Name: 蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学ぶFACS-RTT法によるアルツハイマー病の細胞レベルタンパク質発現解析。TgF344-ADラットモデルを用いて、18kDaトランスロケーター蛋白質とセロトニン5HT2A受容体の発現を高感度に定量し、神経変性疾患の細胞機構を解明する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究はスイス国立科学財団(助成金番号320030-184713)の支援を受けた。著者BBTとKCは、Velux Foundation(プロジェクト番号1123)の支援を受けています。著者STはスイス国立科学財団(早期ポスドクモビリティ奨学金、いいえ。P2GEP3_191446)、マックス・クロエッタ教授(臨床医学プラス奨学金)、ジャン・アンド・マドレーヌ・ヴァシュー財団。

すべての実験手順は、ジュネーブ州の人間および動物実験のための倫理委員会、研究倫理のための州委員会(CCER)、およびジュネーブ州の健康の一般的な方向性(スイス)とそれぞれ合意して実施されました。データは、動物研究: 報告インビボ 実験(ARRIVE)ガイドラインに従って報告されます。
1. SPECTカメラの準備とキャリブレーション
<ol><li>カメラの電源を入れ、オペレーティングソフトウェアをロードします( 材料表を参照)。 ホームXYZステージ ボタンをクリックして、ホーミングを実行します。</li>
	<li>1 回の 10 分間のスキャン取得で構成される実験を設定します。 ステップ モードを ファイン に設定し、 アクイジション モードを リストモード に設定します(発光スペクトル全体を記録するため)。</li>
	<li>ベッドをセットアップし、温暖化システム、呼吸センサー、および麻酔が機能し、安全であることを確認します(図1A-D)。次に、動物の頭部が配置される場所にファントム(すなわち、既知の濃度の125Iの2mLを2mLマイクロフュージチューブに入れる)を置く(領域の中心、図1E)。</li>
	<li>画面の下部にある3つの画像の助けを借りて、3次元のカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。ファントムと動物のスキャン音量が同じであることを確認します。</li>
	<li>ステップ1.2~1.4で設定したパラメータを使用して、後続のキャリブレーション用のファントムスキャンを開始します。</li>
</ol>2. SPECTイメージングのためのワークスペース設定
<ol><li>消毒剤のウイルスでワークスペースを清掃し、すべての表面に柔らかい紙を置きます。</li>
	<li>それぞれのタンクに十分なイソフルランと酸素があることを確認してください。</li>
	<li>ラット尾静脈をより鮮明に見るために、バタフライカテーテルのフィンを切り取って24Gカテーテルを準備する。</li>
	<li>針を抜いた後、ヘパリン溶液(25000 U/mL)でカテーテルを完全に充填してカテーテルをコーティングします。次に、カテーテル挿入後の血栓形成を避けるために、針をその中に戻します。</li>
</ol>3. [125I]クリンデ放射性トレーサー合成
注意: 放射能は、生細胞の原子に影響を与え、遺伝物質(DNA)を損傷するのに十分な電離エネルギーを持つ可能性があります。
<ol><li>放射能実験の許可を受けた適切な環境で作業すること。 メモ:指や身体の線量計など、放射能の取り扱いに適した個人用保護具(PPE)を着用してください。放射能源から安全な距離を保つようにしてください。</li>
	<li>100 μLの酢酸中のトリブチルリン前駆体100 μgをヨウ化ナトリウム(Na125I)( 材料表を参照)および5 μLの37%過酢酸をグローブボックスに入れたサーモサイクラーで20分間インキュベートする。</li>
	<li>50%アセトニトリル(ACN)を水中で希釈して500 μLの容量に希釈します。希釈した反応液500 μLを逆相カラムに注入します( 材料表を参照)。</li>
	<li>[125 I]CLINDEを線形勾配HPLCで単離し、5%~95%ACNを7mMH3PO4中で10分間実行します。単離物をH2Oで希釈して最終容量10mLを達成し、希釈反応物を濃度カラムに注入する(材料表を参照)。</li>
	<li>カラムから [125I]CLINDE を 300 μL の無水エタノールで溶出した後、RT で真空遠心分離機で 40 分間インキュベートしてエタノールを蒸発させます。</li>
	<li>[125I]CLINDEを含む残渣を300 μLの滅菌生理食塩水で希釈し、原液を作成する。</li>
	<li>その放射能を測定した後、原液を滅菌生理食塩水で希釈し、500 μL中の0.037 MBqの溶液を得た。</li>
	<li>HPLC(高速液体クロマトグラフィー)によりトレーサーを精製する。450nmでの標準校正を使用して溶出時間を決定し、単一の放射性ピークを単離する。7つの標準濃度の低温(非放射性)CLINDE(0.1 μg、0.5 μg、0.75 μg、1 μg、1.5 μg、2 μg、および5 μg)の50%ACN溶液400 μLを用いて標準検量線を実行します。無線TLC(薄層クロマトグラフィー)で単一のピークを測定することにより、放射化学的純度を確立する。放射化学物質の純度が60%を超えていることを確認してください。</li>
	<li>450nmにおける紫外線吸光度を測定する放射性リガンドの比活性と、冷たく参照化合物で作成した検量線を確認してください。比活性が 1000 GBq/μmol を超えていることを確認します。</li>
</ol>4. [125I]R91150 放射性トレーサー合成
メモ: CLINDE 合成のセクションで説明したのと同じセキュリティ規則に従っていることを確認してください。
<ol><li>3 μLの無水エタノール、3 μLの氷酢酸、15 μLのキャリアフリーNa125I( 材料表を参照)(10 mCi)の溶液に300 μgのR91150前駆体を0.05 M NaOHおよび30%H2O2の3 μLで混合する。グローブボックスで30分間インキュベートする。</li>
	<li>反応全体を逆相カラムに注入する( 材料表を参照)。</li>
	<li>[125I]R91150 をアイソクラティック HPLC ラン (ACN/水 50/50、10 mM 酢酸バッファー) で 3 mL/minの流速で分離します。</li>
	<li>[125 I]R91150をH2Oで希釈し、最終容量を10mLにします。</li>
	<li>希釈反応液10mLを濃度カラムに注入する( 材料表参照)。</li>
	<li>カラムから [125I]R91150 を 300 μL の無水エタノールで溶出します。</li>
	<li>エタノールをRTの真空遠心分離機で40分間インキュベートしてエタノールを蒸発させる。</li>
	<li>[125I]R91150を含む残渣を300 μLの生理食塩水で希釈する。</li>
	<li>HPLCによりトレーサーを精製する。450nmでの標準校正を使用して溶出時間を決定し、単一の放射性ピークを単離する。無線TLCの単一ピークを測定することにより、放射化学的純度を確立する。放射化学物質の純度が98%を超えていることを確認してください。</li>
</ol>5. 動物の準備
<ol><li>TgF344-ADラット(雄または雌、生後2〜24ヶ月)を3%イソフルランを含む誘導チャンバー内で計量し、麻酔する。深く麻酔をかけたら、チャンバー内のイソフルラン流量を2%(0.4 L/分、100% O2)に下げます。</li>
	<li>麻酔ノーズコーンを備えた予め温められたベッドに動物を置きます。イソフルランを2%(0.4L/分、100%O2)に維持する。</li>
	<li>動物の目にアイゲル潤滑剤を塗布し、呼吸モニタリングを介して麻酔の深さを確認する。必要に応じて麻酔を調整する。</li>
	<li>尾静脈に24Gカテーテル挿入を行う。</li>
</ol>6. スペクト取得
<ol><li>動物を、38°Cに設定した温度制御された加熱パッドを備えたカメラベッドに移します(図1E)。</li>
	<li>動物の頭をバイトバーに固定し、頭の支柱を固定します。</li>
	<li>1 分間の 60 フレームで構成される 60 分間のスキャンで実験を設定します。手順 1 で設定した他のすべてのパラメーターを再利用します。[ 画像の更新 ]ボタンをクリックして、動物の位置を更新します。</li>
	<li>3次元の画面の下部にある3つの画像の助けを借りてカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。</li>
	<li>500 μLの放射性放射性放射性トレーサー([125 I]CLINDEまたは[125I]R91150)を注入し、チューブに300 μLの滅菌0.9%NaClを流す。同時にクリック 取得の開始 スキャンを開始します。</li>
	<li>スキャン時間中は、呼吸数モニタリングで動物を一定の麻酔下で維持してください。必要に応じてイソフルランの流れを調整します。</li>
	<li>スキャンが終わったら、麻酔をかけられた動物を素早く断頭して安楽死させます。</li>
</ol>7. スキャンの再構築
<ol><li>スキャン再構築ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、データセットを開き、スキャンのフォルダに作成された[filename].parametersファイルを探します。</li>
	<li>目的の同位体を選択します。 Listmode パラメーターを使用すると、このステップで複数の同位体を選択できます。</li>
	<li>次のパラメータを選択します:0.4 mmボクセルサイズ、4(POS-EM)サブセット、6回の反復(24ME-EM相当)、ポストフィルタなし、および対応する同位体減衰補正。NIfTI への出力形式を選択し、[ SPECT 再構築の開始 ] を選択します。</li>
</ol>8. ラット脳抽出
<ol><li>スキャン手順と同じ麻酔イベントで、呼吸数を監視して動物の深い麻酔状態を確認した後、ギロチンによる断頭に進み、頭を解剖ベンチに素早く移します。</li>
	<li>はさみで、頭の上の皮膚を背中から前へ目の真ん中まで慎重に切ります。</li>
	<li>頭蓋骨の基部と頸椎の周りの余分な筋肉を切り取ります。</li>
	<li>次に、頭蓋骨の後ろの穴、孔マグナムにハサミの刃を1枚慎重に入れ、手術用ペンチで頭蓋骨の後ろの部分を外します。</li>
	<li>その後、外科用ペンチで、頭蓋骨の上部を慎重に取り外します。古い雄ラットの頭蓋骨は厚く、脳への損傷を避けるために小さな断片として取り除くことができます。</li>
	<li>髄膜をハサミで慎重に切ります。髄膜は、抽出プロセス中に脳を損傷することができます;予防措置として削除してください。</li>
	<li>頭蓋骨の上部を取り除いた後、動物の頭を回し、小さな平らなヘラで、視神経と三叉神経を切って慎重に脳を引き抜きます。</li>
	<li>氷上で解剖するために、平らで清潔なガラス表面に脳を慎重に移します。</li>
	<li>平らな金属のヘラとカミソリの刃を使用して、脳の関心領域を解剖します。組織を2mL遠沈管に入れ、得られた組織を秤量する。細胞単離のために脳セクションを直接使用するか、後で使用するために液体窒素中で迅速に凍結する。</li>
</ol>9. 細胞分離
<ol><li>清潔で無菌の環境で作業してください。クラスIIバイオセーフティキャビネット(BSC)の下で作業することをお勧めします。BSCに導入される手袋とすべての機器が無菌であることを確認してください。</li>
	<li>細胞を細胞選別用に調製するには、Jaclyn M. Schwarz14 のプロトコルに従います。 注:この実験では、市販の神経解離キット( 材料表を参照)を細胞調製に使用した。<ol>
<li>サンプルを1 mLのHBSS(Ca-およびMg-フリー)を含む2 mL遠沈管に入れ、次いで遠心分離機(300 x g、2分、室温= RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。</li>
		<li>1900 μLの酵素ミックス-1を加え、5分ごとに反転させてチューブを攪拌しながら、37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>30 μLの酵素ミックス-2を加え、ピペット1( 材料表を参照)で穏やかに30回前後に攪拌する。その後、5分毎に反転させてチューブを攪拌しながら37°Cで15分間インキュベートする。</li>
		<li>ピペット2と前後に穏やかに混合し、次いでピペット3を37°Cで10分間インキュベートする前に、組織を解離させた。</li>
		<li>80 μm のセルストレーナーで細胞をろ過し、10 mL の HBSS (Ca-および Mg-フリー) を加えます。遠心分離機(300 x g、10分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。</li>
		<li>ミエリン枯渇のために、ペレットを400μLのミエリン除去緩衝液(材料表を参照)で再懸濁し、次いで100μLのミエリン除去ビーズ(材料表を参照)を加えてから、4°Cで15分間インキュベートする。</li>
		<li>5mLのミエリン除去緩衝液を加え、遠心分離機(300 x g、10分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。</li>
		<li>500 μLのミエリン除去バッファーを加え、チューブを磁場カラムに入れます。カラムを1 mLのミエリン除去バッファーで4回洗浄する。</li>
		<li>遠心分離機(300 x g、2分、RT)し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ボルテックスで短時間(2秒)細胞を解離させ、5μLのFcブロックCD32を加えた。ボルテックスを再度、4°Cで5分間インキュベートした。</li>
		<li>目的の一次抗体の混合物を100μL加える;4°Cで20分間インキュベートする。</li>
		<li>遠心分離機(350 x g、5分間、4°C)でペレットを乱すことなく上清を除去した。チューブを柔らかい紙に逆さまに拭きます。</li>
		<li>短い渦(2秒)の後、100μLの二次抗体ミックスを加え、4°Cで15分間インキュベートする。</li>
		<li>2mLのミエリン除去緩衝液を加え、遠心分離機(350 x g、5分、4°C)で、ペレットを乱すことなく上清を除去した。チューブを柔らかい紙に逆さまに拭きます。細胞を250 μLの滅菌PBSに再懸濁し、細胞選別に直接進む。</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. セルの仕分け
<ol><li>マイクロフュージチューブに500 μLの滅菌PBSを用意し、選別した細胞を回収します。</li>
	<li>細胞溶液1000 μLあたり10 μLのヘキストを加えて、生細胞の核を着色し、それらを死細胞と区別する。</li>
	<li>できるだけ早く細胞を4°Cの細胞選別機に移す。</li>
	<li>まず、前方散乱と側方散乱で細胞をソートし、次にヘキスト陽性細胞をソートします。次に、目的の抗体に基づいて細胞を選別する。陽性に染色された細胞を別々に集める。陽性細胞と自己蛍光細胞を区別するようにしてください。</li>
	<li>対象のプールごとにソートされたセルの数をカウントします。</li>
</ol>11. ガンマカウント
<ol><li>SPECT校正に使用したのと同じファントム溶液10 μLでγ計数システムを校正しますが、1 mLの水で希釈します。 注:ファントム溶液は、γ計数システムの精度が向上しているため、希釈されています。</li>
	<li>選別された細胞のチューブをγ計数システムに置き、製造元のプロトコルに従ってγ計数を続行します。</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+burden+of+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li>
<li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer%27s+disease%3A+Translating+basic+science+into+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer%27s+disease%3A+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li>
<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques%2C+tau+pathology%2C+behavioral+impairment%2C+oligomeric+a%CE%B2%2C+and+frank+neuronal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li>
<li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+Alzheimer%27s+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-%CE%B2+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li>
<li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer%27s+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153(2018).</li>
<li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer%27s+disease%3A+A+preliminary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712(2020).</li>
<li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B11C%5Draclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346(2020).</li>
<li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dopamine+D%282%2F3%29+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li>
<li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2%2F3+receptors+with+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li>
</ol>

著者らは利益相反がないと宣言しています。

我々の知る限り、この技術は、細胞レベルでの放射性トレーサーのin vivo結合変化のよりよい理解を可能にするアプローチを最初に記述した。このプロトコルは、[125 I]クリンド(TSPO)または[125 I]R91150(5HT 2AR)を例として使用して細胞レベルで放射性トレーサー結合を定量化するマルチスケール法を記載している。
この技術は、LPSによって誘導される強烈な炎症反応からADのラットモデルで観察されるより微妙なグリア細胞変化まで、広範囲のグリア細胞変化の細胞起源を正確に検出するのに十分堅牢で感度が高く、SPECTで得られたシグナルのミクログリア起源として、 in vivo 核神経イメージングに重要な相補的情報をもたらす。この研究はさらに、FACS-RTTが5HT2ARの例を用いて細胞スケールで神経受容体密度の変化を識別することさえできることを示した(図3C)。最後に、ヒトの死後組織におい...

アルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患は、症状の増加に伴う神経細胞喪失によって特徴付けられる。認知症の最も一般的な原因であるADは、症例の60%〜70%を占め、世界中で約5,000万人が罹患しています1。神経病理学的レベルでは、ADの2つの主要な特徴は、細胞外アミロイドβ(Aβ)プラークおよび細胞内タウ神経原線維のもつれの蓄積である。グリア細胞の変化はまた、AD2 およびいくつかの神経伝達物質系の可能な破壊と関連している3、4。
TgF344-ADラット株は、ヒトAPPおよびPS1ΔE9導入遺伝子を発現することによってADをモデル化するように改変され、可溶性および不溶性のAβ−40およびAβ−42発現およびアミロイドプラーク形成5をもたらす。それはまた、タウオパチーにつながるタウタンパク質の過剰リン酸化形態の蓄積を提示する。9〜24ヶ月齢から、ラットはADの病理学的特徴および認知障害5,6,7,8,9を徐々に発症する。
陽電子放射断層撮影(PET)、単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)、およびオートラジオグラフィーは、γ光線の放出および定量化に基づく技術である。放射性トレーサーは、インビボ(PETおよびSPECT)またはエキソビボ/インビトロ(オートラジオグラフィー)のいずれかで定量化される。これらの敏感な技術は、ADなどのいくつかの脳疾患のメカニズムの理解に貢献してきました。実際、神経炎症に関しては、in vivo神経炎症マーカーである18kDaトランスロケータータンパク質(TSPO)を、[11C]-(R)-PK11195または[11C]PBR28などの放射性標識トレーサーで評価する多くの研究がある(レビューについては10を参照)。加えて、神経伝達物質系の変化は、放射性トレーサー11、12、13を用いて研究されている。
しかしながら、これらの技術は、放射性シグナルの細胞起源を決定しない。これは、PET/SPECTにおける放射性リガンドの結合における変化の生物学的基盤の解釈を妨げる可能性がある。例えば、神経炎症のTSPO研究の場合、TSPOの増加または減少がアストロサイトまたはミクログリアの変化によるものかどうかを理解することが最も重要である。放射性リガンド処理組織への蛍光活性化細胞選別(FACS-RTT)技術は、これらの問題を回避するために開発され、すべての細胞タイプにおける放射性リガンド結合を個別に評価し、細胞あたりの標的タンパク質密度を定量化することができます。この革新的な技術は、PETおよびSPECTイメージングと補完的で高い互換性があります。
ここで、この技術は、TSPO特異的放射性リガンドを用いた神経炎症の研究とセロトニン作動系の評価の2つの軸に沿って適用された。第1の軸では、目的は、急性炎症反応に応答するTSPOシグナルの細胞起源を理解することであった。したがって、FACS-RTTは、リポ多糖(LPS)注射を介して神経炎症を誘導した後、およびin vivo [125I]CLINDE SPECTイメージング研究に続いてラットの脳組織に使用された。さらに、12ヶ月齢および24ヶ月齢のTgF344-ADラットおよび一致する野生型(WT)ラットに、同じイメージングおよびFACS−RTTプロトコルを適用した。第2の軸は、細胞型によるエクスビボ5−HT2AR密度評価を介してこのラットモデルにおけるセロトニン作動性系変化の起源を決定することを目的とした。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVet</td><td>BioVet</td><td></td><td>バイタルチェック用ソフトウェア</td></tr><tr><td>Bondclone C18 逆相カラム</td><td>Phenomenex, Schlieren, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Des-Sur</td><td>University Hospital of Geneva</td><td></td><td>Virucide</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>反応性 ラット</td></tr><tr><td>に対する反応性 FITC-標識抗ラット CD90</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>反応</td></tr>性 <tr><td>ラットに対する反応性 ヘパリン</td><td>B. Braun</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Knauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>321312</td><td>24 G カテーテル</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>ZDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc</td><td>Alcon</td><td>2160699</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microporeソフトテープ</td><td>3M</td><td>F51DA01</td><td></td></tr><tr><td>MILabs-Uspect II</td><td>SPECTカメラ用</td><td>MILabs</td><td></td>ソフトウェア</tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>細胞選別機</td></tr><tr><td>ミエリン除去ビーズ II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td>ビーズとミエリン除去バッファーが含まれています。</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 滅菌溶液</td><td>B. ブラウン</td><td>395202</td><td></td></tr><tr><td>神経解離キット (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>酵素ミックス、ピペット 1、2、3 が含まれています。</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュシート</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40インチ幅、80ミクロンサイズのメッシュ</td></tr><tr><td>過酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>R91150 pr&eacute;カーソル</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 カラム</td><td>Waters</td><td></td><td>Concentration カラム</td></tr><tr><td>ヨウ化ナトリウム Na125</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリブチリン前駆体</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-SPECT Rec2.38c</td><td>MILabs</td><td>バージョン Rec2.38c</td><td>SPECT画像再構成用ソフトウェア</td></tr><tr><td>USPECT II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Spect Camera</td></tr><tr><td>Wizard 3"</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>ガンマカウンター</td></tr></tbody></table>

蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(facs-rtt)による放射性シグナルの細胞起源の決定

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

グリア細胞は、おそらくアルツハイマー病(AD)などの神経変性疾患の病態生理学においてかなりの意味を持つ。それらの変化は、おそらく炎症誘発状態と関連している。TgF344-ADラット株は、アミロイドタンパク質Aβ-40およびAβ-42をコードするヒトAPPおよびヒトPS1ΔE9 遺伝子を発現するように設計されており、加齢に伴うアミロイド病態および認知障害を示す。本研究では、TgF344-ADラットモデルを用いて、18kDaのトランスロケータータンパク質(TSPO、グリア細胞活性化のマーカー)結合の細胞起源、およびADにおいて破壊される可能性のある5HT2A受容体(5HT2AR)セロトニン受容体レベルを評価する。ここで紹介する技術は、Radioligand Treated Tissue(FACS-RTT)への蛍光活性化細胞選別であり、 in vivo PETまたはSPECTまたは ex vivo/in vitro オートラジオグラフィー技術を補完する定量的細胞型特異的技術である。画像化の前に使用したのと同じ放射性標識トレーサーを定量し、細胞選別後にサイトメトリーカウンター γを使用する。これにより、高い細胞特異性および感度を有する放射性標識タンパク質の細胞起源を決定することができる。例えば、FACS-RTTを用いた研究では、(i)リポ多糖(LPS)誘発神経炎症のラットモデルにおけるTSPO結合の増加がミクログリアと関連していたこと、(ii)12ヶ月および18ヶ月でのTSPO結合の増加が最初にアストロサイトと関連し、次にTgF344-ADラットにおけるミクログリアが野生型(WT)ラットと比較して、および(iii)5HT2Aの線条体密度に関連していたことが示されました。Rは、同じラットADモデルにおいて18ヶ月でアストロサイトにおいて減少する。興味深いことに、この技術は事実上すべての放射性トレーサーに拡張することができます。

WTラットは、片側的LPS注射後に[125I]CLINDE放射性トレーサーによるインビボSPECTスキャンを経験した(図2)。このスキャン(放射性トレーサー注射後45〜60分の画像からの集計データを使用)は、LPS注射部位(図2A)における[125I]CLINDEの結合が脳の対側領域(図2B)よりも高いことを示した。FACS-RTTを受けたエキソビボサンプルは、これらの結果を確認し、ミクログリアにおいてのみより多くの[125I]CLINDE結合部位の存在を明らかにし、脳の同側側における[125I]CLINDEシグナルの細胞起源がミクログリアであることを示した(図3A)15。
次...

蛍光活性化細胞選別 - 放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)は、アルツハイマー病における18 kDaトランスロケータータンパク質またはセロトニン5HT2A受容体発現の役割を細胞規模で研究するための強力なツールです。このプロトコールは、TgF344−ADラットモデルにおけるFACS−RTTの エクスビボ 適用を記載する。

蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

このプロトコルは、インビボイメージングを補完するものです。これは、放射性トレーサーの細胞型および細胞レベルの定量を可能にし、これはインビボで得られるものとは異なるスケールである。この技術の主な利点は、その感度と、放射性リガンドの使用と細胞選別によって与えられる細胞分解能です。カメラの電源を入れ、オペレーティングソフトウェアをロードします。ホームXYZステージボタンをクリックして、ホーミングを実行します。1 つの 10 分間のスキャン取得で構成される実験を設定します。ステップモードを微調整に設定し、集録モードをリストモードに設定して、発光スペクトル全体を記録します。ベッドをセットアップし、温暖化システム、呼吸センサー、麻酔が機能的で安全であることを確認します。次に、動物の頭が置かれる場所にファントムを置きます。画面の下部にある3つの画像の助けを借りて、3次元のカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。ファントムと動物のスキャン音量が同じであることを確認します。ファントムスキャンを開始し、以前に設定したパラメータを使用して後続のキャリブレーションを行います。放射能実験の許可を受けた適切な環境で作業すること。100マイクロリットルの酢酸中のトリブチルイン前駆体100マイクログラムをヨウ化ナトリウムおよび5マイクロリットルの37%パー酢酸と共に、グローブボックス内に置かれたサーモサイクラーで20分間インキュベートする。50%アセトニトリルを用いて反応物を水で希釈し、500マイクロリットルの容量に達する。500マイクロリットルの希釈反応物を逆相カラムに注入する。7ミリモルのリン酸中で5~95%ACNを10分間実行した直線勾配HPLCでCLINDEを単離します。単離物を水で希釈して最終容量10ミリリットルを達成し、希釈反応物を濃縮カラムに注入する。カラムからCLINDEを300マイクロリットルの無水エタノールで溶出し、真空遠心分離機中で室温で40分間インキュベートすることによってエタノールを蒸発させる。CLINDEを含む残渣を300マイクロリットルの生理食塩水で希釈し、原液を作成する。その放射能を測定した後、原液を生理食塩水で希釈し、500マイクロリットル中の0.037メガベクレルの溶液を得た。コールドリファレンス化合物で検量線を作成し、線形回帰式:YをAX+Bに等しく解してAとBの係数を求めます。Xは冷たい化合物の質量を表し、Yは曲線の下の面積を表す。放射性配位子の曲線下面積を確認し、検量線と放射性配位子の曲線下面積に基づいて450ナノメートルの紫外線吸光度を測定する。質量を推定し、放射性リガンドの活性を測定する。比活性がマイクロモルあたり1,000ギガベクレルより大きいことを確認してください。[画像の更新]ボタンをクリックして、動物の位置を更新します。3次元の画面の下部にある3つの画像の助けを借りてカーソルをスライドさせてスキャン領域を設定します。1 分間の 60 フレームで構成される 60 分間のスキャンで実験を設定します。最初に設定した他のすべてのパラメーターを再利用します。500マイクロリットルの放射性放射性トレーサーを注入し、次いで300マイクロリットルの滅菌0.9%塩化ナトリウムでチューブを洗い流す。同時に、[取得の開始]をクリックしてスキャンを開始します。スキャン再構築ソフトウェアを開き、データセットを開き、スキャンのフォルダーに作成されたファイル名パラメーター ファイルを探します。目的の同位体を選択します。リストモードパラメータは、このステップで複数の同位体選択を可能にすることに注意してください。原稿で説明されているように、ボクセルサイズ、サブセットの数、反復などのさまざまな再構成パラメータを設定します。出力形式を NIFTI として選択し、「SPECT 再構成の開始」を選択します。平らな金属のヘラとカミソリの刃を使用して、脳の関心領域を解剖します。組織を2ミリリットルの遠沈管に入れ、得られた組織を秤量する。サンプルをカルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSS1ミリリットルの2ミリリットルの遠沈管に入れ、室温で2分間300倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。1,900マイクロリットルの酵素を加え、5分ごとに反転させてチューブを攪拌しながら、摂氏37度で15分間インキュベートする。30マイクロリットルの酵素ミックスを2つ加える。1,000マイクロリットルのピペットで30回前後に軽く攪拌します。次いで、混合物を摂氏37度で15分間インキュベートし、5分ごとに反転させてチューブを攪拌する。200マイクロリットルのピペットと10マイクロリットルのピペットで前後に穏やかに混合してから、混合物を摂氏37度で10分間インキュベートして組織を解離させます。70マイクロメートルのセルストレーナーでセルをろ過し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないHBSSを10ミリリットル加えます。室温で10分間300回Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ミエリン枯渇のために、ペレットを400マイクロリットルのミエリン除去緩衝液で再懸濁し、次いで100マイクロリットルのミエリン除去ビーズを加えてから、摂氏4度で15分間インキュベートする。5ミリリットルのミエリン除去緩衝液を加え、室温で10分間Gを300倍に遠心分離した。500マイクロリットルのミエリン除去バッファーを加え、懸濁ペレットを磁場カラムに入れる。カラムを1ミリリットルのミエリン除去バッファーで4回洗浄する。室温で2分間300倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。ボルテックスが細胞を短時間解離させ、5マイクロリットルのFcブロックCD32を加えた。目的の一次抗体の混合物100マイクロリットルを加え、摂氏4度で20分間インキュベートする。4°Cで5分間、350倍Gで遠心分離し、ペレットを乱すことなく上清を除去した。柔らかい紙にチューブを逆さまに拭きます。チューブを短時間ボルテックスし、次いで100マイクロリットルの二次抗体ミックスを加え、摂氏4度で15分間インキュベートする。1ミリリットルのミエリン除去バッファーを加え、遠心分離を繰り返す。上澄みを捨て、チューブを柔らかい紙に逆さまに拭き取ります。細胞を250マイクロリットルの滅菌PBSに再懸濁し、細胞選別に直接進む。野生型ラットのin vivo SPECTスキャンでは、脳の対側領域よりもリポ多糖注射部位におけるCLINDEのより高い結合を示した。放射性リガンド処理組織、またはFACS−RTTの蛍光活性化細胞選別を受けたエキソビボサンプルでは、ミクログリアにおいてのみより多くのCLINDE結合部位の存在を明らかにし、脳の同側側におけるCLINDEシグナルの細胞起源がミクログリアであったことを示す。TgF344-ADラットにおける12ヶ月におけるトランスロケータータンパク質、またはTSPO結合の増加は、アストロサイトに限定された。生後24ヶ月のラットでは、アストロサイトおよびミクログリアの変化の両方によりTSPO結合の増加が観察された。高齢のTgF344-ADラットでは、線条体アストロサイトは野生型と比較して5HT2AR密度の低下を示した。ヒトAD死後サンプルに対してFACS-RTTを行った場合、年齢一致対照と比較して、AD被験者のアストロサイトおよびミクログリアの両方でTSPOの皮質過剰発現が観察された。放射能を扱うときは、放射線防護の指示に従い、適切な個人用防護具を着用してください。その後、手順の後、作業環境を除染してください。タンパク質定量および遺伝子発現解析は、単離された細胞集団に対してこの手順の後に容易に行うことができる。

fluorescence-activated-cell-sorting-radioligand-treated-tissue-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

生きた細胞の原形質膜における蛍光タンパク質の脂質ラフトのパーティショニングを調べるための手法が説明されています。これは、脂質ラフトの内側または外側に位置するタンパク質の拡散時間に格差を利用しています。買収は、コントロール条件でまたは薬物を添加した後、動的に実行することができます。...

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

癌関連線維芽細胞（CAFS）は増殖、血管新生、炎症を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を容易にします。ここでは、表面マーカーとしてPDGFRαを使用して、細胞選別により新鮮なマウスおよびヒト組織由来正常線維芽細胞とCAFSの純粋な集団を単離するための方法を説明します。...

蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

出典: Kim, H. 他、 『高スループット遺伝子酵素スクリーニングシステムを使った多酵素スクリーニング』。 J. Vis. Exp.

遺伝子組み換え細菌細胞における標的酵素発現の検出

このビデオは、生物学的サンプルから単離されたタンパク質凝集体の播種活性を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)フローサイトメトリーアッセイを示しています。タウレポータータンパク質を発現する哺乳類細胞を、タウシードを含むリポソーム形質導入複合体とインキュベートします。これらのシードはレポータータンパク質の凝集を媒介し、フローサイトメーターでFRET陽性シグナルを生成します。...

タウシード誘導レポータータンパク質凝集を検出するためのFRETフローサイトメトリー技術

このプロトコルの目標は、蛍光活性化細胞選別(FACS)技術を使用して、細胞型特異的な遺伝子発現、エピジェネティックマーカー、およびまたはタンパク質発現のその後の解析のために、特定のタイプの神経細胞を選別することです。...

蛍光活性化セルソーティングを用いたラット脳組織における細胞型特異的遺伝子発現の検討

ここでは、生鮮・冷凍の両方の脳組織から神経アンサンブルをフォスが発現に分子変化を研究するための蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）プロトコルを提示します。凍結組織の使用は、貴重な動物被験体の使用を最大化するために、複数のセッションに比べて多くの脳領域のFACS単離を可能にします。...

蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）と生鮮・冷凍ラット脳組織からのFos発現ニューロンの遺伝子発現解析

私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。...

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

原稿で人身売買に関与する植物毒素リシン (RTA)...

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

がん転移臨床生体内で追跡のためのプロトコルについて述べる。それは、非侵襲的 [18F] テトラフルオロホウ酸-ペット、および合理化された前のヴィヴォ確認のため蛍光蛋白質によって検出されたナトリウム...

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

学ぶFACS-RTT法によるアルツハイマー病の細胞レベルタンパク質発現解析。TgF344-ADラットモデルを用いて、18kDaトランスロケーター蛋白質とセロトニン5HT2A受容体の発現を高感度に定量し、神経変性疾患の細胞機構を解明する。

蛍光活性化細胞選別-放射性リガンド処理組織(FACS-RTT)による放射性シグナルの細胞起源の決定

さらに動画を探す