Name: 選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶ選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークの同定法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、リボソーム関連シャペロンとの結合や新生鎖修飾を解析し、タンパク質合成と関連疾患のメカニズム解明に貢献します。

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実りある議論をしてくれた研究室のメンバー全員と、原稿を批判的に読んでくれたムハンマド・マフズミーに感謝します。この研究は、ISF(イスラエル科学財団)助成金2106/20によって資金提供されました。

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

ここで、プロトコルは、コドン分解能に近い共翻訳相互作用を捕捉するための選択的リボソームプロファイリングアプローチを詳述する。リボソームが混雑した細胞質への新生鎖出現を調整するためのハブとして上昇するにつれて、これは機能的なプロテオームを確保するために必要な様々な共翻訳相互作用を同定し、特徴付けるために、そして様々な疾患を研究するための重要な方法である。今日まで、SeRPは、インビボで、直接的に、これらの相互作用を捕捉し、特徴付けることができる唯一の方法である14、15、16。
最初の最も重要なステップは、細胞の収集と溶解です。数秒以内に、フラッシュフリーズに続いて凍結状態で溶解することによって、進行中の翻訳をキャプチャすることが不可欠です。細胞収集は、リボソーム流出を回避し、急速に起こり得るストレス翻訳応答を誘導するために、急いで行わなければならない。第2の重要な工程は、アフィニ...

SeレクティブリボソームPロファイリング(SeRP)は、今日まで、共翻訳相互作用をインビボで、直接的に捕捉し、特徴付ける唯一の方法である1、2、3、4、5、6。SeRPは、任意の因子と翻訳リボソームとの相互作用のグローバルプロファイリングをコドン分解能2,7に近い状態で可能にする。
この方法は、増殖する細胞のフラッシュ凍結および活性翻訳の保存に依存している。次いで、細胞溶解物をRNase Iで処理して、「リボソームフットプリント」と呼ばれるリボソーム保護mRNA断片を除く細胞内のすべてのmRNAを消化する。その後、サンプルは 2 つの部分に分割されます。1つの部分は、すべての細胞リボソームフットプリントの単離に直接使用され、細胞内で進行中のすべての翻訳を表す。第2の部分は、例えば修飾酵素、転座因子、折り畳みシャペロン、および複合体集合相互作用など、関心のある因子に関連するリボソームの特定のサブセットの親和性精製に使用される。親和性精製されたリボソームフットプリントは、総称してインターアクトームと呼ばれる。次に、リボソームで保護されたmRNAを抽出し、cDNAライブラリーの生成に使用し、続いてディープシーケンシングを行います。
全トランスレートームサンプルとインターアクトームサンプルの比較分析により、関心のある因子に関連するすべてのorfの同定、および各orf相互作用プロファイルの特性評価が可能になります。このプロファイルは、解読されたコドンおよび新興ポリペプチド鎖のそれぞれの残基を推測できる正確な関与開始および終結配列、ならびに相互作用中のリボソーム速度変動を報告する7、8。図1は、このプロトコルを回路図として示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg"> 図 1: SeRP プロトコルの概要 このプロトコルは、7〜10日以内にその全体を実行することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>3'-リン酸化 28 nt RNA 制御オリゴヌクレオチド</td><td>IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td>RNase フリー HPLC 精製; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolute</td></tr> <tr><td>ethanol</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>酸性フェノール&ndash;クロロホルム</td><td>アンビオン</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>抗体:マウスモンクローナル抗HA</td><td>メルク</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>ロス</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>バクト酵母抽出物</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>ベスタチン塩酸塩</td><td>Roth</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA Ligase*</td><td>震源地</td><td>CL9025K</td><td>100 U/&mu;L</td></tr><tr><td>Colloidal Coomassie 染色液</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free protease inhibitor カクテル錠</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 処理済み滅菌ろ過水*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose anhydrous</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>DNA ラダー、10 bp O'RangeRuler*</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>DNA ローディング色素*</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0631</td><td>6&times;</td></tr><tr><td>DNase I、組換え</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>RNAse</td></tr><tr><td>フリーdNTP溶液セット*</td> <td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA *</td> <td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr>グリ<tr><td>セロール</td><td>VWR</td><td>24388.260。</td><td></td></tr><tr><td>グリシン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Phusion ポリメラーゼ*</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド</td><td>Roth</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Roth</td><td>T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン</td><td>ロス</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>リンカー L(rt)</td><td>IDT</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>NHS活性化セファロース4高速フロービーズ</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 substitute</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>プレキャストゲル</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% および 12%</td></tr><tr><td>RNase I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS、20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>RNase フリー</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M、pH 5.5</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td></td><td>Roth 9265</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase 阻害剤</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transciptase*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>TBEポリアクリルアミドゲル*</td> <td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;尿素ポリアクリルアミドゲル*</td> <td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;尿素ポリアクリルアミドゲル*</td> <td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&ndash;尿素サンプルバッファー*</td> <td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2&times;</td></tr><tr><td>トリス</td><td>・ロス</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>トリス*</td><td>アンビオン</td><td>AM9851</td><td>1 M、pH 7.0</td></tr><tr><td>トリス*</td><td>アンビオン</td><td>AM9856</td><td>1 M、pH 8.0</td></tr><tr><td>ウルトラピュア 10&times;TBEバッファー*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - ライブラリー調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガスケットおよびスプリングクランプ用、90 mm、</td><td>ミリポア</td><td>&nbsp;</td><td></td>XX1009020</tr><tr><td>グランドジョイントフラスコ1L、</td><td>ミリポア</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

近年、リボソームが私たちのmRNAを解読するだけでなく、混雑した細胞環境へのポリペプチド鎖の出現を導くことが明らかになりました。リボソームは、膜標的因子の空間的および速度論的に制御された結合、修飾酵素、および折り畳みシャペロンのためのプラットフォームを提供する。高次オリゴマー複合体への集合、ならびにタンパク質間ネットワーク形成ステップでさえ、合成と協調することが最近発見された。
ここでは、 インビボでの共翻訳相互作用を捕捉するために開発された方法である選択的リボソームプロファイリングについて説明する。リボソーム-新生鎖複合体を共翻訳インタラクターとともに捕捉するために必要なさまざまなアフィニティー精製ステップ、ならびにコドンに近い分解能で共翻訳相互作用を解読するために必要なmRNA抽出、サイズ排除、逆転写、ディープシーケンシング、ビッグデータ解析ステップについて詳述します。

このプロトコールのフローチャート(図1)に例示されるように、細胞を対数期まで増殖させ、次いで濾過によって迅速に回収し、極低温粉砕によって溶解した。次に、ライセートを2つに分けました:1つはリボソームで保護されたmRNAフットプリント用、もう1つは選択されたリボソーム保護mRNAフットプリント用で、アフィニティー精製を実施してタグ付きタンパク質-リボソーム-新生鎖複合体をプルダウンしました。 図2に見られるように、タグ付きタンパク質発現とウェスタンブロット分析によるプルダウンの成功を確認しました。リボソームで保護されたフットプリント(通常20~45 ntの長さ)の単離を、スモールRNA電気泳動(2100 BioAnalyzerシステム)によって検証し、システムマニュアルに従ってサイズ検出の5~10 ntシフトを可能にしました(図3)。次に、ディープシーケンシングとビッグデータ解析のためのcDNAライブラリを生成しました。cDNAライブラリの生成中は、アンダーサイ...

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物 サッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの相互作用の直接分析のための方法について説明する。

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

共翻訳相互作用は、折り畳みおよび集合経路を標的とする新生鎖修飾において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、モデル真核生物サッカロミセス・セレビシエにおけるこれらの相互作用のin vivo直接分析のための方法について説明する。選択的リボソームプロファイリングは、インビボでの共翻訳相互作用を直接的に捕捉し、特徴付ける唯一の方法です。選択的リボソームプロファイリングは、任意の因子のグローバルプロファイリングを可能にし、リボソームをほぼコドン分解能で翻訳することとの相互作用を可能にする。所望のタグ付きタンパク質を含む構築された酵母細胞を収集することから始める。ミキサーミル中で極低温粉砕を用いて細胞溶解を30ヘルツで2分間2回行う。4°Cで30,000倍Gで2分間遠心分離し、溶解液を清澄し、上清を回収した。上清200マイクロリットルをトータルRNA分析用の微量遠心チューブに、700マイクロリットルを免疫精製用の微量遠心チューブに移す。以前に分離した全RNAサンプルを、10単位のRNase Iを用いて、毎分30回転で回転するミキシングラック上で摂氏4度で25分間消化する。テキスト原稿に記載されているようにスクロースクッションマスターミックスを準備します。次いで、試料を400マイクロリットルのスクロースクッションに積み込み、245,000倍Gおよび摂氏4度で90分間遠心分離する。真空ポンプで上清をすばやく取り除き、ペレットに150マイクロリットルの溶解バッファーを重ねます。サンプルをパラフィンラップで固定し、毎分300回転で摂氏4度で1時間振ってペレットを再懸濁します。アフィニティーマトリックスを溶解バッファーに再懸濁することによって、サンプル当たり100〜400マイクロリットルのアフィニティー結合マトリックスを1ミリリットルの溶解バッファーで3回洗浄する。その後、4°Cの回転ミキシングラックで5分間、毎分30回転で回転します。遠心分離により沈殿させる。上の液体を捨て、このプロセスを3回繰り返します。以前に分離した免疫精製サンプルにアフィニティー結合マトリックスを追加し、RNase I.Rotateを使用して、回転ミキシングラックで毎分30回転、摂氏4度で25分間消化し、タンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させます。テキスト原稿の説明に従って洗浄バッファーマスターミックスを準備します。アフィニティー結合マトリックスを1ミリリットルの洗浄バッファーで約1分間洗浄し、ミックスラック内で回転させます。次に、3000倍Gで4°Cで30秒間遠心分離して沈殿させ、上液を捨てた。これを3回繰り返します。1ミリリットルの洗浄バッファーでさらに2回、毎回5分間、ミックスラック内で回転させます。遠心分離により再度沈殿させる。同じ量の2倍サンプルバッファーでタンパク質溶出に50マイクロリットルのビーズを使用してください。遠心分離機でビーズをペレット化し、上部の液体を捨てる。700マイクロリットルの10ミリモルトリスで溶出する。その後、液体窒素中で凍結する。液体窒素からサンプルを取り出し、その後のRNA抽出に使用するために摂氏マイナス80度で保存します。アフィニティーマトリックスへの非特異的結合の対照として、タグなしの野生型株上でのモックIPを用いた各ステップのアリコートによるウェスタンブロットまたはクーマシー染色によるアフィニティー精製ステップの成功を評価する。アフィニティー精製後のウェスタンブロット結果は、タグ付きタンパク質発現の成功を実証した。リボソームで保護されたフットプリントの単離は、バイオアナライザーからの結果を用いて検証した。ディープシーケンシングとビッグデータ解析のためのcDNAライブラリを生成する一方で、アンダーサイクルは低収率につながります。しかし、dNTPsがまだ存在すると、反応は進行し、PCR産物がそれ自体をプライミングするためにキメラ配列を有するより長いPCRアーティファクトを生成する。生成されたライブラリーを、正確なサイズ分布および定量のために高感度DNA電気泳動によってさらに検証した。配列ライブラリをアダプタとバーコード用にトリミングし、結果として得られた読み取りを、コード配列、イントロン、および遺伝子間配列の異なるグループに分割しました。Vma2pとリボソーム関連シャペロンSsb1p、Pfk2p、およびFas1pとの共翻訳相互作用を分析するリボソームプロファイルを、各アフィニティー精製の実験スキームとともにここに示す。Ssb1、Pfk2p、およびFas1pインターアクトームと比較して、全翻訳体の開いた読書フレームに沿ってリボソーム占有率があった。開いたリーディングフレームに沿った各リボソーム位置におけるSsb1p、Pfk2p、およびFas1pの平均濃縮度がここに示されている。この方法は、様々な共翻訳相互作用の同定および特性評価を可能にし、機能的プロテオームを確実にし、ならびに様々な疾患の研究を可能にする。今日まで、選択的リボソームプロファイリングは、これらの相互作用をインビボで直接的に捕捉し、特徴付けることができる唯一の方法である。

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生物学

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ここでは、細菌におけるRIBO-seqのサンプル採取および調製の段階について説明する。これらのガイドラインに従って作成されたライブラリのシーケンシングは、包括的なバイオインフォマティクス分析のための十分なデータをもたらす。私たちが提示するプロトコルはシンプルで、標準的な実験装置を使用し、リシスから図書館の取得まで7日かかります。...

細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

リボソームを翻訳すると、コドンあたり3つのヌクレオチドがペプチドに解読される。リボソームプロファイリングによって捕捉されたmRNAに沿ったそれらの動きは、特徴的な三重項周期性を示すフットプリントを生成する。このプロトコルでは、RiboCodeを使用してリボソームプロファイリングデータからこの顕著な特徴を解読し、トランスクリプトーム全体でアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームを特定する方法について説明します。...

De novo リボソームプロファイリングデータによるアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームの同定

学ぶ選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークの同定法。Saccharomyces cerevisiaeを用いて、リボソーム関連シャペロンとの結合や新生鎖修飾を解析し、タンパク質合成と関連疾患のメカニズム解明に貢献します。

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

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