Name: イン・ヴィヴォ 大型動物の眼球神経節細胞と視神経機能と構造を評価する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶFVEP、PERG、OCTを用いたヤギとサルにおける視神経と網膜神経節細胞の機能・構造評価法。大動物モデルによる視覚信号伝達の研究と治療開発への応用を支援します。

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この研究は、次の助成金によって資金提供されました: 中国の国家キーR&Dプログラム (2021YFA1101200);中国の国家主要研究開発プログラム(2016YFC1101200)、温州の医学研究プロジェクト(Y20170188)。中国国立自然科学財団(81770926;81800842);浙江省の主要な研究開発プログラム(2018C03G2090634);温州眼科病院の主要な研究開発プログラム(YNZD1201902)。スポンサーや資金調達組織は、この研究の設計や実施に何の役割も持っていませんでした。

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<li>Porciatti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+assessment+of+retinal+ganglion+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological assessment of retinal ganglion cell function.</a> Experimental Eye Research. 141, 164-170 (2015).</li>
<li>Smith, C. A., Vianna, J. R., Chauhan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+retinal+ganglion+cell+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Assessing retinal ganglion cell damage.</a> Eye. 31 (2), 209-217 (2017).</li>
<li>Schuman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+and+histologic+measurements+of+nerve+fiber+layer+thickness+in+normal+and+glaucomatous+monkey+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography and histologic measurements of nerve fiber layer thickness in normal and glaucomatous monkey eyes.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (8), 3645-3654 (2007).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+reproducibility+of+VEP+recording+in+rats%3A+electrodes%2C+stimulus+source+and+peak+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis.</a> Documenta Ophthalmologica. 123 (2), 109-119 (2011).</li>
<li>Odom, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISCEV+standard+for+clinical+visual+evoked+potentials%3A+%282016+update%29%5BTitle%5D)+AND+%22Documenta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">ISCEV standard for clinical visual evoked potentials: (2016 update).</a> Documenta Ophthalmologica. 133 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicone+oil-induced+ocular+hypertension+and+glaucomatous+neurodegeneration+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Silicone oil-induced ocular hypertension and glaucomatous neurodegeneration in mouse.</a> eLife. 8, 45881(2019).</li>
<li>Seidman, S. H., Telford, L., Paige, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical%2C+horizontal%2C+and+torsional+eye+movement+responses+to+head+roll+in+the+squirrel+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Vertical, horizontal, and torsional eye movement responses to head roll in the squirrel monkey.</a> Experimental Brain Research. 104 (2), 218-226 (1995).</li>
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</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

本研究では、ヤギとアカゲザルにおけるVEP、PERG、OCTのプロトコルを発表する。これらの インビボ 法は、緑内障、虚血性、外傷性視神経障害および視神経炎9などの様々な視神経障害の大規模な動物モデルに適用することができる。
PVEPはFVEP17より安定し、敏感である;しかし、goat9では引き出すものではありません。したがって、FVEPはヤギで行われ、PVEPは我々の研究室のアカゲザルで行われ、レチノ-ジェノロ-コルチカル経路の完全性を評価する。PERGがヤギに誘導できるがPVEPではなく、観測の根底にあるメカニズムは、我々の知見によればまだ不明である。ヤギの視神経機能と構造が人間と異なる可能性があります。
FVEPの振幅は瞳孔サイズと周囲光の影響を受ける可能性があるため、FVEP記録中に瞳孔を広げ、ヤギの頭の上に黒い毛布を置きます。クリニック<sup class...

視神経(ON)は、神経節細胞(RGC)の軸索で構成され、眼窩から脳に視覚信号を伝達する。緑内障、外傷性または虚血性視神経障害などのON疾患は、しばしば不可逆的なON / RGC変性および壊滅的な視力喪失を引き起こした。げっ歯類モデルのON再生およびRGC保護には現在多くのブレークスルーがありますが、ON疾患の大部分の臨床治療は、不十分な結果で過去半世紀にわたって本質的に同じままでした7,87,8.基礎研究と臨床実践のギャップを埋めるために、ON疾患の大型動物モデルを用いた翻訳研究は、げっ歯類モデルよりも人間との解剖学的類似性が高いため、しばしば必要であり有益である。
ヤギとアカゲザルは、人間のON病をモデル化するために私たちの研究室で使用される2つの大きな動物種です。ヤギの眼球の大きさ、ON、および隣接する構造(眼窩および鼻腔、頭蓋骨の基盤など)は、頭蓋骨CTスキャン9に基づく人間のそれと同様である。このように、ヤギモデルは、ヒトで使用する前に治療装置または外科的処置を評価し、改良する機会を提供する。アカゲザルは、ヒト以外の霊長類(NHP)として、他の種に存在しない人間のようなユニークな視覚システムを有する10,11。さらに、NHPにおける傷害および治療に対する病態生理学的反応は、ヒト12におけるそれとはるかに類似している。
ONおよびRGCの構造と機能を縦方向に評価するためのインビボ試験は、大型動物実験において重要である。パターン電気レティノグラム(PERG)は、RGC機能を評価するために使用されています。フラッシュ視覚誘発電位(FVEP)は、視覚系におけるレチノ-ジェノロ-コルチカル経路の完全性を反映する。したがって、PerGとFVEPを組み合わせることで、ON関数9,13,14を反映することができる。このレチナル視コテレンス断層撮影(OCT)イメージングは、高い時間的および空間的分解能を有する眼窩構造を示し、この場合、眼球団(GCC)9,15の厚さの測定を可能にする。本研究における電気生理学的検査では、これらのパラメータが眼血流および視覚システムの機能に強力な影響を及ぼすため、検査前のバイタルサイン(熱率、違反率、血圧)および酸素飽和度(SpO2)のレベルを監視することは非常に重要である。しかし、簡単にするためにOCTのレチンイメージングを行う際のバイタルサインは監視しませんでした。我々の前の研究9によると、OCTのレチナルイメージングによって測定されたGCC厚は非常に安定しており、セッション間変動係数は3%に近い。ヤギおよびアカゲザルにおけるこれらのインビボ試験は、これまでの研究9で詳細に説明されている。ここでは、実験の透明性と再現性を高めるためにこれらの方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>47.6 x 26.8 cmモニター</td><td>DELL Inc.</td><td>E2216HV</td><td>コントラスト反転黒 - 白の市松模様の視覚刺激は、画面に表示されました</td></tr><tr><td>6.0 mm 気管チューブ</td><td>河南 Tuoren 医療機器有限公司</td><td>PVC 6.0</td><td>気道</td></tr><tr><td>ワニ口クリップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アトロピン</td>広<td>東省 Jieyang Longyang 動物製薬株式会社を確保します。</td><td></td><td>気管支分泌を減らし、迷走神経の活性化から心臓を保護します</td></tr><tr><td>Carbomer Eye Gel</td><td>Fabrik GmbH Bausch&の子会社ロム</td><td></td><td>が角膜を湿らせ、記録電極を安定</td></tr>させる <tr><td>ERG-Jet 記録電極</td><td>Roland Consult Stasche&Finger GmbH</td><td>2300 La Chaux-De-Fonds</td><td>ERG recording</td></tr><tr><td>eye speculum</td><td>Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd</td><td>ZYD020</td><td>開いた眼瞼裂</td></tr><tr><td>Heidelberg Spectralis OCT システム</td><td>Heidelberg Engineering</td><td></td><td>OCT システム</td></tr><tr><td>イメージング</td><td></td><td></td><td>(https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>RWDライフサイエンス株式会社</td><td>R510-22</td><td>イソフルラン麻酔</td></tr><tr><td>オスSaanenヤギ</td><td>Caimu Livestock Company、国(杭州、中国)</td><td></td>オス<td>のSaanenヤギ、19&ndashの重量で4〜6ヶ月から年齢。23kg</td></tr><tr><td>針電極</td><td>Roland Consult Stasche&フィンガーGmbH</td><td>U51-426-G-D</td><td>は、FVEP接地電極およびPERG参照電極</td></tr>末梢<tr><td>静脈カテーテルの静脈内BD</td><td>上海医療機器</td><td>383019</td>有限公司の<td>アトロピンおよびプロポフォールの静脈内アクセス</td></tr>のための使用 <tr><td></td><td>西安リポン企業連合管理有限公司</td><td></td><td>ヤギのイソフルラン麻酔を誘発</td></tr>する<tr><td>トロピカミドフェニレフリン点眼</td>薬<td>参天製薬、日本</td><td></td>5<td>%トロピカミドと5%フェニレフリン塩酸塩</td></tr><tr><td>視覚電気生理学デバイス</td><td>ゴーテック株式会社</td><td>GT-2008V-III</td><td>のFVEPおよびFVEPのための使用PERG</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Huamu動物用健康製品有限公司</td><td></td><td>キシラジン麻酔:キシラジン3mg / kg</td></tr><tr><td>ゾレチル50</td>の筋肉内注射 <td>Virbac</td><td></td><td>はサルのイソフルラン麻酔を誘発します</td></tr></tbody></table>

イン・ヴィヴォ 大型動物の眼球神経節細胞と視神経機能と構造を評価する方法

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

視神経は、眼球神経節細胞から軸索信号を収集し、脳に視覚信号を伝達する。視神経損傷の大型動物モデルは、サイズと解剖学の人間との類似性が高いため、げっ歯類モデルから臨床応用に新しい治療戦略を翻訳するために不可欠です。ここでは、視覚誘発電位(VEP)、パターン電解質(PERG)および光コヘレンス断層撮影(OCT)を含む大型動物における眼球神経節細胞(RGC)および視神経(ON)の機能および構造を評価するためのイン ビボ 法について説明する。ヤギと非ヒトの霊長類の両方がこの研究で採用された。 これらのインビボ 法を段階的に提示することで、異なる実験室間で実験再現性を高め、視神経障害の大型動物モデルの使用を促進したいと考えています。

図1A は、ヤギにおけるFVEPの代表的な結果を示す。同じフラッシュ強度の波形は相対的に類似していますが、波形を2回調べることをお勧めします。電子機器によって発生する電磁波は、収集された電気信号に干渉し、ベースラインノイズが高く、波形の再現性が悪くなります。したがって、このような干渉を避けるために、電気生理学的検査中に周囲の環境に接続された冗長な電子機器がないことを確認することが推奨され、実験結果の安定性と再現性を決定するために少なくとも2つの測定を繰り返すことをお勧めします。両眼にパッチを当てると、両眼の波形は完全に平坦で、フラッシュ刺激から波形が発生していることを示しています。 図1B は、ヤギにおけるPERGの代表結果を示す。安定性と高い信号により、各空間周波数で一度だけ測定して信頼性の高い波形を取得します。空間周波数が大きくなると、チェッカーボードのサイズが徐々にヤギの目の認識を超えていきます。だから我々は12.7 cpdで、PVEP波形が多く落ちたことを見ることができます。FVEPに似た、画面を閉じると波形が...

ここでは、ヤギとアカゲザルのいくつかの in vivo テスト(フラッシュビジュアル呼び起こされる電位、パターン電気レチノグラムおよび視共体断層撮影)を分解して、視神経とそのニューロンの構造と機能を理解します。

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...

ねえ皆さん。温州眼科病院のユツイ・ザンさんです。上の神経は、オレキシン神経節細胞からのエクソンを欠き、その後、脳に視覚信号を伝達する。上部神経損傷のより大きなモデルは、ロボットモデルからリンパの適用に新しい治療を翻訳するために不可欠です。ここでは、大型動物における上神経におけるオレキシン神経節細胞の構造および機能を評価するin vivo方法について説明する。この方法を段階的に提示することで、実験的な生殖障害を増加させ、より大きな眼科の眼科神経症の使用を促進したいと考えています。電子カミソリで剃ります。そして、70%アルコールを3回準備し、皮膚をきれいにし、皮下静脈を露出させます。末梢静脈ヒマを静脈内に挿入する。その後、アトロピンとプロポフォールを滴下します。6ミリメートルの気管管でヤギを挿管し、人工呼吸器に接続します。麻酔は、一定の2リットル管理流量で酸素中の3.5%イオブルランで維持された。温度センサーをヤギの舌の下に置きます。ヤギの耳の近位端に酸素飽和切断をクリップします。血圧カフを太ももの基部に結びます。クランプECGは順番に手足に切断します。その後、ヤギの重要な指標を監視することができます。髪を剃り、前頭骨の中心にベタジンと70%アルコールで皮膚を3回消毒します。はさみと爪を含む滅菌袋を開きます。はさみで頭蓋骨を露出させるために皮膚切開を行います。前頭骨の中心に埋め込まれたスチール製ネジ。髪を剃り、後頭部骨の2つの耳の中間点でベタジンと70%アルコールで皮膚を3回消毒します。皮膚切開を行います。後頭部骨の2つの耳の中間点に埋め込まれた鋼鉄ねじ。接地針電極は、前頭頭蓋骨ねじの下に皮下に挿入される。活性電極と参照電極は、電極インポテンスを低減するために、アリゲータークリップでそれぞれ前頭および後頭ねじに接続されています。片目にパッチを当てる。局所麻酔用点眼剤を眼表面に塗布する。両側の瞳孔は、点眼薬によって拡張される。ヤギの頭をガスで満たされた刺激装置に置きます。黒い毛布を刺激器の上に置き、ヤギの頭を5分間適応させます。まぶた鏡は瞳孔を完全に露出させるために使用される。電極組織の接触インポテンスを確認してください。同じ部屋の他の電気機器からの電磁干渉を避けるために、インポテンスがそれぞれ10キロメートル以下であることを確認してください。光刺激を受けずにベースラインノイズを確認します。FVEP 録音を開始します。なお、各光強度でのFVEP記録は2回行われる。乾燥しているように見える場合は、人工涙で角膜を湿らせたことに注意してください。対側の目に対して約手順を繰り返します。連続して異なる光強度でFVEP記録を開始します。各記録について、64のトレースが平均化され、1つの波形が得られます。FVEP波形における最初の正および活性ピークはP1およびN1として指定された。殺菌された地面の電極は耳たぶの中に置かれる。滅菌された活性電極と基準電極は、それぞれ中線と前頭骨および後頭骨に沿って皮下に挿入される。まぶた鏡は瞳孔を完全に露出させるために使用される。片目にパッチを当てる。連続して異なる空間周波数で他の目のパターンVEP応答を記録します。アリゲータークリップで接地電極に接続します。2つの滅菌された針の参照電極は両側の側面カンサスの1センチメートル後ろの皮の下に置かれる。まぶた鏡は瞳孔を完全に露出させるために使用される。2つの分解されたERG記録電極は、人工涙の局所適用後に両方の角膜を中心とする。2つの刺激装置は50センチメートルの視野の間隔の各目の前に置かれる。インポテンスが10キロメートル以下であることを確認してください。光刺激なしでベースラインノイズを追跡します。アンビュラントライトを目指します。連続して異なる空間周波数で同時に両眼から開始パターンERG記録。最後に、視覚刺激器やアクティブなコントロールを使わずに、画面を戻してERGパターンを記録する。バンドパスフィルタは、3つのCPDパターンERGに対して1~75ヘルツの範囲に設定されています。バンドパスフィルターは、その振幅に影響を与えることなく形状を滑らかにするために1〜50ヘルツです。波形の最初の正およびアクティブピークは、P1 と N1 として指定されます。N1から測定したパターンERG振幅は電極インポテンスを減ら P1.To、前頭皮膚の下に滅菌された針の基準が置かれる。そして、滅菌された針の参照電極は、片側の側面カンサスの後ろに1センチメートルの皮膚の下に置かれる。人工涙の局所適用に対して、電化されたERG記録電極を角膜上に設置する。片目にパッチを当てる。表示は50センチメートルの表示距離に配置されます。まぶた鏡は瞳孔を完全に露出させるために使用される。その後、ヤギはあごの残りの部分に置かれます。ヤギをカメラに合わせて、視神経ヘッドを共焦点スキャンレーザー眼科画像に送ります。開始ボタンをクリックして、検出終了フェーズに入ります。マシンの読み込みが完了するまで待ちます。黄色のスタートボタンを押して、正式なイメージングを開始します。ジョイスティックを調整して、赤外線画像を均等に照らし、画質を向上させます。右上の画面に直立した RET-0 画像が表示されるまで、カメラを前方にスライドさせます。ジョイスティックを変更して、水平のレティナル OCT イメージで均等に踊るようにします。ジョイスティックのボタンを押して、画像を自動的にキャッチします。このジョイスティックを保持して、イメージの実行が完了するまでライブイメージ画面の画質を維持します。次に、取得を押します。高品質の初期写真を選択します。右クリックして、[参照の設定]を選択します。フォローアップボタンを押して、プログラムが自動的にベースラインスキャンに現在のスキャンを一致させます。マッチしたら、ジョイスティックのボタンを押して、リアルタイム自動追跡を有効にします。測定ボタンをクリックして、測定プラットフォームに入ります。消しゴムを選択し、RFL ラインを拭きます。IPL と INL の境界を手動でアウトライン化するには、線描画ツールを選択します。赤と青の線の間には、GCC複合体があります。アカゲザルにおけるレティナ改変画像は、ヤギと同じ装置および手順を用いて行われる。図Aはヤギの代表的なFVEPを示す。図Bはヤギにおける代表的なパターンERG波形を示す。図Cは、アカゲザルにおける代表的なパターンFVEPを示す。そして、図Dはアカゲザルにおける代表的なパターンERG波形を示す。図2は、ヤギおよびアカゲザルの異なる末梢領域における視神経頭部およびGCC複合体の厚さの周りの代表的なレチナルOCT画像を示す。大型動物モデルは、翻訳研究において重要な役割を果たしています。多くの場合、小動物モデルにおける有望な治療効果は、ヒト患者に翻訳されなかった。本研究では、ヤギとアカゲザルにおけるFVEP、PERG、OCTのビデオプロトコルを発表した。このインビボ法は、緑内障虚血性または外傷性視神経障害および視神経炎などの様々な眼神経症のより大きなモデルに適用することができる。

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