングポートにロードします。シーケンス実行を開始します。シーケンス用のオペレーティング・ソフトウェアを開き、開始ボタンをクリックして、実験の名前を入力します。キットの選択に進み、使用する適切なライブラリ準備キットとバーコード拡張パックを選択し、[続行] をクリックしてオプションを実行します。2 回目の実行に十分なライブラリを準備する場合は、実行時間をデフォルトの 72 時間から 48 時間に調整し、ベースコールを続けます。構成高速ベースコールでベース呼び出しオプションを確認します。バーコードを有効に設定して、出力 FASTQ がバーコードシーケンスから切り取られ、バーコードに基づいて別々のディレクトリにデマルチプレクスされるようにします。出力を続行するをクリックします。次に、出力シーケンスデータを保存する場所を選択します。FAST5 出力を保存する場合は、FASTQ 出力と 500 ギガバイトを超えるデータを保存するだけの場合は、約 30 ~ 50 ギガバイトのデータを想定してください。シーケンス処理後に手動フィルタリングを続行する場合は、フィルタリングオプション Qscore 7 の読み取り長未フィルターのチェックを外します。それ以外の場合は、オプションをオンのままにします。セットアップ タブの実行に進み、すべての設定を確認してください。設定が正しい場合は、スタートボタンをクリックします。それ以外の場合は、[戻る] をクリックして必要な調整を行います。long 読み取りディレクトリで、実行で使用される各バーコード用の新しいディレクトリを作成します。各バーコードに対応するすべての fastq ファイルを適切なフォルダにコピーします。各実行から各バーコードのすべてのfastqファイルを結合します。ファイルを結合したら、ターミナルを開き、cd コマンドを使用して long ディレクトリ内のバーコードディレクトリに移動します。バーコードごとの fastq ファイルを 1 つの fastq ファイルに連結するには、コマンドを実行し、各バーコードに対して手順を繰り返します。NanoStat を使用して、コマンドを実行してサンプルの読み取り品質を評価し、後で参照するために出力をテキストまたは Word ファイルにコピーして結果を記録します。結果が保存された後、NanoFilt を使用して MinION 読み取りをフィルター処理し、コマンドを実行して Q が 7 未満、長さが 200 未満の読み取りを破棄します。生成されたトリミングされたファイルで、コマンドを使用して NanoStat を実行します。出力をテキストまたは Word ファイルにコピーして結果を記録し、前の結果と比較して、フィルタが正常に実行されたことを確認します。シーケンス実行で使用する各バーコードに対して、この手順を繰り返します。ハイブリッドゲノムアセンブリを生成するには、短い読み取りファイルと長い読み取りファイルをtrimmed_readsという名前の単一のディレクトリに整理します。そのため、ディレクトリには以前に生成された fastq が含まれています。トリミングされた長い読み取りと2つのfastqのためのgzファイル。gz ファイルは R1 と R2 で、短い読み取りがトリミングされます。端末の cd コマンドを使用して、読み取りファイルを格納するディレクトリー trimmed_readsにナビゲートします。正しいディレクトリに入ったら、2つの短い読み取りファイルを zip にして fastq に保存します。gz フォーマットは、コマンドを実行して行います。R1 と R2 の両方について、この手順を繰り返します。すべての読み取りファイルが fastq にあることを確認します。gz フォーマットし、すべてのファイルが同じ分離ファイルと一致することを確認します。コマンドを実行して、ユニサイクラーを使用してハイブリッド アセンブリを開始します。実行が完了したら、一輪車を確認します。エラーがないことを確認するログ ファイル。生成されたコンテキストの数、サイズ、および完了または不完全な状況を記録します。不完全なコンテキストがユニサイクラーログで識別された場合は、コマンドにフラグを追加して、ユニサイクラーを太字モードで再実行します。包帯を開いてファイルをクリックし、ロードグラフを選択してアセンブリを選択します。以前にユニサイクラーによって生成されたunicycler_output_directoryに保存された gfa ファイル。ファイルがロードされたら、左側のツールバーの[グラフの描画]ボタンをクリックし、コンティグがどのように接続され、編成されているかを調べることによって、アセンブリが完成しているかどうかを評価します。cd コマンドを使用して、ターミナル内でユニサイクラー出力を保存するフォルダに移動します。次に、コマンドを実行して quast プロトコルを実行します。出力ディレクトリquast_output_directoryで quast によって生成されたレポートを確認します。cd コマンドを使用してユニサイクラー出力を保存するフォルダにターミナル内を移動し、コマンドを実行して prokka を実行します。tsv テーブルを開き、生成された gff ファイルをシーケンス解析ソフトウェアにアップロードして、注釈を確認します。ソフトウェアの注釈を視覚化および分析します。代表的なゲル画像では、ゲノムDNAまたはgDNA抽出結果が描かれています。無傷のgDNAの抽出と分離が成功することが観察できる。断片化したgDNAおよびRNA汚染を示す抽出が失敗することも描かれている。細菌のゲノムアセンブリグラフは、ユニサイクラーハイブリッドデノボアセンブリによって生成され、包帯によって視覚化された。クレブシエラオキシトカKoPF10の完全なゲノムは、単一の閉じた染色体を実証し、クレブシエラ肺炎の完全なゲノムKpPF25は閉じた染色体と5つの閉じたプラスミドで構成されていました。クレブシエラ肺炎の不完全な染色体KpPF46は、2つの相互接続されたコンティグで構成されていました。ジェネリアスプライムがクレブシエラオキシトカKoPF10およびクレブシエラ肺炎のKpPF25の完全なゲノムのために生成したアセンブリマップは、プラスミドの骨格に沿って色付きの矢印で示されるアノタイズされた遺伝子を示した。フローセルのロードが正常に行われていることを確認するには、推奨設定を使用して長い読み取りをフィルタリングし、すべてのファイルが fastq に含まれるようにします。gz フォーマット。同じサンプルに属するファイルを使用して、正しいユニサイクラーコマンドを実行します。

hybrid-de-novo-genome-assembly-for-generation-complete-genomes

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。...

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

微生物群集の特徴を明らかにすることは、環境微生物学における長年の目標でした。次世代のシーケンシング法により、最小限のコストと労力で、これまでにない深さで微生物群集の特性評価が可能になりました。ここでは、ベンチトップシーケンサーを使用して細菌の16SリボソームRNA遺伝子を配列決定するアプローチについて詳しく説明します。...

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。...

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

顕微鏡の有機体のゲノムのシーケンス処理中に汚染大きい問題に残る。ここでは、汚染のリスクを最小限に抑えるため全ゲノム増幅 DNA のわずか 50 pg...

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

このプロトコルの目的は、ベンチの研究と計算の組み合わせを使用して、可能性がありますのみ部分的に知られている共同浄化のシーケンスから容易に分離できない新規シーケンスを検索することです。...

減法混色のゲノム解析による新規シーケンスの発見

長い読み取りシーケンス大きく複雑なゲノム構造の変化の特徴付けとアセンブリを容易にします。ナノポア ベースのシーケンスのプラットフォームで超長いシーケンスを生成する方法について述べる。アプローチは、人間の細胞から中程度の範囲でプラスミド読み取りの数百人を生成する変更したライブラリの準備に続いて最適化された DNA...

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

我々は、ナノポアシーケンシングプラットフォーム上でアンプリコンベースの全ゲノムウストゥウイルス(USUV)シーケンシングのプロトコルを検証した。ここでは、ナノポアR10フローセルの誤差率をより詳細に用いた方法について説明する。...

全ゲノムナノポアシーケンシングの検証、例としてUsutuウイルスを用いた

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体...

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌...

ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

ここでは、標的濃縮を使用して、臨床サンプルからの細菌性感染症の全ゲノム配列決定を可能にするプロトコルを提示します。この新しい症候群パネルベースの方法は、豊富なヒト DNA と低い細菌量という課題を克服し、 クラミジア トラコマチス、 淋菌、梅 毒トレポネーマ、 マイコプラズマ...

ターゲットエンリッチメントワークフローを使用した臨床サンプルからの全細菌ゲノムの生成

本研究では、染色体配列が既に知られている場合や興味がない場合のプラスミドのナノ孔シーケンシングのワークフローを記述しています。初期のプラスミドDNA濃縮ステップは、最適なプラスミド配列深度を確保し、フローセルあたりのシーケンス可能なサンプル数を最大化します。...

ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー

学ぶ 尿細菌の完全ゲノムアセンブリ法。Unicyclerを用いたハイブリッドデノボアセンブリで、コード不要で環状染色体とプラスミドを解明し、抗菌薬耐性遺伝子と定着因子を同定します。

短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッドデノボゲノムアセンブリ

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短読シーケンシング技術を用いた尿細菌の完全ゲノム生成のためのハイブリッド デノボ ゲノムアセンブリ

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