蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

このプロトコルは、インビボイメージングを補完するものです。これは、放射性トレーサーの細胞型および細胞レベルの定量を可能にし、これはインビボで得られるものとは異なるスケールである。この技術の主な利点は、その感度と、放射性リガンドの使用と細胞選別によって与えられる細胞分解能です。

カメラの電源を入れ、オペレーティングソフトウェアをロードします。ホームXYZステージボタンをクリックして、ホーミングを実行します。1 つの 10 分間のスキャン取得で構成される実験を設定します。

ステップモードを微調整に設定し、集録モードをリストモードに設定して、発光スペクトル全体を記録します。ベッドをセットアップし、温暖化システム、呼吸センサー、麻酔が機能的で安全であることを確認します。次に、動物の頭が置かれる場所にファントムを置きます。

画面の下部にある3つの画像の助けを借りて、3次元のカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。ファントムと動物のスキャン音量が同じであることを確認します。ファントムスキャンを開始し、以前に設定したパラメータを使用して後続のキャリブレーションを行います。

放射能実験の許可を受けた適切な環境で作業すること。100マイクロリットルの酢酸中のトリブチルイン前駆体100マイクログラムをヨウ化ナトリウムおよび5マイクロリットルの37%パー酢酸と共に、グローブボックス内に置かれたサーモサイクラーで20分間インキュベートする。50%アセトニトリルを用いて反応物を水で希釈し、500マイクロリットルの容量に達する。

500マイクロリットルの希釈反応物を逆相カラムに注入する。7ミリモルのリン酸中で5~95%ACNを10分間実行した直線勾配HPLCでCLINDEを単離します。単離物を水で希釈して最終容量10ミリリットルを達成し、希釈反応物を濃縮カラムに注入する。

カラムからCLINDEを300マイクロリットルの無水エタノールで溶出し、真空遠心分離機中で室温で40分間インキュベートすることによってエタノールを蒸発させる。CLINDEを含む残渣を300マイクロリットルの生理食塩水で希釈し、原液を作成する。その放射能を測定した後、原液を生理食塩水で希釈し、500マイクロリットル中の0.037メガベクレルの溶液を得た。

コールドリファレンス化合物で検量線を作成し、線形回帰式:YをAX+Bに等しく解してAとBの係数を求めます。Xは冷たい化合物の質量を表し、Yは曲線の下の面積を表す。放射性配位子の曲線下面積を確認し、検量線と放射性配位子の曲線下面積に基づいて450ナノメートルの紫外線吸光度を測定する。

質量を推定し、放射性リガンドの活性を測定する。比活性がマイクロモルあたり1,000ギガベクレルより大きいことを確認してください。[画像の更新]ボタンをクリックして、動物の位置を更新します。

3次元の画面の下部にある3つの画像の助けを借りてカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。1 分間の 60 フレームで構成される 60 分間のスキャンで実験を設定します。最初に設定した他のすべてのパラメーターを再利用します。

500マイクロリットルの放射性放射性トレーサーを注入し、次いで300マイクロリットルの滅菌0.9%塩化ナトリウムでチューブを洗い流す。同時に、[取得の開始]をクリックしてスキャンを開始します。スキャン再構築ソフトウェアを開き、データセットを開き、スキャンのフォルダーに作成されたファイル名パラメーター ファイルを探します。

目的の同位体を選択します。リストモードパラメータは、このステップで複数の同位体選択を可能にすることに注意してください。原稿で説明されているように、ボクセルサイズ、サブセットの数、反復などのさまざまな再構成パラメータを設定します。

出力形式を NIFTI として選択し、「SPECT 再構成の開始」を選択します。平らな金属のヘラとカミソリの刃を使用して、脳の関心領域を解剖します。組織を2ミリリットルの遠沈管に入れ、得られた組織を秤量する。

サンプルをカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSS1ミリリットルの2ミリリットルの遠沈管に入れ、室温で2分間300倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。1,900マイクロリットルの酵素を加え、5分ごとに反転させてチューブを攪拌しながら、摂氏37度で15分間インキュベートする。30マイクロリットルの酵素ミックスを2つ加える。

1,000マイクロリットルのピペットで30回前後に軽く攪拌します。次いで、混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとに反転させてチューブを攪拌する。200マイクロリットルのピペットと10マイクロリットルのピペットで前後に穏やかに混合してから、混合物を摂氏37度で10分間インキュベートして組織を解離させます。

70マイクロメートルのセルストレーナーでセルをろ過し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSを10ミリリットル加えます。室温で10分間300回Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ミエリン枯渇のために、ペレットを400マイクロリットルのミエリン除去緩衝液で再懸濁し、次いで100マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加えてから、摂氏4度で15分間インキュベートする。

5ミリリットルのミエリン除去緩衝液を加え、室温で10分間Gを300倍に遠心分離した。500マイクロリットルのミエリン除去バッファーを加え、懸濁ペレットを磁場カラムに入れる。カラムを1ミリリットルのミエリン除去バッファーで4回洗浄する。

室温で2分間300倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ボルテックスが細胞を短時間解離させ、5マイクロリットルのFcブロックCD32を加えた。目的の一次抗体の混合物100マイクロリットルを加え、摂氏4度で20分間インキュベートする。

4°Cで5分間、350倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。柔らかい紙にチューブを逆さまに拭きます。チューブを短時間ボルテックスし、次いで100マイクロリットルの二次抗体ミックスを加え、摂氏4度で15分間インキュベートする。

1ミリリットルのミエリン除去バッファーを加え、遠心分離を繰り返す。上澄みを捨て、チューブを柔らかい紙に逆さまに拭き取ります。細胞を250マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、細胞選別に直接進む。

野生型ラットのin vivo SPECTスキャンでは、脳の対側領域よりもリポ多糖注射部位におけるCLINDEのより高い結合を示した。放射性リガンド処理組織、またはFACS−RTTの蛍光活性化細胞選別を受けたエキソビボサンプルでは、ミクログリアにおいてのみより多くのCLINDE結合部位の存在を明らかにし、脳の同側側におけるCLINDEシグナルの細胞起源がミクログリアであったことを示す。TgF344-ADラットにおける12ヶ月におけるトランスロケータータンパク質、またはTSPO結合の増加は、アストロサイトに限定された。

生後24ヶ月のラットでは、アストロサイトおよびミクログリアの変化の両方によりTSPO結合の増加が観察された。高齢のTgF344-ADラットでは、線条体アストロサイトは野生型と比較して5HT2AR密度の低下を示した。ヒトAD死後サンプルに対してFACS-RTTを行った場合、年齢一致対照と比較して、AD被験者のアストロサイトおよびミクログリアの両方でTSPOの皮質過剰発現が観察された。

放射能を扱うときは、放射線防護の指示に従い、適切な個人用防護具を着用してください。その後、手順の後、作業環境を除染してください。タンパク質定量および遺伝子発現解析は、単離された細胞集団に対してこの手順の後に容易に行うことができる。