Name: mRNAを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子を用いたmRNAワクチン製造法。簡単なピペッティング操作で核酸を封入し、凍結乾燥による長期保存も可能です。免疫応答誘導の基礎研究に応用できます。

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<li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing%2C+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+%28beta-amino+ester%29s+%28PBAEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li>
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<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications%3A+size%2C+surface+charge+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li>
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<li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions%3A+Current+evidence+and+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li>
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<li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li>
<li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示したり、利益相反を持っていません。

昨年Covid-19大流行が発生した後、感染症対策の観点からワクチンの重要性が重要な成分8として明らかになってきた。世界中の科学者からの努力は、多くのワクチンの市場へのリリースを可能にしました。歴史上初めて、mRNAワクチンは、数ヶ月以内に新しい抗原に適応する能力のために彼らの迅速な設計のおかげで、以前の仮説の成功を実証しました5,6,21.mRNAは、リボ核酸をメッセンジャー、DNAにコードされた情報からタンパク質合成を駆動する核酸をいう。ここで、ワクチン接種のために、mRNAは、感染性微生物に属する抗原タンパク質(または治療的腫瘍ワクチン接種の場合には腫瘍抗原に対して)8,22に対して体系化する。この文脈では、科学界がmRNAワクチンを合成するための明確なプロトコルを持つことは重要です...

感染症は、世界中の何百万人もの人間に深刻な脅威を表しており、依然として一部の発展途上国における主要な死因の1つです。予防ワクチン接種は、感染症1,2を予防・管理するための現代社会の最も効果的な介入の一つであった。20世紀の関連性における科学のこれらの重要なマイルストーンは、SARS-CoV-2ウイルス3によって引き起こされる最近の世界的なCovid-19パンデミックによって述べられています。病気の普及を抑制するために効率的なワクチンを持つことの重要性を認識し、すべての生物医学界からの協力的な努力は、1年未満で市場で多くの予防ワクチンを成功に導いた4年未満。
伝統的に、ワクチンは減衰(生きている、減少した病原性)または不活性化(死粒子)ウイルスで構成されていた。しかし、安全ミスのマージンのない病気の場合、ウイルス粒子は不可能であり、代わりにタンパク質サブユニットが使用されます。それにもかかわらず、サブユニットは通常、複数のエピトープ/抗原の組み合わせを可能にせず、ワクチン接種効力を高めるためにアジュバントが必要である5,6。したがって、新しいワクチンタイプの必要性は明らかです。
現在のパンデミックの間に示されているように、核酸に基づく新しいワクチン候補は、長い開発プロセスを回避し、同時に重要な患者の免疫を産生しながら高い汎用性を提供するという点で有利であり得る。これは、最初に実験的ながんワクチンとして設計されたmRNAワクチンの場合です。抗原特異的T細胞応答3、5、6、7を生成するその自然な能力のおかげで。mRNAは抗原性タンパク質をコードする分子であり、同じ変化を変えるだけで、ワクチンは同じ微生物の他の変異体を免疫するように迅速に調整することができ、異なる株、他の感染性微生物、あるいは癌免疫療法治療にもなる。また、大規模な生産コストの面でも有利です。しかし、mRNAは裸の投与を妨げる重大なハードルを持っています:その安定性と完全性は、ヌクレアーゼでいっぱいの生理学的媒体で損なわれます。このため、抗原提示細胞にmRNAをベクター化してそれを保護するナノメトリックキャリアの使用が2,8に必要である。
この文脈では、ポリ(βアミノエステル)(pBAE)は、カチオン電荷9、10、11のおかげで、ナノメトリック粒子中の複雑なmRNAに顕著な能力を示した生体適合性および生分解性ポリマーのクラスである。これらのポリマーは、エステル結合で構成されており、生理学的条件下でのエステラーゼによる分解が容易になります。pBAEライブラリー候補のうち、末端のカチオンオリゴペプチドで機能化したものは、エンドサイトーシスを通じて細胞を効率的に透過し、カプセル化された遺伝子材料をトランスフェクトする小さなナノ粒子を形成する高い能力を示した。さらに、その緩衝能力のおかげで、エンドソームコンパートメントの酸性化により、内経エスケープ12,13が可能となる。すなわち、特定の種類のpBAE、 骨格の疎水性部分(いわゆるC6 pBAE)を含む彼らの安定性とエンドオリゴペプチドの組み合わせを高める(トリリジンで修飾されたポリマーの60%とトリヒスチジンを有するポリマーの40%)は、非経口投与後に選択的に抗原提示細胞をトランスフェクトし、mRNAコード化された抗原提示を行う.さらに、これらの製剤は、ナノメディシン製剤の主なボトルネックステップの1つを回避できることも実証されている:それらの機能性を失うことなく凍結乾燥する可能性は、ソフトドライ環境15での長期安定性を可能にする。
この文脈において、現在のプロトコルの目的は、プロトコルの重要なステップの説明を与え、感染症予防および腫瘍治療アプリケーションのための効率的なワクチンの生産を可能にすることによって、科学界にmRNAナノ粒子の形成のための手順を提供することである。
以下のプロトコルは、オリゴペプチドの最終修飾ポリ(βアミノエステル)-ナノ粒子合成に更に使用されるOM-pBAEポリマーを合成するための完全なトレーニングを記述する。プロトコルには、ナノ粒子製剤も含まれる。さらに、結果として得られる製剤が正または否定的な結果を定義するために必要な品質管理特性評価機能を確実に達成するために、手順および代表的な結果の成功のための重要なステップも提供される。このプロトコルの概要を 図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>1,4-ブタンジオールジアクリレート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-ヘキシルアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-アミノ-1-ペンタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Panreac</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>CD11b 抗体</td><td>BD</td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>CD86 抗体</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>クロルヒドロキシヒド</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>Cys-His-His-His ペプチド</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Cys-Lys-Lys-Lys ペプチド</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Rnase free water 用 DEPC 試薬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>この試薬は、緩衝液の任意のRNaseを除去するためにMilliQ水を処理するために重要です</td></tr><tr><td>ジエチルエ</td><td>ターPanreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>mRNA EGFP</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>mRNA OVA</td><td>TriLinkテクノロジー</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>RiboGreenキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-マウス AlexaFluor488 抗体</td><td>アブカム</td><td>Ab450105</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>核磁気共鳴分光計</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>ゼータ電位と流体力学的サイズ決定</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTAソフトウェア</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-EN-00</td><td></td></tr><tr><td>NovoExpressソフトウェア</td><td>Agilent</td><td>未指定</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizerソフトウェア</td><td>Malvern Panalytical</td><td>のDTSアプリケーション</td><td>表面電荷と流体力学サイズを分析するには</td></tr></tbody></table>

mrnaを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

予防接種は現代社会の大きな成功の一つであり、病気の予防と予防に欠かせないものです。従来のワクチンは、感染因子の全体または一部で構成されていた。しかし、課題は残っており、新しいワクチン技術が不可欠です。この文脈において、免疫目的のためのmRNAの使用は、SARS-CoV-2感染を予防する2つのmRNAワクチンの迅速な承認によって示されるように、強化された性能を示している。ウイルス感染の予防に成功するだけでなく、mRNAワクチンを治療用のがん用途にも使用できます。
それにもかかわらず、ヌクレアーゼの存在によるmRNAの不安定性および身体からの速いクリアランスは、その裸の送達を不可能にする。この文脈において、ナノ医薬品、特に高分子ナノ粒子は、重要なmRNA送達系である。したがって、本稿の目的は、独自の高分子ナノ粒子に基づくmRNAワクチン候補の処方および試験のためのプロトコルを記述することである。使用されるポリ(βアミノエステル)ポリマーの合成と化学的特徴づけ、ナノ粒子を形成するためのmRNAによる錯体化、およびそれらの凍結乾燥方法論について、ここで議論する。これは、ストレージと流通のコストを削減するための重要なステップです。最後に、 インビトロ トランスフェクトおよび成熟モデル樹状細胞に対する能力を実証するために必要な試験が示される。このプロトコルは、これらのワクチンが多種多様な疾患を予防または治癒することを可能にする高い汎用性のために、ワクチン接種に取り組んでいる科学界に利益をもたらすでしょう。

ポリマー合成と特性評価 OM-pBAE合成手順は 図2に示されています。 図2A が示すように、OM-pBAEを得る第一の工程は、アミン(1-ヘキシルアミンおよび5-アミノ-1-ペンタノール、比1:1)をジアクリレート(1,4-ブタンジオールジアクリレート)に添加してC6-pBAEを合成することです。この反応は、90°Cで20時間、一定の攪拌を行う。その後、オリゴペプチドの溶液を、前の反応から得られたC6ポリマーの溶液に添加する(図2B)。最後に、合成は20時間連続撹拌しながら25°Cで溶媒としてDMSOを用いて行なう。 図2C は、重合の結果として生じる生成物であるOM-pBAEの構造を示す。得られたポリマーは 、1H-NMR( 補足図S2を参照)によって特徴付けられる。特性評価では、正の結果は、7~10...

ここでは、ポリ(βアミノエステル)ポリマーに基づいてmRNAナノ粒子を製造するための簡単なプロトコルが提示され、カプセル化されたmRNAを変更することによって容易に調整できる。また、ポリマー、ナノ粒子、およびそれらの インビトロ 必須の特徴を合成するためのワークフローも記載されている。予防接種に関する概念実証も追加されます。

mRNAを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

このプロトコルは、ポリマーナノ粒子を調製する方法を示すため、重要であり、核酸を1つの簡単なステップでカプセル化した。この技術の主な利点は、汎用性であり、異なる核酸および細胞タイプに適用することができる。粒子調製のための簡単な手順の使用は、例えば上下のピペット、および凍結乾燥によってナノ粒子およびドラム条件の安定性を拡張する可能性。この手順のデモンストレーションは、ローラ・オルモ、コーラル・ガルシア=フェルナンデス、マリア・スタンパ・ロペス=ピント、マリア・ナヴァロン=ロペス、私たちの研究室の博士課程の学生、マルタ・ディアス・カバジェロです。ポリプレックス形成の場合、以前に調製したポリマー、C6ペプチド、ポリβアミノエステル、およびボルテックス溶液を解凍する。ポリマーを上下に混合した後、酢酸ナトリウムに12.5ミリモル溶液を調製する。溶液を渦に入れ、10分待ちます。次に、ミリリットル当たり0.5ミリグラムでmRNAを調製し、ピペット処理で混合する。ポリマー溶液を再びボルテックスし、ポリマー溶液中の遺伝物質溶液をマイクロ遠心管で1対1の比率で混合し、サーモブロックで30分間摂氏25度でチューブをインキュベートする。インキュベートは、水を含むマイクロ遠心分離管にサンプルを加えることによって1〜2個のRNaseフリー水で混合物を沈殿させた後、賦形剤を含ませ、mRNAとポリβアミノエステルの混合物と同じ体積に20ミリモルヒープおよび4%スクロース溶液を加え、ピペット処理によって混合した。ポリプレックス溶液をマイナス80度で1時間凍結した後の凍結乾燥のために、一次乾燥を行い、水分補給を避けるためにポリプレックスをマイナス20°Cですぐに保存します。ポリプレックス再懸濁液の場合、乾燥したナノ粒子をマイナス20°Cのフリーザーから取り出し、対応する量の深い水素化水を迅速に添加して固体を再分散させ、所望の濃度を達成した。ピペットは完全な再懸濁液まで穏やかに溶解し、ピペットは泡を積極的に避け、上下に上下に。蛍光顕微鏡による定性的評価のためのトランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされたヘラ細胞を含む96ウェルプレートを顕微鏡に載せ、目的の10倍を用いて可視化を開始する。まず、ホワイトバランスを適用してソフトウェアの背景参照を作成し、次に画像を取得して、解析中に画像を蛍光画像にオーバーレイします。顕微鏡モードを反射モードに変更し、フィルターホイールを青色レーザーに移動してEGFPを可視化します。その後、同じ露光時間を採用するすべての条件や井戸の画像を取得します。フローサイトメトリーによる定量評価のために、1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSを使用して96ウェルプレートでトランスフェクトされたヘラ細胞を洗浄します。1ウェルあたり25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、摂氏37度で5分間インキュベートした後。細胞が剥離したら、以前に回収された培地を添加してトリプシンを不活性化し、ウェルあたり10%ホルマリンの31.25マイクロリットルを加え、20分間インキュベートして細胞を固定します。次にフローサイトメーターとソフトウェアをオンにし、プレートサンプルのボリュームの種類や、サンプル間の揺れやすすいなどの他のパラメータを含む、実験に適した条件を設定します。最初に前方散乱光と側面散乱光の流量データを見て細胞を破片から区別することによって、正にトランスフェクションされた細胞の割合を定量化するための適切なパラメータを設定します。そして、振幅対高さをゲートと比較し、個々のセルを判別して、別の散布図をプロットします。トランスフェクションの1日前に、プレート10,000 JAWS II細胞を一晩インキュベーション用の96ウェルプレートでウェルした。翌日、ウェルあたり0.6マイクログラムのmRNAで細胞をトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素で乾燥空気インキュベーターでプレートを24時間インキュベートします。翌日、25マイクロリットルのPBSでウェルに残った細胞を洗浄する。25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、37°Cで5分間プレートをインキュベートして細胞を取り外します。以前に回収したメディアを対応する井戸に追加して、トリプシン反応を停止します。その後、プレートを遠心分離し、培地を吸引し、PBSあたり50マイクロリットル、ホルマリン2.5%を加えて20分間摂氏4度でプレートをインキュベートし、プレートを遠心分離機で固定します。その後、PBSの50マイクロリットルとウェルあたり3%BSAを追加し、4°Cで30分間インキュベーター。プレートを再びインキュベーション遠心分離した後、PBSに50マイクロリットルのマウスオボアルブミン抗体を加え、3%BSAとインキュベーターを摂氏4度で30分間加えます。遠心分離工程を繰り返し、その後、50マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、二次抗体を加え、摂氏4度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、遠心分離と洗浄の手順を繰り返します。次に、細胞と100マイクロリットルのPBSと2.5%ホルマリンを再懸濁して、フローサイトメトリー分析を行います。ナノ粒子を封入した新鮮で凍結乾燥したGFP mRNAの物理化学的特徴付けは、サイズおよびポリ分散度指数に有意な差を示さない。ポリプレックスの透過電子顕微鏡は、直径約50ナノメートルの球形およびモノ分散ナノ粒子の形成を確認します。GFPを封入するレゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルポリプレックス、またはオボアルブミンのカプセル化効率データは、mRNAの種類に応じて有意差を示さない。EGFP発現の定性的分析を、JAWS II細胞株における24時間の事後のトランザクションをここに示す。負のコントロールと定量的に比較した。パーセントGFP陽性細胞は、古典的なトランスフェクション試薬で行われる陽性対照と有意に高く、同等である。オボアルブミンmRNAはオリゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルナノ粒子を含み、非トランスフェクト細胞と比較してトランスフェクト細胞におけるCD11bおよびCD86膜マーカーの顕著に高い発現によって見られる樹状細胞を活性化することができる。活性原理としてのmRNAの使用に基づく当社のワクチン接種プラットフォーム、ならびに当社独自のポリマーは、予防および癌治療薬に使用されるように適応することができます。私たちは、がん免疫療法に貢献することを強調するために私たちの技術を使用することができます。ナノ粒子に腫瘍関連抗原をカプセル化し、がん治療を変えることができるから。

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