嚢胞性線維症気道マイクロバイオームに対する酸素付加の効果を研究するモデルの設計と開発
August 3rd, 2021
このプロトコルの目的は、嚢胞性線維症の気道微生物群集に対する高酸素の効果に対するモデルシステムを開発することです。 人工喀痰培地は痰の組成をエミュレートし、高酸素培養条件は肺微生物群集に対する補足的な酸素の影響をモデル化する。
これらのプロトコルは、嚢胞性線維症患者の肺マイクロバイオームに対する補助酸素使用のインビトロ効果をモデル化するように設計されている。このメディアレシピは、嚢胞性線維症で生活する人々のための痰の生理学的組成を反映するように調整されています。スペアリングプロセスは、異なる酸素条件下で培養する能力を導入します。
人工痰培地への変更により、他の慢性肺疾患を模倣し、同時嚢胞性線維症および糖尿病患者における異なるグルコース濃度などの他の条件下で微生物群集をモデル化することができる。人工痰培地調製のステップの概要は、調製されたASCM、ASMMおよびASBMの混合を示す。モップバッファーは、pHを6.3にテタリングするために使用され、媒体のフィルター滅菌は、軌道シェーカー上の冷たい部屋で行われます。
まず、ASMMを含む1リットルのボトルに250ミリリットルのASCMを加えて人工痰培地を調製します。その後、中程度のボトルにASBMの250ミリリットルを追加します。基本的な1つのモルモップバッファーで培地をタントレートし、pH紙で6.3のpHに到達します。
ろ過するまで人工痰培地を摂氏4度で冷蔵します。その後、濾過プロセスを開始するには、200ミリリットルの未濾過人工痰培地を0.22マイクロメートルの細孔サイズフィルタを備えた真空ろ過システムに移します。ろ過システムを真空ポンプに接続した後、真空ポンプをオンにしてから、チャンバーを軌道シェーカーに置き、冷たい部屋で1分あたり90回転で摂氏4度で揺れます。
350ミリリットルの媒体が詰まりの問題を克服するためにフィルタリングされた後、フィルタを変更します。かなりの量が濾過された後、濾過のための余分な150ミリリットルの媒体で。すべての媒体が濾過されるまで、追加のチャンバーで濾過を繰り返します。
オートクレーブされた血清瓶に人工痰培地に患者の痰を添加することを示す酸素スペアリングの概要。その後、密封された血清瓶を混合ガスでスパージします。最後に、血清瓶をインキュベートし、その後のメタゲノミクスシーケンシングのための24時間間隔で培養アレック・ワッツを得る。
血清ボトル培養スパージングを開始するには、サンプル識別子、接種日時、および目標酸素率を持つ500ミリリットルオートクレーブ血清ボトルをラベル付けします。生物学的フードに、セットアップされている各血清瓶に人工痰培地の24ミリリットルを加えます。各培養条件に十分なサンプル量を得るために、必要に応じて、滅菌リン酸緩衝生理食塩水でサンプルを希釈し、次いで18ゲージ針で痰を均質化し、患者痰の1ミリリットルを各血清瓶に加える。
次に、滅菌ピンセットを使用して、オートクレーブされたゴムストッパーを各血清瓶の上部に置き、ストッパーの下側に触れることなくゴムストッパーを押し下げる。ボンネットからボトルを取り外した後、アルミニウムシールを塗布し、圧着します。シールの目玉を取り出し、アルコール拭きでボトルの上部を拭き取り、ブンゼンバーナーの炎を通してボトルシールを渡します。
今、フィルターでプランジャーリストシリンジに無菌、18ゲージ針を固定し、最初にボトルに貼り付けられたガス放出注射器を挿入します。滅菌、18ゲージの針をシステムからのガス出力に固定し、ガス出力針をボトルにも挿入します。タンクから T 接合を酸素モニタを通してルーティングします。
システム内を流れる目標酸素濃度を検証した後、ガス流量の毎分約5リットルを目標とする。タンクからガス出力まで T 接合部を再ルーティングします。ガスが血清瓶を通って流れ始めると、圧力計に細心の注意を払い、圧力が予想外に上昇した場合は、すぐにシステムを停止します。
走行後、1分間に5リットルで1分間、血清瓶を通して酸素がスパージし、設定は10の空気交換を可能にし、内部雰囲気が100%酸素の所望の濃度に達することを確認する。ガス放出、18ゲージの針を取り除きます。血清瓶内の圧力を1気圧にして1気圧にした後、すぐにガス出力針を取り外します。
3、24時間間隔で1分あたり150回転で37°Cインキュベーターシェーカーで血清ボトルをインキュベートします。Alec Watts は、ダウンストリーム解析のために 24 時間間隔ごとに取得され、サンプルは毎回取り込まれます。この例は、培養前後の文化の外観を示しています。
流出酸素およびpHレベルは、37°Cで維持された痰サンプルの培養過程で測定した。12時間と24時間の両方のスパージング間隔で、酸素濃度は、3つの条件すべてについて観察された酸素濃度の中程度の低下と時間の経過とともにほぼ維持された。測定されたpHレベルは、時間の経過とともに有意な変化を伴う生理学的範囲内であった。
未培養および培養痰の間の微生物負荷、多様性およびコミュニティ組成の比較により、培養痰中の微生物負荷が20倍に増加することが明らかになった。多様性指標は、文化プロセスによってもたらされる世界的な違いを最小限に抑えたコミュニティ構成の保全を示した。培養および未培養の喀痰中の120種の微生物の比較分析を、メタゲノムシーケンシングにより行った。
これらの種のうち46種は、未培養および培養サンプルの両方で同定された。35は未培養サンプルで独占的に同定され、39は培養サンプルで独占的に同定された。吸収体ベースの成長曲線は、通常の21%酸素濃度の患者試料分離株から人工痰培地で培養された一般的なCF肺病原体に対して生成された。
ASMの600ナノメートルの光学密度の経時変化は、唯一の負の対照は汚染のない培養を示した。観察された典型的な成長曲線パターンは、ASM培地が光学法を用いた成長曲線の生成に使用できることを示す。メタゲノムシーケンシングは、微生物群集組を記述するためにここで使用されます。
メタトランスクリプトームシーケンシングなどの他の技術は、代謝産物の産生を評価するために遺伝子発現または代謝産物を評価するために使用することができる。
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概要
このプロトコルは、嚢胞性線維症における気道微生物叢への過酸素症の影響を研究するためのモデルシステムを概説しています。人工痰培地を使用して痰の組成を再現し、過酸素条件を用いて肺微生物叢に対する追加酸素の影響をシミュレートします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 呼吸器の健康
- 嚢胞性線維症研究
背景
- 嚢胞性線維症患者はしばしば肺の微生物叢の変化を経験します。
- 追加酸素は肺の微生物叢に影響を与える可能性があります。
- 人工痰培地は嚢胞性線維症の生理的条件を模倣するように設計されています。
- これらの相互作用を理解することで治療戦略に役立ちます。
研究の目的
- 肺微生物叢への過酸素症の影響を研究するためのモデルを開発する。
- 微生物叢の培養に人工痰培地を利用する。
- 嚢胞性線維症およびその他の慢性肺疾患への影響を探る。
使用した方法
- 人工痰培地（ASCM）の調製。
- スポルジングを通じた様々な酸素条件の導入。
- 最適な条件を達成するためのmops緩衝液を使用したpH滴定。
- 管理された環境下での培地のフィルター滅菌。
主な結果
- 過酸素条件下での微生物叢の成功的なモデル化。
- 人工痰培地の異なる疾患に対する適応性を示しました。
- グルコースレベルと微生物成長の間の潜在的な相互作用を特定しました。
- 肺微生物叢に関する将来の研究のための枠組みを提供しました。
結論
- このモデルは追加酸素が肺微生物叢に与える影響を効果的にシミュレートします。
- 人工痰培地は様々な慢性肺疾患に適応させることができます。
- この研究は嚢胞性線維症における微生物力学の理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modeling the impact of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome addresses a critical gap in understanding how hyperoxic conditions influence microbial community dynamics. This capability enables predictive assessment of therapeutic interventions and supports risk-adjusted decisions in respiratory drug discovery pipelines. The approach enhances translational continuity by providing a physiologically relevant in vitro system for mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community responses to oxygen modulation in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the effects of hyperoxia on pathogen and commensal populations.
- Facilitates functional target validation for interventions aimed at modulating airway microbiota.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized artificial sputum medium for reproducible microbial culture under controlled oxygen conditions.
- Enables quantitative growth curve generation for common cystic fibrosis pathogens using optical density measurements.
- Supports assay readiness for evaluating compound effects on microbial community composition and load.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with clinical airway microbiome profiles through metagenomic sequencing comparisons.
- Maintains translational relevance by preserving community diversity and composition under normoxic and hyperoxic conditions.
- Enables risk-adjusted advancement of microbiome-modulating therapies by modeling real-world supplemental oxygen exposure.
Pipeline & Workflow Integration
This model system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of oxygen effects on airway microbiota, supporting both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on oxygen-driven microbial shifts and their mechanistic implications.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for microbial growth and community analysis.
- Analytics: Provides metagenomic and optical density readouts for robust condition comparisons.
- Translational Research: Bridges in vitro and clinical microbiome data for biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to other chronic lung disease models and metabolic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-targeted interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes microbial culture conditions and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for respiratory portfolio assets by modeling clinically relevant oxygen exposures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiome-modulating candidates and supports cross-program data integration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, metagenomics, and respiratory disease modeling.
- Needs access to controlled gas sparging systems, incubator shakers, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of artificial sputum medium preparation and oxygen modulation protocols.
- Adaptable to model other chronic lung diseases or metabolic comorbidities by modifying medium composition.
- Limitations include the need for careful oxygen and pH monitoring to maintain physiological relevance.
