Name: 嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素付加の効果を研究するモデルの設計と開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶ嚢胞性線維症患者の気道マイクロバイオームに対する酸素付加効果をin vitroでモデル化する方法。人工痰培地とスパージング技術を用いて、肺内微生物叢の動態を解析し、慢性肺疾患の治療戦略に貢献する。

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この作業の一部は、海洋生物学研究所、DOE(DE-SC0016127)、NSF(MCB1822263)、HHMI(助成金番号5600373)、サイモンズ財団からの贈り物の支援を受けて海洋生物学研究所で行われました。

この研究は、パートナー機関審査委員会(プロトコル#2018P002934)から承認を受けました。包含基準には、研究のための書面によるインフォームド・コンセントを提供した嚢胞性線維症の成人患者が含まれていた。除外基準はありませんでした。プロトコルガイドラインによると、すべての痰サンプルは、臨床提供者との予定外来訪問中に嚢胞性線維症患者から採取された。
1. 人工痰培地製剤
注:ここに記載されている数量は、最終的な人工痰培地の1 Lの生産のためのものであり、 材料表に記載されている特定の試薬を想定しています。同じ最終製品を確保するために、他のボリュームや異なる試薬の使用に対して、数値を調整する必要があります。目標濃度については 表1 を参照してください。
<ol><li>人工喀痰化学ミックス(ASCM) 注: ASCM は、最終メディア ボリュームの 25% を占めます。それは棚安定性があり、バルクまたは事前に準備することができます。後で使用する場合は、化学ミックスをオートクレーブし、安全に室温で保存してください。<ol>
<li>構成化学ストックソリューションを混合します。<ol>
<li>1 M NaClストックを準備する:無菌水のリットル当たりNaClの58.44 gを追加します。</li>
			<li>1 M KCl ストックを準備する: 滅菌水のリットル当たり KCl の 74.55 g を追加します。</li>
			<li>1 M MgSO4ストックを準備する:無菌水1リットル当たりMgSO 4·7H2Oの246.47g、または無水MgSO4 1リットル当たり120.37gの無水MgSO4を加える。</li>
			<li>1 Mグルコースストックを準備する:滅菌水のリットル当たり180.16グラムのグルコースを追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>オートクレーブは、化学ストック溶液だけでなく、空の250 mLボトルを滅菌します。オートクレーブ処理の手順を、少なくとも標準値の 121 °C、15 PSI を 30 分間実行します。</li>
		<li>空の250 mLボトルに80.59mLの無菌水を加えます。</li>
		<li>ミックスに1 M NaClストックの152.30 mLを追加します。</li>
		<li>ミックスに1 M KClストックの15.8 mLを追加します。</li>
		<li>ミックスに1 M MgSO4 ストックの610 μLを加えます。</li>
		<li>ミックスに1 Mグルコースストックの700 μLを加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>人工喀痰ムチンミックス(ASMM) 注: ASMM は、最終メディア ボリュームの 50% を占めます。最終メディア バッチと同じ日に準備されていることを確認します。<ol>
<li>450 mLの無菌水を空の1Lボトルに加えます。</li>
		<li>50 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)をボトルに加えます。</li>
		<li>使い捨ての磁気攪拌棒をボトルに加えます。</li>
		<li>PBSと攪拌棒を含むボトルをオートクレーブします。</li>
		<li>10gのムチン粉末を測定し、PBSに加えます。</li>
		<li>ボトルを激しく振って予備混合します。</li>
		<li>ボトルを磁気スターラーでホットプレートに置きます。熱を中高ターゲティング50°Cに設定し、攪拌速度を1100rpmに設定します。棒が磁石から飛び降りないように徐々に速度を上げろ。<ol>
<li>熱を加え、15分間かき混ぜます。</li>
			<li>耐熱手袋でボトルを拾います。ムチン粉末が溶液から落ち着くかどうかを確認するために観察します。</li>
			<li>ムチン粉末が完全に溶解していない場合は、ボトルを加熱/攪拌機に5分間戻して、完全に溶解するまで加熱します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ムチンミックスを室温まで冷却します。</li>
	</ol></li>
	<li>人工喀痰生物混合(ASBM) 注: ASBM は、最終メディア ボリュームの 25% です。最終培地バッチと同じ日にそれを準備し、他のミックスとは異なり、任意の熱にその成分を公開しないでください。<ol>
<li>4°C冷蔵庫または氷の上で100xビタミンストックを解凍します。 注:凍結/解凍サイクルの数を最小限に抑えるために、ビタミンストックを10 mLアリコートに事前に分割します。</li>
		<li>空のオートクレーブ250 mLボトルに124.24mLの無菌水を加えます。</li>
		<li>ミックスに50x必須アミノ酸ストックの25.76 mLを追加します。</li>
		<li>80.14 mLの100x非必須アミノ酸ストックをミックスに加えます。</li>
		<li>ミックスに10mL(解凍)100倍のビタミンストックを加えます。</li>
		<li>1000xの微量金属ストックの1mLをミックスに加えます。</li>
		<li>ミックスに30%卵黄エマルジョンの8.33 mLを追加します。</li>
		<li>ミックスに10 g/Lフェリチンストックの400 μLを加えます。</li>
		<li>手動振盪を介して溶液をよく混ぜます。</li>
	</ol></li>
	<li>人工痰培地(ASM)<ol>
<li>ASCMを含む1Lボトルに250mLのASCMを加えます。</li>
		<li>中型ボトルに250mLのASBMを加えます。</li>
		<li>塩基性MOPSバッファー(1M)で媒体をタントレートし、狭い範囲のpH紙で6.3のpHに到達します。滴定する前に、培地ミックスは酸性になりすぎます。</li>
		<li>得られた人工喀痰培地を濾過の準備ができるまで4°Cで冷蔵します。</li>
		<li>濾過プロセスを開始するには、200 mLの未濾過人工痰媒体を、0.22 μmの細孔サイズフィルターを備えた真空ろ過システムに移します。</li>
		<li>ろ過システムを真空ポンプに接続し、真空ポンプをオンにして70mbarに設定し、チャンバーを4°Cの冷蔵室で90rpmで揺れる軌道シェーカーに置きます。<ol>
<li>かなりの量がフィルタリングされるように、培地の追加の150 mLでトップオフ。1 L の培地を完全にフィルタするには 1~2 日かかります。</li>
			<li>すべてのメディアがフィルタリングされるまで、追加のチャンバーで繰り返します。 メモ:Mucinは時間をかけてフィルタを差し込むので、同じ0.22 μmフィルタを介して350 mL以上の媒体をフィルタリングしないようにしてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>4°Cで人工痰培地を冷蔵して使用できる状態にします。最適な結果を得るには、準備から 1 か月以内に ASM を使用してください。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 酸素スパージング
<ol><li>スパージングステーションのセットアップ 注: このプロトコルは、一度だけ完全に行う必要があり、その後、セットアップは、必要に応じて簡単なメンテナンスで維持することができます。酸素スペアリングシステムの視覚的な概略図については 、図1 を参照してください。<ol>
<li>圧縮空気と酸素タンクを入手し、適切に固定します。 注意:高圧は、誤って取り扱われたときにタンクを非常に危険にします。タンクが完全に密閉され、固定され、タンクが閉じられたときに漏れが発生しないようにし、すべての取り扱い担当者がその使用に関する訓練を受けていることを確認します。</li>
		<li>空気レギュレータをレンチ付きの圧縮空気タンクに取り付けます。レギュレータの最適なフロー読み取りのために、レギュレータをできるだけ直立位置に近づけます。</li>
		<li>圧縮酸素タンクに酸素レギュレータを取り付け、できるだけ直立位置に取り付けます。酸素タンクによっては、締め付ける方向を反転する必要があります。</li>
		<li>レギュレータから Y コネクタにチューブを接続し、2 つのタンクからのガス流を結合します。</li>
		<li>Y コネクタの出力を中央 T-ジャンクション バルブに接続します。</li>
		<li>中央T-接合弁の片側をガス圧力計に接続します。</li>
		<li>ガス圧力計の反対側を直径25mmの無菌シリンジフィルターに0.22 μmの細孔サイズで接続します。</li>
		<li>2番目の直径25mmのシリンジフィルターを、スパージング時にガス放出として使用するプランジャーなしでシリンジに取り付けます。</li>
		<li>中央T接合バルブの最終側を、酸素モニタ用の第2のTジャンクションバルブに接続します。</li>
		<li>直径25mmのシリンジフィルターをこの2番目のT接合バルブの片側に接続し、チューブとともに18Gの針を取り付けます。</li>
		<li>第2T接合弁の最終側を酸素監視装置に接続します。</li>
		<li>遮断チューブを、監視中のガス放出として使用する酸素監視装置の反対側に接続します。 注意: 酸素スペアリングシステムをテスト/使用する場合は、T-接合部の位置を注意深くメモし、システムを通る意図したパスと一致することを確認してください。そうしないと、システム内部に圧力が高まり、コンポーネントが故障してばらばらになります。</li>
		<li>システムのメンテナンスと最適なパフォーマンスでの動作を維持するために、次のプラクティスが有益です。<ol>
<li>自由な量のTeflonテープとの接続を強化して、シールを大幅に改善し、内部圧力から離れてコンポーネントが来る可能性を減らします。</li>
			<li>最大圧力を軽減し、故障を防ぐために、結合された流量を10 L/min以下に保ちます。</li>
			<li>漏れが疑われる場合は、市販の液体漏出検知器などの洗剤溶液を使用して、ガス漏れの上に泡立つため、その位置を容易に特定します。ポリテトラフルオロエチレンテープ(例えば、テフロン)を用いたパッチ漏れ。</li>
			<li>直径25mmのシリンジフィルターを酸素スペアリングシステムで隔週で交換しますが、これは使用頻度によって異なります。時間が経つにつれて、フィルターに巻き込まれた粒子は、ガスの流量を減少させ、圧力の蓄積を引き起こします。</li>
			<li>測定を行う前に酸素モニターを21%の酸素圧縮空気に較正してください。</li>
			<li>システムの使用が完了したら、タンクをオフにし、流れが完全に停止するまでレギュレータから余分なガスを出血させます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>血清ボトル培養スパージング<ol>
<li>サンプル識別子、接種日時、および目標酸素率を持つ500 mLオートクレーブ血清ボトルをラベル付けします。</li>
		<li>生物学的フードに、セットアップされている各血清瓶に人工痰培地の24 mLを加えます。</li>
		<li>各血清瓶に18-G針で均質化した患者の痰1mL(必要に応じて滅菌生理食塩水で希釈して、各培養条件に十分な量のサンプルを得る)を加える。</li>
		<li>滅菌ピンセットを使用して、各血清瓶の上部にオートクレーブゴムストッパーを置きます。</li>
		<li>ゴム製ストッパーを押し下げ、ストッパーの下側に手で触れないように注意してください。</li>
		<li>ボンネットからボトルを取り出し、アルミニウムシールを塗布し、圧着します。シールから中心部分を取り外します。</li>
		<li>アルコール拭きでボトルの上部を拭き取り、ブンゼンバーナーの炎を通します。</li>
		<li>無菌18-G針をフィルターでプランジャーレス注射器に貼り付けます。最初にこのガス放出をボトルに挿入します。</li>
		<li>システムから出力されるガスに無菌18-G針を貼り付け、ガス出力針をボトルにも挿入します。</li>
		<li>タンクからTジャンクションを酸素モニターを通してルーティングします。目標酸素濃度がシステムを通って流れているか確認します。約5 L/分のガス流量を目標とする。</li>
		<li>タンクからガス出力まで T ジャンクションを再ルーティングします。ガスは血清瓶を通って流れ始める。 注意:酸素スペアリング中の圧力計に細心の注意を払ってください。圧力が予想外に高まった場合は、すぐにシステムをシャットダウンします。</li>
		<li>血清瓶を通して酸素スパージを1分間走ら。5 L/minで、これは10の空気交換を可能にし、内部大気が所望の分圧に達することを保障する。</li>
		<li>ガス放出18-G針を取り外します。</li>
		<li>血清瓶の圧力を+1雰囲気(海面で2気圧)に構築し、すぐにガス出力針を取り除きます。 注:圧力を維持することは、時間の経過とともに高酸素状態の保持を助けます。</li>
		<li>血清瓶を150RPMで37°Cインキュベーターシェーカーに入れます。3つの24時間間隔のサンプルをインキュベートします。各24時間間隔で、下流分析のためのアリコートを取り、サンプルを再スパージし、72時間の全インキュベーション時間のためにインキュベーションに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>流出酸素測定<ol>
<li>酸素メーターを21%圧縮空気にキャリブレーションし、タンクの電源を切ります。</li>
		<li>酸素モニターを通して血清瓶の摂取量を回し、最後まで滅菌針を貼り付けます。</li>
		<li>ゴム栓を通して針を血清瓶に入れます。</li>
		<li>流出読み取りが安定するまで待ちます。血清ボトルの流量が低いと、最大2分かかる可能性があります。室内空気とのピーク差(21%から最も遠い数)を報告する。</li>
		<li>複数の読み取りを実行する場合は、読み取り値の間に圧縮空気でシステムをフラッシュします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

本研究では、肺微生物群集に対する高酸素の影響を研究するために 、in vitro モデルが開発された。このモデルは、人工喀痰媒質および血清瓶の毎日のスパージングに基づいて、上昇した酸素濃度を維持し、pwCFから痰で同定された微生物の成長をサポートする。
このアプローチには、いくつかの重要なステップがあります。まず、人工痰培地の熱殺菌ではなく、フィルター滅菌を使用する選択である。フィルター滅菌は、培地のムチンおよび他の熱感受性成分の変性を防止し、微生物の成長の光学的測定に使用できる透明な媒体を生み出す。フィルター滅菌は他のプロトコル10でも提案されているが、濾過プロセス中の軌道揺れの添加は、調製された培地の最小量が濾過されたときに発生するフィルタの目詰まりを防ぐために不可欠であることがわかった。濾過された人工痰培地は、フィルタ中のムチンの衝撃による意図より低い最終ムチン濃度を有し得るが、pwCFからの痰は嚢胞性線維症21を有さない人々からの痰よりも低いムチン濃度を有するこ...

嚢胞性線維症(CF)は、肺から厚い粘液を取り除くことができないことを特徴とする遺伝性疾患であり、繰り返し感染し、肺移植または死亡の必要性を引き起こす進行性肺機能の低下につながる。嚢胞性線維症(pwCF)を有する人々の気道マイクロバイオームは、疾患活性1を追跡するように見えるが、有害な長期的な結果2、3に関連する微生物多様性の減少を伴う。pwCFの臨床研究では、補足的な酸素療法は、より高度な疾患4、5と関連しているが、伝統的に、酸素療法の使用は、単に疾患の重症度のマーカーとして見られてきた6。呼吸器不全患者の臨床試験の最近の研究では、患者の酸素レベルが高いほど、重篤な細菌感染の増加と死亡率の上昇に逆説的に関連することが示されており、補足的な酸素が病原発に寄与する可能性があることが示唆されている。嚢胞性線維症肺マイクロバイオームおよび関連する肺および気道微生物群集に対する補足酸素の影響は十分に研究されていない。
多くの場合、機械学的研究は、未知の医学的利益または害の介入に関連する物流上の困難および潜在的な倫理的問題のために、人間の被験者に直接行うことができない。ヒトの生体標本をモデルシステムに統合するトランスレーショナルアプローチは、これらの場合に重要な生物学的洞察を提供することができる。酸素を使用または許容する能力は、伝統的に微生物分類の重要な構成要素であったが、環境への補足酸素の治療的導入が気道微生物群集をどのように摂動させるかについてはほとんど知られていない。pwCFの気道マイクロバイオームに対する補助酸素の未知の影響に光を当てるには、2つの大きな課題に取り組む必要がありました。まず、CF痰の組成を生理学的に近似する培養培地の作成。第二に、培養中の酸素濃度の上昇を長期間にわたって維持できるモデルシステムの作成である。
人工喀痰培地(ASM)は肺痰ex vivo8,9,10をエミュレートするために広く使用されていますが、特定のレシピに関する明確なコンセンサスはありません。このプロトコルは、pwCFから生理学的に近似的な痰に設計された人工痰培地のレシピと準備戦略を記述する。表 1に、公開された文献に基づいて選択したレシピ値の概要を示します。基礎化学成分およびpHは、ヒトCF痰11、12、13の研究によって同定された値に一致した。低濃度の生理学的栄養素を、最終体積10の0.25%として含まれていた卵黄、ならびにビタミンおよび微量金属混合14、15を用いて添加した。痰16の主要成分であるムチンは、1%w/v14に含まれていた。より労働集約的であるが、必須培地成分10の熱誘発性変性による潜在的な問題を低減するために、より従来の熱滅菌の実施よりもフィルタ滅菌が選択された。フィルター滅菌の追加の利点は、透明な媒体を生成することです(熱殺菌は、塩やタンパク質の沈殿と凝固に起因する濁った媒体を作成することができます)、この人工痰培地は、濁度の増加に基づいて微生物の成長に従うために使用することができます。
この高酸素培養モデルは、酸素を除去するのではなく、酸素を添加する嫌気性培養技術に基づいており、pwCFの酸素補充使用の効果を示すモデルを作成する。 図1 と関連する酸素スペアリングプロトコルは、一般の実験室および病院のサプライヤーから低コストで得ることができる酸素スペアリングシステムの成分を概説しています。このシステムは21%から100%の酸素の範囲の固定された濃度に圧縮された酸素および空気の混合を可能にする。酸素センサーの統合は出力ガス混合物の集中の確認、ならびに酸素状態が所望の範囲内で維持されていることを確認するために前にスパージされた血清びんの流出ガスの組成を確認することを可能にする。
このプロトコルは、人工痰培地を作成する手順、酸素スペアリングシステムの構築と使用、および微分酸素条件下での培養CF痰への両方の適用を概説する。

<table><tbody><tr><td>BMEビタミン(100x)溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>B6891</td>サプリメント<td>ビタミンの濃縮溶液。</td></tr><tr><td>クリンパー、30 mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224307</td><td>血清ボトルにアルミニウムシールを取り付けるためのクリンパー。</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>ミリポアSigma</td><td>G7021</td><td>固体グルコース粉末(右旋性異性体)。</td></tr><tr><td>ダイヤフラムポンプ ME 2 NT</td><td>VACUUBRAND</td><td>20730003</td><td>真空ろ過用真空ポンプです。</td></tr><tr><td>卵黄エマルジョン</td><td>HiMedia</td><td>FD045</td><td>生理食塩水に30%卵黄の滅菌エマルジョン。</td></tr><tr>馬の脾臓<td>MilliporeSigma</td><td>F7879</td><td>フェリチン(鉄貯蔵タンパク質)溶液</td><td>からカチオン化されたフェリチン</td>。</tr><tr><td>FIREBOYプラス 安全ブンゼンバーナー</td><td>インテグラ・バイオサイエンス</td><td>144000</td><td>ユーザーインターフェースと安全機能を備えたブンゼンバーナー。</td></tr><tr><td>Hydrion pHペーパー(1.0&ndash;14.0)</td><td>Micro Essential Laboratory</td><td>94</td><td>pH試験紙、1.0&ndash;14.0の範囲。</td></tr><tr><td>Hydrion pHペーパー(4.0&ndash;9.0)</td><td>マイクロエッセンシャルラボ55</td><td></td><td>pH試験紙、4.0〜ndash;9.0の範囲。</td></tr><tr><td>Hydrion pHペーパー(6.0&ndash;8.0)</td><td>Micro Essential Laboratory</td><td>345</td><td>pH試験用紙、6.0&ndash;8.0の範囲。</td></tr><tr><td>皮下注射針-Pro EDGE安全装置、18G</td>ス<td>ミスメディカル</td><td>401815</td><td>18G針、安全キャップ付き。</td></tr><tr><td>インライン圧力計</td><td>ミリポアシグマ</td><td>20469</td><td>ボトルの圧力を監視するためのガス圧力計です。</td></tr><tr><td>Innova 42 インキュベートシェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231000756</td><td>コンビネーションインキュベーター/オービタルシェーカー。</td></tr><tr><td>針付きルアーロックシリンジ</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>309580</td><td>3mLシリンジと18G針の組み合わせ。</td></tr><tr><td>ルアーバルブの品揃え</td><td>ワールド精密機器</td><td>14011</td><td>ガスフローチューブ用バルブ。</td></tr><tr><td>LSEオービタルシェーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>6780-NP</td><td>ろ過中に媒体を攪拌するためのオービタルシェーカー。</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M2773</td><td>固体エプソム塩(硫酸マグネシウム七水和物)。</td></tr><tr><td>流量計付き医療用エアシングルステージレギュレータ</td><td>ー ウエスタンエンタープライズ</td><td>M1-346-15FM</td><td>15 L / minメーター付きエア流量レギュレーター。</td></tr><tr><td>MEMアミノ酸(50x)溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M5550</td><td>必須アミノ酸の濃縮溶液。</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (100x) 溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>M7145</td><td>非必須アミノ酸の濃縮溶液。</td></tr><tr><td>Millex-GPフィルター、0.22 &micro;m</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLMP25SS</td><td>0.22 & マイクロ;Mポリエーテルスルホン膜滅菌シリンジフィルター。</td></tr><tr><td>ミリQアカデミック</td><td>ミリポアシグマ</td><td>ZMQS60E01</td><td>ミリQ滅菌水ろ過システム。</td></tr><tr><td>MiniOX 3000 酸素モニター</td><td>MSA</td><td>814365</td><td>ガス流量酸素パーセンテージモニター。</td></tr><tr><td>MOPSバッファー(1 M、pH 9.0)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBM-90</td><td>培地のpHを調整するためのMOPSバッファーです。</td></tr><tr><td>ブタ胃</td><td>ミリポアの</td>ムチンSigma <td>M2378</td><td>ムチン(グリコシル化ゲル形成タンパク質)粉末。</td></tr><tr>ガス<td>の流れの管のための</td><td>自然なポリプロピレンの有刺鉄線の付属品のキット</td><td>ハーバードの器具</td><td>72-1413</td>コネクター。</tr><tr><td>Nextera XT DNAライブラリ調製キット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td>シーケンシング中の同定のためのライブラリ調製。</td></tr><tr><td>NovaSeq 6000 シーケンシングシステム</td><td>Illumina</td><td>770-2016-025-N</td><td>サンプルリードを生成するためのショットガンシーケンシングプラットフォーム。</td></tr><tr><td>流量計付き酸素単段レギュレータ</td>ー <td>ウエスタンエンタープライズ</td><td>M1-540-15FM</td><td>15 L/minメーター付き酸素流量レギュレーター。</td></tr><tr><td>2つの標準コネクタ付き酸素チューブ</td><td>SunMed</td><td>2001-01</td><td>ガスシステムコンポーネントを接続するためのチューブ。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、10x、pH 7.4</td><td>Molecular Biologicals International</td><td>MRGF-6235</td><td>濃縮リン酸緩衝生理食塩水。</td></tr><tr><td>PC 420 ホットプレート/スターラー</td><td>マーシャル・サイエンティフィック</td><td>CO-PC420</td><td>ホットプレート/スターラーの組み合わせ。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P9541</td><td>固体塩化カリウム塩。</td></tr><tr><td>PTFEの使い捨て可能な攪拌棒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td>使い捨て可能な磁気攪拌棒。</td></tr><tr><td>PTFEの糸のシールのテフロン テープ</td><td>VWR</td><td>470042-938</td><td>ガス システム関係を補強するためのテフロン テープ。</td></tr><tr><td>Q-Gard 2 ピュリフィケーションカートリッジ</td><td>MilliporeSigma</td><td>QGARD00D2</td><td>Milli-Q システム用のピュリフィケーションカートリッジです。</td></tr><tr><td>再利用可能な培地保存ボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-423A</td><td>培養培地を混合・保存するためのボトルです。</td></tr><tr><td>ラバーストッパー、30 mm、グレーブロモブチル</td><td>DWKライフサイエンス</td><td>224100-331</td><td>血清ボトル用ラバーストッパー。</td></tr><tr><td>成形目盛り付き血清ボトル、500 mL</td><td>DWK Life Sciences</td><td>223952</td><td>密封培養用のガラス製血清ボトル。</td></tr><tr><td>スモールボアエクステンションセット</td><td>ブラウンメディカル</td><td>471960</td><td>ルアーロックコネクタ付きチューブエクステンション。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S3014</td><td>固体塩化ナトリウム塩。</td></tr><tr><td>スパイクインコントロール I (高微生物負荷)</td> <td>ZymoBIOMICS</td><td>D6320</td><td>スパイクイン微生物 (I. halotolerans and A. halotolerans) 絶対微生物負荷計算用</td></tr><tr><td>Stericup クイックリリース 滅菌真空ろ過システム</td><td>MilliporeSigma</td><td>S2GPU02RE</td><td>250 mL 0.22 &micro;m真空ろ過チャンバー。</td></tr><tr><td>スーパーサニクロス殺菌使い捨てワイププロフェッショナル</td><td>使い捨てワイプ国際</td><td>H04082</td>滅菌<td>のための使い捨て殺菌ワイプ。</td></tr><tr><td>微量金属混合物、1000x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC0112668</td><td>生理学的微量金属の濃縮溶液。</td></tr><tr><td>非裏地アルミニウム シール、30 mm</td><td>DWK Life Sciences</td><td>224187-01</td><td>ゴム製ストッパーの上に圧着されたアルミニウム シール。</td></tr><tr><td>USP医療グレードのエアタンク</td><td>エアガス</td><td>AI USP200</td><td>散布システムへの入力用の圧縮空気タンク。</td></tr><tr><td>USP医療グレードの酸素タンク</td><td>エアガス</td><td>OX USP200</td><td>散布システムへの入力用の圧縮酸素タンク。</td></tr></tbody></table>

嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素付加の効果を研究するモデルの設計と開発

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

気道微生物群集は、嚢胞性線維症(CF)および他の慢性肺疾患の進行に重要な役割を果たすと考えられている。微生物は、伝統的に酸素を使用または許容する能力に基づいて分類されてきました。補足酸素は嚢胞性線維症(pwCF)を持つ人々に投与される一般的な医療療法である;しかし、酸素と気道マイクロバイオームに関する既存の研究は、高酸素(高酸素)ではなく低酸素(低酸素)が主に好気性および栄養性嫌気性肺微生物群集に及ぼす影響に焦点を当てている。この重要な知識のギャップに対処するために、このプロトコルはpwCFからの痰の組成を模倣する人工痰媒体を使用して開発された。透明な媒体をもたらすフィルター殺菌の使用は、光学的方法が懸濁培養中の単細胞の微生物の成長に従うことを可能にする。高酸素状態を作り出すために、このモデルシステムは、高酸素状態を研究するために確立された嫌気性培養技術を利用する;酸素を除去する代わりに、酸素は、圧縮された酸素と空気の混合物と血清ボトルの毎日のスパージングによって培養物に追加されます。50 pwCFの痰は、このモデルが微分酸素状態を維持する能力を検証するために、72時間の間毎日のスペアリングを受けました。ショットガンメタゲノムシーケンシングは、嚢胞性線維症痰に一般的に見られる昏睡および病原性微生物の増殖をサポートするこの培地の能力を検証するために、11 pwCFの培養および未培養痰サンプルに対して行われた。成長曲線は、一般的な嚢胞性線維症病原体の増殖をサポートするこの人工痰培地の能力を検証するためにpwCFから得られた112の分離株から得られた。このモデルは、CF痰中の多種多様な病原体および分性を培養し、ノルモキシ状態下で未培養痰に非常に類似したコミュニティを回収し、様々な酸素条件下で異なる培養機種を作り出すことを発見した。この新しいアプローチは、気道微生物群集および一般的な呼吸器病原体にpwCFの酸素の使用によって誘発される予期せぬ影響のより良い理解につながる可能性があります。

これらのプロトコルは、マサチューセッツ州ボストンのマサチューセッツ総合病院の外来嚢胞性線維症クリニックに定期的なケアのために提示するpwCFから50の期待痰サンプルに適用されました。各患者の痰は、人工痰培地を用いて21%、50%、および100%の酸素条件下で培養され、各培養から0.5mLのアリコートを24時間、48時間、および72時間の培養時間で試験用に採取した。文化は、視覚的な変化を追跡するために抽出されたときに撮影されました。さらに、培養前に各々の一次痰試料の0.5mLのアリコートを採取した。その結果、患者1人あたり10個の離散サンプルと500サンプルの最終Nが得られた。このうち、11人の患者の痰(11人の未培養痰、48時間のインキュベーションで21%の酸素から11の培養スプータ)が核酸抽出17を受け、シーケンシングライブラリを市販のDNAライブラリ調製キットを用いて生成し、メタゲノムシーケンシングプラットフォーム全体で行った ペアエンド読み取り。生の読み取りは、MetaPhlAn3プロファイラ19を使用して、人間の「汚染物質」配列と分類...

このプロトコルの目的は、嚢胞性線維症の気道微生物群集に対する高酸素の効果に対するモデルシステムを開発することです。 人工喀痰培地は痰の組成をエミュレートし、高酸素培養条件は肺微生物群集に対する補足的な酸素の影響をモデル化する。

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

これらのプロトコルは、嚢胞性線維症患者の肺マイクロバイオームに対する補助酸素使用のインビトロ効果をモデル化するように設計されている。このメディアレシピは、嚢胞性線維症で生活する人々のための痰の生理学的組成を反映するように調整されています。スペアリングプロセスは、異なる酸素条件下で培養する能力を導入します。人工痰培地への変更により、他の慢性肺疾患を模倣し、同時嚢胞性線維症および糖尿病患者における異なるグルコース濃度などの他の条件下で微生物群集をモデル化することができる。人工痰培地調製のステップの概要は、調製されたASCM、ASMMおよびASBMの混合を示す。モップバッファーは、pHを6.3にテタリングするために使用され、媒体のフィルター滅菌は、軌道シェーカー上の冷たい部屋で行われます。まず、ASMMを含む1リットルのボトルに250ミリリットルのASCMを加えて人工痰培地を調製します。その後、中程度のボトルにASBMの250ミリリットルを追加します。基本的な1つのモルモップバッファーで培地をタントレートし、pH紙で6.3のpHに到達します。ろ過するまで人工痰培地を摂氏4度で冷蔵します。その後、濾過プロセスを開始するには、200ミリリットルの未濾過人工痰培地を0.22マイクロメートルの細孔サイズフィルタを備えた真空ろ過システムに移します。ろ過システムを真空ポンプに接続した後、真空ポンプをオンにしてから、チャンバーを軌道シェーカーに置き、冷たい部屋で1分あたり90回転で摂氏4度で揺れます。350ミリリットルの媒体が詰まりの問題を克服するためにフィルタリングされた後、フィルタを変更します。かなりの量が濾過された後、濾過のための余分な150ミリリットルの媒体で。すべての媒体が濾過されるまで、追加のチャンバーで濾過を繰り返します。オートクレーブされた血清瓶に人工痰培地に患者の痰を添加することを示す酸素スペアリングの概要。その後、密封された血清瓶を混合ガスでスパージします。最後に、血清瓶をインキュベートし、その後のメタゲノミクスシーケンシングのための24時間間隔で培養アレック・ワッツを得る。血清ボトル培養スパージングを開始するには、サンプル識別子、接種日時、および目標酸素率を持つ500ミリリットルオートクレーブ血清ボトルをラベル付けします。生物学的フードに、セットアップされている各血清瓶に人工痰培地の24ミリリットルを加えます。各培養条件に十分なサンプル量を得るために、必要に応じて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水でサンプルを希釈し、次いで18ゲージ針で痰を均質化し、患者痰の1ミリリットルを各血清瓶に加える。次に、滅菌ピンセットを使用して、オートクレーブされたゴムストッパーを各血清瓶の上部に置き、ストッパーの下側に触れることなくゴムストッパーを押し下げる。ボンネットからボトルを取り外した後、アルミニウムシールを塗布し、圧着します。シールの目玉を取り出し、アルコール拭きでボトルの上部を拭き取り、ブンゼンバーナーの炎を通してボトルシールを渡します。今、フィルターでプランジャーリストシリンジに無菌、18ゲージ針を固定し、最初にボトルに貼り付けられたガス放出注射器を挿入します。滅菌、18ゲージの針をシステムからのガス出力に固定し、ガス出力針をボトルにも挿入します。タンクから T 接合を酸素モニタを通してルーティングします。システム内を流れる目標酸素濃度を検証した後、ガス流量の毎分約5リットルを目標とする。タンクからガス出力まで T 接合部を再ルーティングします。ガスが血清瓶を通って流れ始めると、圧力計に細心の注意を払い、圧力が予想外に上昇した場合は、すぐにシステムを停止します。走行後、1分間に5リットルで1分間、血清瓶を通して酸素がスパージし、設定は10の空気交換を可能にし、内部雰囲気が100%酸素の所望の濃度に達することを確認する。ガス放出、18ゲージの針を取り除きます。血清瓶内の圧力を1気圧にして1気圧にした後、すぐにガス出力針を取り外します。3、24時間間隔で1分あたり150回転で37°Cインキュベーターシェーカーで血清ボトルをインキュベートします。Alec Watts は、ダウンストリーム解析のために 24 時間間隔ごとに取得され、サンプルは毎回取り込まれます。この例は、培養前後の文化の外観を示しています。流出酸素およびpHレベルは、37°Cで維持された痰サンプルの培養過程で測定した。12時間と24時間の両方のスパージング間隔で、酸素濃度は、3つの条件すべてについて観察された酸素濃度の中程度の低下と時間の経過とともにほぼ維持された。測定されたpHレベルは、時間の経過とともに有意な変化を伴う生理学的範囲内であった。未培養および培養痰の間の微生物負荷、多様性およびコミュニティ組成の比較により、培養痰中の微生物負荷が20倍に増加することが明らかになった。多様性指標は、文化プロセスによってもたらされる世界的な違いを最小限に抑えたコミュニティ構成の保全を示した。培養および未培養の喀痰中の120種の微生物の比較分析を、メタゲノムシーケンシングにより行った。これらの種のうち46種は、未培養および培養サンプルの両方で同定された。35は未培養サンプルで独占的に同定され、39は培養サンプルで独占的に同定された。吸収体ベースの成長曲線は、通常の21%酸素濃度の患者試料分離株から人工痰培地で培養された一般的なCF肺病原体に対して生成された。ASMの600ナノメートルの光学密度の経時変化は、唯一の負の対照は汚染のない培養を示した。観察された典型的な成長曲線パターンは、ASM培地が光学法を用いた成長曲線の生成に使用できることを示す。メタゲノムシーケンシングは、微生物群集組を記述するためにここで使用されます。メタトランスクリプトームシーケンシングなどの他の技術は、代謝産物の産生を評価するために遺伝子発現または代謝産物を評価するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

出典: Vieira、J.、 et al。 嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素補給の影響を研究するためのモデルの設計と開発 J. Vis. 経験。 (2021)。このビデオは、嚢胞性線維症肺の粘度、栄養組成、およびpHを模倣した人工喀留培地の調製を示しています。得られた培地は、ex...

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