Name: 活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ マウス腸管オルガノイドにおける活性酸素種検出法。蛍光発生プローブと顕微鏡・フローサイトメトリーにより、生細胞の酸化ストレスを定性的・定量的に解析する手法を解説。

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この研究は、フランス国立研究機関(ANR)の助成金17-CE14-0022(i-Stress)によって支援されました。

すべての動物実験は、パスツール使用委員会およびフランス農業省第2016-0022号の承認後に実施された。すべてのステップは、組織培養フード内で実行される。
1. 腸管オルガノイドを培養するための試薬及び材料の調製
<ol><li>増殖培養培地を調製するには、1xグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)溶液、10mMのHEPES、50ng/mLのマウスEGF、20μg/mLのマウスノギン500ng/mLのマウスR-Spondin1を添加した高度なDMEM/F-12を混合する( 材料表を参照)。陰窩の抽出中に培地を室温(RT)に放置する。 注: 未使用の培地をアリコートで -20 °C で凍結します。 凍結融解を避けてください。</li>
	<li>50 mL チューブに 40 mL のアドバンスト DMEM/F-12 を充填し、氷の上に保管します。 メモ:未使用の培地は4°Cに保ちます。 オルガノイドの継代に使用されます。</li>
	<li>細胞培養プレート(μ-Slide 8ウェルチャンバーおよび/または96ウェル丸底)をインキュベーター内で37°Cで予備温める。</li>
	<li>基底膜マトリックス(BMM)( 材料表を参照)のアリコートを氷上で解凍する(プロトコルを開始する前、または陰窩をメッキする少なくとも1時間前)。 メモ:BMMは、冷たく保たないとすぐに固まります。</li>
	<li>1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液をDPBS(DPBS-P/S)に加える洗浄/フラッシング溶液を調製する。</li>
	<li>100 mm のペトリ皿に 10 mL の冷たい DPBS-P/S を充填します。6 本の 15 mL チューブに 10 mL の DPBS を充填し、F1 から F6 までのラベルを付けます。</li>
	<li>DPBS中の0.5 M EDTAから希釈することによって30 mLの10 mM EDTA溶液を調製する。2 本の 15 mL チューブに 10 mL の 10 mM EDTA を充填し、E1 と E2 とラベルを付けます。</li>
	<li>すべての溶液を4°Cで予冷し、手順中は氷の上に保管してください。</li>
</ol>腸管オルガノイド培養
<ol><li>生後8~10週齢のLgr5-EGFP-IRES-creERT2(Lgr5-GFP)マウスを国の規則および規制に従って屠殺する。</li>
	<li>十二指腸(胃から5cm)と回腸(盲腸から10cm)の間の領域を含む空腸を5〜8cm集め、氷の上の冷たいDPBS-P/Sに保管してください。</li>
	<li>5〜10mLの冷たいDPBS-P/Sで洗い流して腸の内容物をきれいにしてください。 注:自家製のフラッシングシリンジは、200 μLのチップを10 mLシリンジノズルに差し込むことで入手できます。</li>
	<li>ボールチップハサミ( 材料表を参照)を使用して腸を縦方向に開きます(組織の損傷を防ぐため)。</li>
	<li>鉗子を使用して、室温で冷たいDPBS-P/Sを入れたシャーレに組織を移し、振ってすすぎます。</li>
	<li>プラスチック製のパスツールピペットで、吸引によって腸をつかみ、10mLの冷たい10mM EDTAを含むE1 とラベル付けされた15mLチューブに移します。</li>
	<li>チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートする。</li>
	<li>プラスチック製パスツールピペットを用いて、10mLのDPBSを含むチューブ F1 に組織を移す。2分間の渦(通常の渦では、手でチューブを持ち、腸がうまく渦巻くようにします)。</li>
	<li>10 μLの画分をシャーレに入れ、顕微鏡下で画分の品質を評価した。 注:すべての渦ステップは最高速度で実行され、各フラクションの品質は顕微鏡下で評価する必要があります(図1)。</li>
	<li>プラスチック製のパスツールピペットで、吸引によって腸をつかみ、10mLのDPBSと渦を含むチューブ F2 に2分間移します。</li>
	<li>ステップ2.10を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F3 に組織を2分間移す。</li>
	<li>ステップ2.6と同様にEDTAインキュベーションを繰り返し、10mM EDTAを含むチューブE2 に組織を移す。</li>
	<li>チューブを3回反転させ、氷上で5分間インキュベートする。</li>
	<li>ステップ2.10を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F4 に組織を3分間移す。</li>
	<li>ステップ2.14を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F5 に組織を3分間移す。</li>
	<li>ステップ2.15を繰り返し、10mLのDPBSおよび渦を含むチューブ F6 に組織を3分間移す。</li>
	<li>70 μm のセルストレーナーを通して重力でろ過する最良の画分を 50 mL チューブ (氷上) に結合して、絨毛や重大な破片を除去します。 注:通常、F5とF6は、多数の地下室とより少ない破片を含む画分です。</li>
	<li>陰窩を4°Cで150 x g で3分間回転させます。</li>
	<li>チューブを空にし、ペレットを機械的に破砕し、5mLの冷たいDMEM/F12を加える。</li>
	<li>10μLの懸濁液をシャーレに入れ、顕微鏡下でアリコート内に存在する陰窩の数を手動でカウントする。 メモ: 単一細胞や小さな破片はカウントしないでください。</li>
	<li>1ウェルあたり300個の陰窩が播種されていること、Wはウェルの数、Nは懸濁液の10μLのうち数えられた陰窩の数を考慮すると、μLで必要な陰窩懸濁液の体積(V)を計算します。陰窩を新しい15mLチューブに移す。 メモ: V = 300 x 幅 x 10/N計画された実験で少量を使用する場合は、1.5mL遠沈管を使用することができる。</li>
	<li>陰窩を4°Cで200 x g で3分間回転させます。</li>
	<li>ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>ペレットを機械的に破砕し、成長培地を穏やかに添加して、90クリプト/μLの濃度を得る。</li>
	<li>希釈されていないBMMを2倍量加えて、最終濃度が30クリプト/μLになるようにします。ミックスに気泡を導入せずに慎重に上下にピペットを沸かします。 注:BMMの固化を避けるために、チューブを氷の上に保管してください。</li>
	<li>プレート10 μLの陰窩/ BMMを各ウェルに混合する。フローサイトメトリー分析には、丸底の96ウェルプレートを使用してください。ドームとして各ウェルの中央に10 μLを分配する。イメージングには、μスライド8ウェル( 材料表を参照)を使用し、10μLを薄層として堆積させます。 注:オルガノイドをイメージングアッセイ用の薄い層としてプレートし、詳細なイメージングを可能にします。</li>
	<li>プレートをRTで5分間放置して、BMMが固化できるようにします。プレートを37°Cおよび5%CO2 で15分間インキュベーターに入れます。</li>
	<li>各ウェルに250 μLの成長培地を加え、BMMが剥離しないように注意する。</li>
	<li>プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。</li>
	<li>培養の4日目から6日目の間にROS分析を行う。さもなければ、培地を交換し、いくつかの長い出芽構造が出現した後、および死んだ細胞がオルガノイド内腔に蓄積したときにオルガノイドを分割する。</li>
</ol>3. オルガノイド継代
<ol><li>培養6日目 から小腸オルガノイドの継代を開始し、有意な出芽構造が形成され、オルガノイドの内腔が暗くなった。 注:オルガノイドの内腔は、死んだ細胞、破片、粘液の蓄積のために暗くなります。分割する前にオルガノイドを過剰に成長させないでください。分割比はオルガノイドの成長に依存する。オルガノイドを6日目に1:2、10日目に1:3の比率で継代することが推奨される。</li>
	<li>15 mL チューブに 4 mL の冷たいアドバンスト DMEM/F-12 を充填し、氷の上に保管します。 注: ここでは、96 ウェル培養プレートの容量が提供されています。別の形式を使用している場合は、それに応じて音量を調整します。</li>
	<li>BMMドームに触れることなく、ウェルからピペットまたは真空ポンプで培地を慎重に吸引し、廃棄してください。</li>
	<li>1ウェルあたり100 μLのコールドアドバンストDMEM/F-12を加える。ピペットを上下に動かしてBMMを分解し、ウェルの内容物を15mLチューブに移します。</li>
	<li>200 μL のコールドアドバンスト DMEM/F-12 でウェルを洗浄し、同じチューブに集めます。 注:同じ実験条件から複数のウェルを継代する場合、ウェルの内容物を同じ15mL収集チューブにプールすることができます。</li>
	<li>15 mL の収集チューブを 100 x g で 4°C で 5 分間回転させます。</li>
	<li>上清を捨て、1mLのコールドアドバンストDMEM/F-12をペレットに加える。P1000チップを使用して、P10チップ(フィルターなし)とピペットを少なくとも20回上下に巻き上げます。</li>
	<li>4 mL の冷たいアドバンスト DMEM/F-12 をチューブに加えます。300 x g で4°Cで5分間スピンします。</li>
	<li>ペレットを乱すことなく、ピペットまたは真空ポンプで上清を吸引する。その後、ペレットを機械的に破壊する。</li>
	<li>増殖培養液で希釈したBMMを加える(2:1比)。ミックスに気泡を導入せずに慎重に上下にピペットをピペットします。</li>
	<li>プレート10 μLの陰窩/ BMMを各ウェルに混合する。</li>
	<li>プレートをRTで5分間保持して、BMMが固化できるようにします。プレートを37°Cおよび5%CO2 で15分間インキュベーターに入れます。</li>
	<li>各ウェルに250 μLの成長培地を加える。 メモ: BMM を切り離さないように注意してください。</li>
	<li>プレートを37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに入れます。</li>
</ol>4. 腸管オルガノイドの酸化ストレスを評価するための試薬および材料の調製
<ol><li>阻害剤N-アセチルシステイン(NAC)の250mMストック溶液( 材料表を参照)を調製し、10mgを245μLのDPBSで再懸濁する。1 mMの最終濃度で使用してください。</li>
	<li>誘導剤Tert-ブチルヒドロペルオキシド(tBHP)の50 mMストック溶液を水で70%、3.22 μLを496.8 μLのDPBSで希釈する。最終濃度200 μMで使用してください。</li>
	<li>フローサイトメトリー試験では、原液をDMSOで1/10希釈して、蛍光発生プローブの250μM作業溶液( 材料表を参照)を調製します。最終濃度1 μMで使用してください。 注:製造元の説明書に示されているように、蛍光発生プローブは光と酸素に敏感です。株式とアリコートは、何度も開いたり閉じたりしてはいけません。</li>
	<li>イメージング研究のために、原液をDMSOで1/2希釈することによって蛍光発生プローブの1.25 mM作業溶液を調製する。最終濃度5 μMで使用してください。</li>
	<li>DPBS中の0.1 μg/mL DAPIの最終溶液を調製し、フローサイトメトリーアッセイにおける死細胞識別に使用する。</li>
	<li>ヘキスト33342をDPBSで1.25 mg/mLに希釈する。イメージングアッセイにおける核染色に使用する最終濃度を 5 μg/mL で使用します。</li>
	<li>フェノールレッドを含まないDMEMを37°Cで温める。 注:これらのステップでは、 図2Aに示された条件を使用して、任意のアッセイに含める必要がある陰性対照および陽性対照の使用について説明します。アッセイは、抗酸化または酸化促進化合物を試験するために使用することができる。ステップは同じであり、唯一の違いは、蛍光原性染料を使用する前に化合物を添加する場合である。</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡による3Dオルガノイドの酸化ストレスの可視化
<ol><li>μ-Slide 8ウェルチャンバーに播種したオルガノイドを取り、対応するウェルに1 μL NACストック溶液を加えて、1mMの最終濃度を得た。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で1時間インキュベートする。</li>
	<li>対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加え、最終濃度200 μMを得た。</li>
	<li>37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。</li>
	<li>蛍光発生プローブの1.25 mM希釈液を1ウェルあたり1 μL加え、終濃度5 μMを得た。</li>
	<li>ヘシュトの1.25 mg/mL希釈液を1ウェルあたり1 μL加え、最終濃度5 μg/mLを得た。</li>
	<li>37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。</li>
	<li>BMM を乱さずにメディアを取り外します。穏やかに、フェノールレッドを含まない250μLの温かいDMEMを加える。 注:長期的な買収が計画されている場合は、フェノールレッドを含まないDMEMに成長因子化合物を追加します。</li>
	<li>蛍光発生プローブ(ROS)を検出する熱チャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を用いてオルガノイドを画像化する。 注:蛍光発生プローブの励起/放出(ex/em)は644/665、ヘキスト(核)のex/emは361/486、GFP(Lgr5-GFPマウス由来の腸幹細胞)のex/emは488/510です。63倍の油浸対物レンズは、幹細胞のシグナルを検出するために使用されます。サンプル間でレーザー設定を変更しないでください。ROS生産の概要を可能にするために、20倍の目標を使用することができます。</li>
	<li>ポジティブコントロールを使用してROS信号のレーザー強度と時間露出を設定し、この信号がネガティブコントロールで低くなっていることを確認します。</li>
	<li>スライドの接眼レンズスクリーンを用いて、GFPオルガノイドを同定し、発現し、レーザー強度を調整した。 メモ: この手順は手動で実行されます。</li>
	<li>位置を定義して、オルガノイド全体のステッチ画像を取得します。25 μm(ステップサイズ5 μm)のzスタックをセットアップして、1層の細胞を示すオルガノイドの断面を得た。 メモ:セットアップを最適化するには、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。生細胞を使用して、獲得はインキュベーション終了後1時間以内に行うべきである。</li>
	<li>オープンソースの画像処理ソフトウェアで画像を開きます( 材料表を参照)。</li>
	<li>Zスタックを調べて、オルガノイドの中央がよく表されているセクションを選択し、選択した領域で新しい画像を作成します。</li>
	<li>手順 5.15.1 ~ 5.15.5 に従って画像を定量化します。<ol>
<li>フリーハンドラインツールを選択します。</li>
		<li>核の後に線を引きます。 注:幹細胞のみを解析する場合は、GFP陽性細胞を示す領域のみを選択します。</li>
		<li>線幅を広げて、管内破片を含めずにセル層を線で覆います。</li>
		<li>ROS信号のチャンネルを選択し、選択した領域の蛍光強度を測定し、値に注釈を付けます。</li>
		<li>シグナルがないところに線を引き、前の値に減算されるバックグラウンドの蛍光強度を測定して、最終的な強度を取得します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. フローサイトメーターを用いた解離したオルガノイドの酸化ストレスの定量化
<ol><li>ネガティブコントロール用のウェルに1 μL NACストック溶液を加え、1 mMの最終濃度を得た。 メモ:96ウェルの丸底プレートにメッキされたオルガノイドを使用してください。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で1時間インキュベートする。</li>
	<li>対応するウェルに1 μL tBHPストック溶液を加え、最終濃度200 μMを得た。</li>
	<li>37°Cと5%CO2で30分間インキュベートする。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットで、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておきます。</li>
	<li>100 μLのトリプシンを加え、マルチチャンネルピペットで、ピペットを少なくとも5回上下させてBMMを破壊します。</li>
	<li>37°Cと5%CO2で5分以内にインキュベートする。</li>
	<li>マルチチャンネルピペットで、ピペットを少なくとも5回上下させてオルガノイドを解離させます。</li>
	<li>RTで300 x g で5分間スピンします。</li>
	<li>プレートを反転させて上澄み液を捨てる。ステップ6.3で回収した培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁する。</li>
	<li>250 μM 希釈液から 1 ウェルあたり 1 μL を加え、37 °C および 5% CO2 で 30 分間インキュベートします。 メモ:機器の設定に必要なウェルに蛍光プローブを追加しないでください(図2B)。</li>
	<li>RTで300 x g で5分間スピンします。</li>
	<li>細胞を250 μLの0.1 μg/mL DAPI溶液で再懸濁する。サンプルを適切なフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に保持して分析を進めます。 メモ:DAPIの代わりにPBSを計測器の設定に必要なウェルに追加します(図2B)。</li>
	<li>モノ染色サンプルを使用して、各蛍光色素分子の染色されていないコントロールおよびレーザー電圧の順方向散乱電圧と側方散乱電圧設定を最適化します。</li>
	<li>適切なゲーティング戦略 (図 4A) を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。 注: 50,000 イベントが推奨されます。詳細な集録設定は、使用する機器によって異なります。</li>
</ol>

<ol><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li>
<li>Holmström, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li>
<li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).</li>
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<li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li>
<li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).</li>
<li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

この研究は、マウスの空腸陰窩を単離し、それらを3Dオルガノイドに培養し、ROS感受性蛍光発生プローブとオルガノイド全体の定性顕微鏡イメージングおよびオルガノイド解離後の単一細胞に対するフローサイトメトリーを用いた定量的ROS測定と組み合わせることによって、オルガノイド中のROSを分析するための段階的なプロトコルを提供する。
この方法の最初の重要なステップは、暗号抽出手順です。実際、陰窩調製の質は、オルガノイド形成を成功させる鍵である。したがって、濃縮されたクリプトと少数の細胞破片または死にかけている細胞を有する画分を得ることが不可欠である。解離はマウスの年齢および健康状態によって変化する可能性があるため、陰窩はプロトコルに示されたものとは異なる画分で見出され得る。EDTAインキュベーションの数は、それに応じて変更することができる。フラクション4の後に陰窩が剥離していないように見える場合は、3分間のEDTAインキュベーションを繰り返す必要があります。逆に、最初のEDTAインキュベーション後にクリプトがすでに切り離されているとします。その場合、2回目のEDTAインキュベーションは必要な...

活性酸素種(ROS)は、細胞代謝の天然の副産物である。また、膜結合型NADPH-オキシダーゼ(NOX)やデュアルオキシダーゼ(DUOX)などの特殊な酵素複合体によっても積極的に生成でき、スーパーオキシドアニオンと過酸化水素を生成します1。抗酸化酵素とROSスカベンジャーを発現させることにより、細胞は酸化還元バランスを微調整し、組織の恒常性を保護することができます2。ROSは細胞に対して非常に毒性が高く、DNA、タンパク質、脂質に損傷を与える可能性がありますが、それらは重要なシグナル伝達分子です2。腸上皮では、幹および前駆細胞の増殖に中等度のROSレベルが必要です3。高いROSレベルは、アポトーシスにつながります4。慢性酸化ストレスは、炎症性腸疾患や癌などの多くの胃腸疾患に関連しています。一例として、Wnt駆動型腸癌のマウスモデルにおいて、NADPHオキシダーゼの活性化によるROS産生の上昇が癌細胞の過剰増殖に必要であることが判明した5,6。腸細胞、特に幹細胞、幹細胞が酸化ストレスをどのように管理し、細胞環境がこの能力にどのように影響するかを定義することは、この病気の病因をよりよく理解するために不可欠です7。
組織において、異なる細胞型は、その機能および代謝、ならびに様々なレベルの酸化分子および抗酸化分子の発現に応じて変化し得る基礎酸化状態を提示する4,7。インビボでのROSモニタリングは非常に困難です。酸化還元状態に応じて蛍光を発する細胞透過性色素は、生細胞や動物における細胞ROSを可視化・測定するために開発されている。しかし、その有効性は、生体組織内での拡散と迅速な読み出しに依存しているため、動物モデルでの使用が困難です8。
過去には、ROS生成に対する化合物の効果の研究は細胞株を用いて行われていたが、これはin vivoの状況を反映していない可能性がある。Clevers9のグループによって開発された腸オルガノイドモデルは、腸の初代細胞のエクスビボでの増殖を可能にする。定義された成長因子の存在下でのマトリックス中の腸陰窩の培養は、オルガノイド(ミニ腸)と呼ばれる三次元構造をもたらし、異なる上皮系統からの細胞が内部管腔を裏打ちし、腸幹細胞が小さな陰窩様突起に存在する陰窩絨毛組織を再現する。
ここでは、このモデルを利用して、市販のROS感受性色素をオルガノイド培地に添加することにより、初代腸管細胞の酸化ストレスを単一細胞分解能で調べる簡便な方法について説明する。
プレートリーダーは、全集団におけるROS産生を検出するためによく使用されます。このプロトコルは、フローサイトメトリーまたはイメージングアッセイを使用して、遺伝子改変細胞または特定の抗体染色を用いて特定の細胞型におけるROSを検出する。この研究は、マウス腸管オルガノイド培養と共焦点イメージングによるROS可視化、フローサイトメトリーによる定量化を含む。Lgr5-GFPマウス由来小腸オルガノイドを用いて、異なる治療を受けた際の腸管幹細胞における酸化ストレスのレベルを特異的に解析することができる。このプロトコルは、選択した化合物でオルガノイドを刺激した後、微生物叢由来のムラミルジペプチド(MDP)10などの外因性分子がROSバランスに及ぼす影響をテストするために適合させることができる。

<table><tbody><tr><td>マウス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth 培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td><td>ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, minus vitamin A</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td>ストック濃度:50x</td></tr><tr><td>GlutaMAX(グルタミン)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050038</td><td>ストック濃度:100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ThermoFisher</td><td>15630056</td><td>ストック濃度:1 M</td></tr><tr><td>マウスEGF</td><td>R&D</td><td>2028-EG-200</td><td>ストック濃度: 500 & マイクロ;PBS</td></tr><tr><td>マウスNoggin</td><td>R&D</td><td>1967-NG/CF</td><td>ストック濃度: 100 & マイクロ;g/mL in PBS</td></tr><tr><td>マウス R-spondin1</td><td>R&D</td><td>3474-RS-050</td><td>ストック濃度: 50 & マイクロ;PBS</td></tr><tr><td>N-2サプリメント</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td>液中g/mL <td>ストック濃度:100x</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>ストック濃度:100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 &micro;g/mL of streptomycin)</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;m細胞ストレーナー</td><td>コーニング</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル丸底</td><td>コーニング</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>ボールチップシザー</td><td>ファインサイエンスツール GMBH</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>CellROX&reg;深紅試薬</td><td>ThermoFisher</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-ジアミジノ-2-ph&eacute;</td><td>><><ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Stock at 10 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS 1x no Calcium no Magnesium (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>ストック 10 mg/mL</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子の減少、フェノールレッドフリー(基底膜マトリックス)</td><td>コーニング</td><td>356231</td>冷蔵庫<td>で解凍o/nを受け取ったら、氷上で1時間保持し、500mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>&micro;-スライド 8 ウェルチャンバー</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>tert-ブチルヒドロペルオキシド (tBCHP) 溶液 (70%wt.H2O2)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッドなし (トリプシン)</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA、pH8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>組織解離時の細胞死を最小限に抑えるために使用されるロック阻害剤</td></tr><tr><td>プログラムおよび機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td><td>ThermoFischer</td><td></td><td>フローサイトメーターアナライザー</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td><td>画像生成</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>FACS analysis</td></tr><tr><td>Observer.Z1</td><td>ツァイス</td><td></td><td>共焦点システム</td></tr><tr><td>Opterra (スイープフィールド共焦点)</td><td>ブルカー</td><td></td><td>共焦点システム</td></tr><tr><td>高速EMCCDカメラ Evolve Delta 512</td><td>フォトメトリクス</td><td></td><td>共焦点システム</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td></td><td>統計分析</td></tr></tbody></table>

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

活性酸素種(ROS)は、腸の恒常性維持に不可欠な役割を果たす。ROSは細胞代謝の天然の副産物である。それらは、抗菌応答および創傷治癒に関与するので、粘膜レベルでの感染または傷害に応答して産生される。それらはまた、重要な二次メッセンジャーであり、細胞の成長および分化を含むいくつかの経路を調節する。一方、過剰なROSレベルは酸化ストレスをもたらし、これは細胞にとって有害であり、慢性炎症または癌のような腸疾患に有利であり得る。この研究は、市販の蛍光発生プローブを用いたライブイメージングおよびフローサイトメトリーによって腸内マウスオルガノイド中のROSを検出する簡単な方法を提供する。ここでのプロトコールは、GFPで遺伝的に標識された腸幹細胞の分析によってここに例示される、腸オルガノイドにおける酸化還元バランスを調節し、特定の腸細胞型におけるROSレベルを検出する化合物の効果をアッセイすることを記載する。このプロトコルは、他の蛍光プローブと共に使用され得る。

記載されたプロトコールの概念実証として、腸幹細胞がモザイクGFP発現を示すLgr5-eGFP-IRES-CreERT2マウス系統から得られた陰窩が使用され、これはBarkerらによって確立され、腸幹細胞10 を最初に特徴付け、それらのGFP発現に基づいてこれらの細胞をマッピングすることを可能にする。これにより、異なる治療時に特定の細胞型集団におけるROSレベルを比較するためのモデルが提供される。ROS阻害剤(NAC)と、細胞ROSに作用してそのレベルの変化を可視化することが知られている誘導物質(tBHP)が用いられた。
図1Aおよび図1Bは、腸管オルガノイド培養のための陰窩抽出手順の間に得られた画分F1およびF4の代表的な画像を示す。各画分は、抽出手順中に顕微鏡または双眼でチェックして、陰窩の剥離に従い、絨毛、単一細胞、または破片ではなく、陰窩に富んだ画分を定義する必要があります。次に、選択した画分を一緒にプールし、70μmのセルストレーナー...

本プロトコールは、定性的イメージングおよび定量的サイトメトリーアッセイを用いて腸マウスオルガノイド中の活性酸素種(ROS)を検出する方法を記載する。この研究は、選択された化合物がROSに及ぼす影響を試験するために、他の蛍光プローブに拡張される可能性があります。

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

この方法は、蛍光発生プローブを用いてオルガノイドとしてインビトロで培養した生きた初代細胞における細胞ROSレベルを評価するための細胞生物学の分野において貴重なツールである。この技術の主な利点は、顕微鏡検査によって無傷の腸内オルガノイドにおいてROSを定性的に可視化し、96ウェルプレートを用いたフローサイトメトリーによって解離細胞において定量的に分析できることである。この方法は、他のオルガノイドモデルに適用することができ、代替蛍光センサを使用して、異なる細胞経路を解析することができる。このプロトコルを初めて適用する前に、実験者はオルガノイドの培養と継代に精通している必要があります。私たちのプロトコルはスクリーニングアプローチによく適応していますが、初心者はいくつかのサンプルから始めるべきです。手順を実演するのは、研究室のエンジニアであるSophie Dulauroyです。生後8~10週のLgr5-GFPマウスを犠牲にした後、十二指腸と回腸の間の空腸包接領域を5~8センチ採取し、抗生物質を添加した冷たいDPBSに氷上に置きます。次に、抗生物質を含む5〜10ミリリットルの冷たいDPBSで洗い流すことによって腸内容物をきれいにする。次に、ボールチップハサミを使用して、腸を縦方向に開き、鉗子を使用して、抗生物質を含む冷たいDPBSを含むペトリ皿に組織を移す。皿の中のティッシュを振ってすすいでください。次に、プラスチック製のパスツールピペットを使用して吸引して腸をつかみ、10ミリリットルの冷たい10ミリモルEDTAを含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを3回反転させ、氷上で10分間インキュベートする。インキュベーション後、10ミリリットルのDPBSおよび渦を含むチューブに組織を2分間移す。直ちに10マイクロリットルの画分をペトリ皿に加え、顕微鏡を使用して画分の品質を評価する。DPBS含有チューブで2回の移送を行った後、各移送の間に2分間ボルテックスをかけ、以前に実証したように、EDTA中で腸を氷上で5分間インキュベートする。DPBSを含むチューブで3回連続して移送した後、各移送の間に3分間のボルテックス処理を行い、選択したチューブを3回反転させ、70ミクロンのセルストレーナーでフィルタリングすることにより、最良の画分を50ミリリットルのチューブに結合します。その後、陰窩を回転させ、上清を捨て、ペレットを機械的に破壊してから、5ミリリットルの冷たいDMEM F12を加える。顕微鏡下で10マイクロリットルのアリコートに存在する陰窩の数を手動で数えます。カウント後、再びクリプトを回転させ、上清を慎重に取り除きます。次いで、ペレットを機械的に破砕し、増殖培地をチューブに加え、マイクロリットル当たり90クリプトの濃度を得た。次に、希釈されていない基底膜マトリックスまたはBMMを2倍量加えて、マイクロリットルあたり30クリプトの最終濃度を得、混合物に気泡を導入せずに懸濁液を上下に慎重にピペットします。フローサイトメトリー分析のために、プレート10マイクロリットルの陰窩BMMは、予め加温された丸底96ウェルプレートの各ウェルの中央にドームとして混合する。そしてイメージングのために、予め加温されたマイクロスライド8ウェルチャンバーに10マイクロリットルの混合物を薄層として堆積させる。BMMを室温で5分間固化させた後、プレートを摂氏37度および二酸化炭素5%のインキュベーターに入れる。15分後、BMMが剥離しないように注意しながら、各ウェルに250マイクロリットルの成長培地を加え、プレートをインキュベーターに入れた。共焦点顕微鏡によって酸化ストレスを視覚化するために、オルガノイドで播種されたマイクロスライド8ウェルチャンバーの対応するウェルに1マイクロリットルのn-アセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、さらに30分間インキュベートする。次に、ウェル当たり1.25ミリモル希釈の蛍光発生プローブを1マイクロリットル加え、続いて1ミリリットル当たり1.25ミリグラムのヘキスト溶液を1マイクロリットル加える。さらに30分間のインキュベーションの後、BMMを乱すことなく培地を除去し、フェノールレッドを含まない250マイクロリットルの温かいDMEMを静かに加える。蛍光発生プローブを検出する熱チャンバーとガス供給を備えた共焦点顕微鏡を用いてオルガノイドを画像化する。ポジティブコントロールを使用して、ROS信号のレーザー強度と時間露出を設定し、この信号がネガティブコントロールで低くなっていることを確認します。次に、接眼レンズを用いて、スライドをスクリーニングしてGFPを発現するオルガノイドを同定し、レーザー強度を調整する。25マイクロメートルのzスタックをセットアップし、位置を定義してオルガノイド全体のステッチ画像を取得し、細胞の1層を示すオルガノイドのセクションを取得します。オルガノイドを含む96ウェル丸底プレートの陰性対照ウェルに1マイクロリットルのnアセチルシステインストック溶液を加える。1時間のインキュベーションの後、対応するウェルに1マイクロリットルのtert-ブチルヒドロペルオキシド原液を加え、30分間インキュベートする。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、取り付けられたBMMを乱すことなく培地を取り出し、別の96ウェル丸底プレートに移します。このプレートは脇に置いておきます。次に、100マイクロリットルのトリプシンを添加し、マルチチャンネルピペットを使用して、ピペットを5回上下させてBMMを破壊する。短い5分間のインキュベーションの後、2回目に上下にピペッティングすることによってオルガノイドを解離させる。プレートを回転させ、プレートを反転させて上澄みを捨てる。別の96ウェルプレートに以前に集めた培地を対応するウェルに戻し、上下に5回ピペッティングして細胞を再懸濁する。次に、1マイクロリットルの蛍光発生プローブを添加し、30分間インキュベートする。その後、プレートを再び回転させ、細胞を250マイクロリットルのDAPI溶液で再懸濁する。サンプルをフローサイトメトリーチューブに移し、チューブを氷上に保持します。モノステインされたサンプルを使用して、各蛍光色素分子の染色されていないコントロールおよびレーザー電圧の順方向散乱電圧および側方散乱電圧設定を最適化します。次に、適切なゲーティング戦略を使用して、少なくとも 20,000 個のイベントを収集します。ROS染色およびオルガノイドの代表的な共焦点画像は、NAC阻害剤の存在下では、オルガノイドの内腔に含まれる死細胞からのシグナルのみが見えることを示した。非処理オルガノイドでは、特にGFP陽性細胞において基礎ROSレベルが見られ、幹細胞が分化細胞よりも高いROSを産生することを証明している。GFP陽性細胞は、蛍光発生プローブの存在下でインデューサーと共により有意な細胞質シグナルを提示し、特に治療後の幹細胞においてROSレベルが増加することを実証している。腸内オルガノイドにおけるROS産生のフローサイトメトリー分析は、インヒビターによる刺激後に基礎ROSレベルが低下し、インデューサーによるチャレンジ後に増加することを示している。インヒビターで前処理し、次いでインデューサーで刺激された細胞は、インデューサー単独で刺激されたものよりも低いレベルが存在する。GFP陽性としてゲーティングされた幹細胞に関する同様の解析では、阻害剤処理時にROSレベルが3.5倍低下し、非刺激細胞に対してインデューサー処理時に4倍の増加が示されています。この手順を試みるとき、ユーザーはオルガノイドの操作と解離の間に細胞ストレスを制限することを忘れないでください。さらに、ROSを分析する際には、ポジティブコントロールとネガティブコントロールを常に含める必要があります。この手順に続いて、固定されたインタクトなオルガノイドに対する免疫蛍光染色、細胞選別、および遺伝子発現解析によって解析を補完し、ROS調節に関するさらなる洞察を得ることができます。このビデオを見た後、マウスの腸内オルガノイドを成長させる方法、無傷のオルガノイドのライブイメージング分析を実行する方法、およびフローサイトメトリー分析のために腸内器官を処理する方法を知っている必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この動画では、培養オルガノイドの酸化ストレスを可視化する技術について説明しています。この研究は、さまざまなROSモジュレーターで処理した後、オルガノイドに存在するさまざまな細胞タイプにおけるROS蓄積による酸化ストレスのレベルを理解するのに役立ちます。...

蛍光プローブイメージングアッセイ:活性酸素種誘導剤処理した培養腸管オルガノイド細胞の酸化ストレスを可視化する技術

このビデオは、GFP発現トランスジェニックマウスから得られた3D腸オルガノイドのROSレベルを定量化するフローサイトメトリーアッセイを示しています。この方法は、ROS産生に対する試験化合物の有効性を調査するためのin...

酸化ストレスを定量化するためのフローサイトメトリーアッセイ:蛍光プローブを使用して腸管オルガノイドの活性酸素種を定量するアッセイ

我々は、定性的および定量的研究のための様々なアメーバおよび哺乳動物細胞モデルに適用することができる反応性酸素種（ROS）の測定のためのプロトコルのセットを適合。...

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遺伝子にコードされた蛍光センサーを用いた毒性酸化ストレスの評価へのアプローチをイメージング

L-012、化学発光のルミノール アナログを視覚化し、マウス切除創傷モデルで生成される活性酸素種 (ROS) を定量化を利用した、非侵襲的生体内でイメージ投射は、効率的でコスト効果の高い、プロトコルについて述べる.

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生きているオルガノイドにおける腸のバリア破壊の調査

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2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。...

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

学ぶ マウス腸管オルガノイドにおける活性酸素種検出法。蛍光発生プローブと顕微鏡・フローサイトメトリーにより、生細胞の酸化ストレスを定性的・定量的に解析する手法を解説。

活性酸素種感受性蛍光発生プローブを用いたマウス腸管オルガノイドの酸化ストレス解析

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