Name: 膣洗浄を利用したげっ歯類の強烈なサイクルモニタリング:通常のサイクルのようなものはありません (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ 膣洗浄法によるラットの発情周期モニタリング技術。細胞形態の観察と段階的な変化の記録により、生殖生物学研究や心血管・薬理学分野への応用が可能となる包括的かつ低コストな手法を解説する。

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この研究は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校脳損傷研究センター(BIRC)のNIH資金提供による共同研究を通じて実施されました。

著者らは、開示すべき利益相反はありません。

重要な手順と重要な考慮事項 提供されたプロトコルにおける特定の重要なステップは、特に膣細胞の集合内で、強調を必要とする。膣液抽出中、シリンジ挿入の適切な角度と深さを確保することは、満足のいく結果を生み出し、最終的に動物への刺激、傷害、または子宮頸部刺激を防止するための鍵です。子宮頸部の刺激は、白血球のみの膣塗抹標本11の12〜14日目によって示される偽妊娠誘発の1つの源であり得る。顕微鏡評価段階では、収集された膣細胞を表示する視覚面に焦点を当てることが重要です。これは、1 つまたは 2 つのセルを識別し、フォーカスが達成されるまで視覚化を調整することによって完了します。
これに続いて、ステージングのための膣細胞の代表的な画像のキャプチャは、顕微鏡スライドの全体をスキャンすることによって起こる。これにより、キャプチャされた画像は、動物の膣管に収集され、存在するものの正確な描写を反映することが保証されます。分類の前に、細胞型や各細胞型が持つことができるさまざまな形質転換を区別するなど、分類決定要因に...

斬新な貢献 げっ歯類の発情周期は、健康の重要な指標として同定されています。しかし、研究者の無意識の偏見や女性の体に関する不正確な解釈は、科学界を妨げています。「発情」という言葉の語源そのものが、劣等感と否定性を意味します。エウリピデスはこの用語を「狂乱」または狂気、ホメロスはパニック、プラトンは不合理な衝動を表すために使用しました。この研究は、これらの原始的な視点が現在の科学界にどのように影響するかを強調し、新しいモザイクパラダイム(以前に研究された方法の更新された組み合わせ、より包括的なアプローチの範囲を拡大した)を通じてこれらの懸念に対処します。
標準化された包括的なモニタリング手法はなく、データ解釈の実践が不明瞭な可能性があるため、この手法の研究と使用はまず必要です。第二に、発情周期特性は研究されている個々のラットに依存するが、それらはしばしば普遍化される。第三に、ホルモンサイクルは日常的で有益なプロセスですが、「人間への翻訳」セクションで探求されている危険なスティグマに囲まれています。本研究は、(A)発情周期モニタリング手法を詳細に記述し、その結果がどのように解釈できるかを明らかにすること、(B)各周期の完全性と個性を維持する方法を概説すること、(C)根拠のない慣行を永続させる誤解に注意を喚起すること、の3つの方法でこれら3つの問題に取り組むことを目的とする。
この研究はまた、成人期のさまざまな行動的、解剖学的、生理学的症状に光を当てる重要な発達変化によって特徴付けられる思春期のラットに焦点を当てているという点でもユニークです1。共通のバイアスを解体しながら、研究不足の集団におけるホルモン周期を監視する標準化された実験計画を構築することは、信頼性が高く有効なホルモン相関2,3,4の発達と、状態依存性周期の中断の決定を可能にする5,6,7,8,9,10 .最終的に、これらの新規性は、さまざまなウェルネスの懸念の診断基準、治療、および介入を拡大するのに役立ちます。
基本的な定義と用途 発情周期は、エストラジオール、白水素化ホルモン(LH)、およびプロゲステロンの3つの振動する女性性ステロイドホルモンに応答して起こる動的生理学的プロセスの集まりである(図1A、B)。内分泌系と中枢神経系との間の相互作用は、サイクルを調節し、これは最も頻繁に4〜5日間持続し、性的成熟の開始から生殖老化および/または停止まで再発する。それはホルモンレベルに基づいて別々のカテゴリーに分けられます - 最も一般的には、円形に進行するダイストラス(DIE)、発情前勃起(PRO)、発情(EST)、およびメテストルス(MET)の4段階に分かれています。分割の数は、研究13の性質に応じて、3段階11から13段階12までの範囲であり得る。部門数が少ないほど、METをステージとして除外し、短期間の移行期間として分類することがよくあります。より多い数は、典型的には、腫瘍発生または自発的偽妊娠などの現象のより詳細な検査を可能にするサブセクションを含み、胚性着床を伴わない妊娠の生理学的状態12、14、15。
この研究では、膣管の構成要素を通して段階が同定され、存在する細胞型、細胞配置、および細胞量の3つの分類決定因子が命名された(図2A-D)。この研究では膣液の状態はモニターされなかったが、第4の分類成分としてそれを含めることが推奨される。膣液の検査に関するさらなる情報は、参照リスト16に見出すことができる。分類成分は、現代の発情サイクルモニタリングで推奨される主要な技術である膣洗浄を介して細胞を抽出することによって調べることができます。各段階内の詳細な生理学的プロセスはこの研究の範囲外であるが、より多くの情報は文献17で見つけることができる。
この発情周期モニタリング技術の使用および継続的な開発は、性ステロイドホルモンと心血管系18、内分泌系8、および中枢神経系19、20、21などの身体系の機能との間の接続に根ざしている。同時に、雌のげっ歯類が関与している場合、発情サイクルモニタリングは必ずしも必要ではないかもしれません22,23,24,25。むしろ、性差が特定の研究分野で報告されているかどうかを最初に検討することが重要ですが、これは公開されたレビュー22,23でさらに調査することができます。発情サイクルモニタリングは、幅広い研究調査において不可欠ですが、雌のげっ歯類を実験に含めることの障害と見なされるべきではありません。この手法は複雑で時間がかかるように見えるかもしれませんが、治験責任医師によっては、手順自体の完了に15分もかからず、費用対効果が高い場合があります。全体として、科学的研究に女性のげっ歯類を含めることは、これらの開発が主に男性の身体テンプレートに基づいているため、身体系、様々な状態および病理、および一般的な健康の理解に有利である。
げっ歯類の普遍的なパラメータと自然変動 標準サイクルパターンの定義、比較・分析のためのパラメータ設定、異常や外れ値の検出には、「典型的」と見られる側面の範囲を設定する必要があります。同時に、各ラットのサイクルは一意であり、動物の系統、生理学的プロセス、および環境条件に基づく逸脱が予想されることを認識することも重要です。実際、発情周期の最も「正常な」側面の1つは変動性です。これは、3-38日26,27の範囲で、全サイクル長で見られます。32-34日から数週間28,29,30までの範囲の性的成熟の年齢;非循環的と考えられるもの11、及び分類行列式パターン11、13とする。全体として、発情サイクルの普遍的なテンプレートはなく、それを科学界と一般市民の両方に翻訳することは、実験プロセスの重要な部分です。
実験の時期と発達年齢 この変動性の原理を認識することは、信頼性が高く有効な実験計画の構築に役立ちます。例えば、発情性サイクリングモニタリングの開始は、ラットの解剖学的および生理学的発達に依存しており、これは環境的および生理学的要因に基づいて変化する。モニタリングは、膣管の内部部分につながる外陰部に囲まれた外部膣オリフィスである膣開口部(VO)の発達まで開始できない(図3A-D)。VOはしばしば32歳から34日の間に完全に発達するが、それは各被験者に個別化されたままであり、その過程について多くは不明のままである。この開口部は、エストラジオール31の増加、視床下部-下垂体-卵巣軸32の成熟、およびラットにおける最初の排卵17、33、34、35に関連している性的成熟の開始を特定するために使用されてきた。しかしながら、最近の刊行物は、それが不利な環境におけるホルモンおよび発達的発生から切り離される可能性があり31、性的成熟33ではなくエストラジオールレベルの変化を表す可能性があるため、生殖発達の間接的なマーカーにすぎないことを見出した33。したがって、VOのみに頼って発育年齢を決定し、発情周期モニタリング36の修飾子としてではなく、第1EST段階の出現および上皮細胞30の角化を利用して性的成熟の開始をマークすることが推奨される。
体重は、げっ歯類30,37の青年期の発達年齢と著しく相関しており、したがって、この期間の発達年齢の決定にも役立つ可能性がある。この現象に関連する提案されたメカニズムには、成長ホルモンなどの生殖発達に必要なホルモンの刺激、および食欲調節因子であるレプチンによる視床下部 - 下垂体副腎(HPA)軸の阻害が含まれる30。しかし、種間およびベンダー提供者間でラット間に見られる大きな差異のために、この尺度を発達年齢の唯一の指標として使用することは推奨されない38。VOおよび体重の発達に見られる変動性は、全体的な実験プロセスにおける概念の重要性を例示する。
人間への翻訳:文化的および科学的背景 動物とヒトの生殖研究の翻訳関係は双方向である。動物ベースの研究の結果は、ヒトのプロセスがどのように評価され、アプローチされ、分析されるかに影響を与える39。人間の生殖器系とそれに関連するプロセスの認識は、動物がどのように研究されるかに影響を与えます。実際、この分野におけるさらなる研究のための最も大きな兆候の1つは、科学的プロセスに影響を与えるホルモンサイクルに関連する偏った社会文化的信念に由来しています。これらの慣習の多くは、月経を議論することに対する一般的な文化的嫌悪感から派生しており、それは十分に実証された知識のデータギャップをもたらしました40,41。これには、棚の高さやスマートフォンのサイズから、警察のボディアーマーのフィッティングや見逃したがん診断42まで、軽微なものから致命的なものまで、さまざまな結果があります。
月経が非衛生的で破壊的で有毒であるという記述は、尊敬されるテキスト、メディア、辞書、医学の教えに見られるが、科学出版物によって保存されている。これは、ホルモン周期の不正確で偏った記述、生殖器系を神経内分泌の対応物および環境の影響から隔離すること、および「妊娠の失敗」としての周期の完了の還元主義的視点によって起こる43,44。これは、ホルモンサイクルに影響を与える外部変数の省略、解剖学的発達のみに基づいて開始とエンドポイントの決定、循環的ではなく線形のサイクル進行の測定など、不健全な実験的実践の作成につながります。社会文化的要因と生物学的結果との間には直接的な相関関係があるにもかかわらず、科学文献ではあまり考慮されていません。より包括的な出版物43,44,45の検査を通じて、研究者はこれらのスティグマを解体し、より信頼性が高く有効な実験計画を作成することができます。

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膣洗浄を利用したげっ歯類の強烈なサイクルモニタリング:通常のサイクルのようなものはありません

Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle

現在の方法論は、雌のスプレイグ・ドーリー(SD)思春期ラットの発情周期を監視するための再現性があり、標準化され、費用対効果の高いアプローチを確立している。この研究は、ホルモンサイクルの複雑さと、信頼性が高く有効なモニタリング技術を構築するために必要な幅広い理解を示しています。主要な実験計画と手続き的要素の詳細な検討を通じて、サイクルとその基本原則のこの記述は、さらなる理解のための枠組みを提供し、将来の複製のための誤解を解体する。
この手順では、膣洗浄を用いたサンプル採取プロセスの概要とともに、発情前期、発情期、小胞体、およびジストラスの4段階モデルへのデータ分類のメカニズムについて説明します。これらの段階は、膣液の状態、存在する細胞型、細胞配置、および収集時の細胞量の4つの分類決定因子を利用する、新しい提案されたアプローチによって特徴付けられる。各段階のバリエーション、好ましいサンプルと好ましくないサンプル、周期性と非循環性の区別、および収集された分類コンポーネントのグラフィック描写は、データの効果的な解釈的および組織的実践とともに提示されます。全体として、これらのツールは定量化可能なデータ範囲を初めて公開することを可能にし、レプリケーション時の分類係数の標準化につながります。

現在のデータは、雄SDラットの存在下での女性の思春期のSD国際遺伝子標準化プログラム(IGS)のデータを反映しています。これらの動物は、共同研究の一環としてペパーダイン大学とUCLAの両方の研究所にありました。図5は、4サイクル段階の複数のバリエーションを示しています。図5A1は、いくつかの細胞型が存在するダイストラスサンプルとして同定された。この例は、上皮細胞の数が多いサンプルが、LEUの優位性など、他の分類成分の適格性を満たす場合に、ダイストラスとして適格であることを示しています。このサンプルはまた、この段階でしばしば見られるLEUsを構成する粘液鎖配置を実証し、これはPRO段階で見られるSNE細胞からなる鎖に類似している。DIE段階の粘液鎖とSNE細胞からなるPRO段階に現れる鎖を区別するには、LEUの優位性を同定することが重要です。図5A2,3は、しばしば観察される細胞配置の進行、すな...

この研究は、雌ラットを含む実験計画において考慮すべき重要な要因を詳述している。より大きな意味では、これらのデータはスティグマを軽減し、より包括的な診断および介入ツールの開発を支援するのに役立ちます。

The current methodology establishes a reproducible, standardized, and cost-effective approach to monitoring the estrous cycle of female Sprague Dawley ...

このプロトコルは、包括的で低コストで時間効率の高い技術の両方を提供するという点で重要です。トランスレーショナルリサーチの重要な要素に答え、個人レベルとグループレベルの両方でコンポーネントデータを分類します。この技術は、動物の全体的なプロフィールに関して抽出することができる総量の情報のために有利である。これには、分類コンポーネントとその後の結論が含まれます。この技術は、心臓病学、神経学、薬理学など、幅広い研究分野への洞察を提供する可能性があります。この手法は、生殖研究にのみ適用できるわけではありません。思春期の高齢ラットの圧縮スタイルのホールドなど、適切な年齢のホールドでラットを扱うことから始め、被験者を鼻を地面に向けて胸上部領域に当てます。シリンジを挿入する前に尾を静かに曲げることによって、被験者の膣管を露出させる。人差し指と中指でシリンジをしっかりと保持しながら、シリンジの先端をそれに平行な角度で膣管に挿入し、プランジャーを親指で内側に押し込んで塩化ナトリウムをゆっくりと運河に排出する。シリンジのプランジャーを上皮ライニングから引き離して、膣管から塩化ナトリウムを抽出します。各細胞タイプの基準を使用して、サンプル中に存在する細胞を特徴付け、所見を記録します。有核化角化上皮細胞または定量化上皮細胞は、ギザギザまたは角張った縁状に見える。核がないにもかかわらず、それはゴースト核と呼ばれる核がかつて存在していた場所を表す細胞内の明るい丸い領域を示すかもしれません。大きな有核上皮細胞、またはLNE細胞は、典型的には、不規則なギザギザまたは角度のある境界によって包まれた円形から多角形の細胞である。それらの核は、死または劣化を受けている細胞の核内のクロマチンの不可逆的な凝縮に関連する無傷から縮退またはピクノティックまでさまざまである。核は細胞内の細胞質よりも少ないスペースを占有し、小さな上皮細胞よりも低い核対細胞質比を有する。白血球はコンパクトな球状細胞である。記載された他のすべての細胞型と比較した場合の最小値。SNE細胞は、細胞内の細胞質よりも大きな空間を占める丸い核を有する非角化細胞であり、大きな上皮細胞と比較してより高い核対細胞質比を作り出す。4 つの X などの低い客観化を使用して、セル全体の配置の代表的なビューを取得します。細胞が凝集しているか、均等に分散しているか、ランダムに分散しているかを記録し、各細胞タイプの特定の組織を書き留めます。次に、総細胞量をスミッジ、中等度、または多数の細胞量として視覚的に推定して記録し、個々の細胞量を、存在する各細胞型の割合として記録する。これらの分類成分を組み合わせて、どの発情周期段階が提示されているかを判断します。diestrus段階では、白血球が優勢または唯一の細胞型であることがわかる。これらは通常、初めに凝集した形で

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