mRNAを含んだポリ(ベータアミノエステル)ナノ粒子のワクチン接種目的での合成と特性評価
2021年8月13日
ここでは、ポリ(βアミノエステル)ポリマーに基づいてmRNAナノ粒子を製造するための簡単なプロトコルが提示され、カプセル化されたmRNAを変更することによって容易に調整できる。また、ポリマー、ナノ粒子、およびそれらの インビトロ 必須の特徴を合成するためのワークフローも記載されている。予防接種に関する概念実証も追加されます。
このプロトコルは、ポリマーナノ粒子を調製する方法を示すため、重要であり、核酸を1つの簡単なステップでカプセル化した。この技術の主な利点は、汎用性であり、異なる核酸および細胞タイプに適用することができる。粒子調製のための簡単な手順の使用は、例えば上下のピペット、および凍結乾燥によってナノ粒子およびドラム条件の安定性を拡張する可能性。
この手順のデモンストレーションは、ローラ・オルモ、コーラル・ガルシア=フェルナンデス、マリア・スタンパ・ロペス=ピント、マリア・ナヴァロン=ロペス、私たちの研究室の博士課程の学生、マルタ・ディアス・カバジェロです。ポリプレックス形成の場合、以前に調製したポリマー、C6ペプチド、ポリβアミノエステル、およびボルテックス溶液を解凍する。ポリマーを上下に混合した後、酢酸ナトリウムに12.5ミリモル溶液を調製する。
溶液を渦に入れ、10分待ちます。次に、ミリリットル当たり0.5ミリグラムでmRNAを調製し、ピペット処理で混合する。ポリマー溶液を再びボルテックスし、ポリマー溶液中の遺伝物質溶液をマイクロ遠心管で1対1の比率で混合し、サーモブロックで30分間摂氏25度でチューブをインキュベートする。
インキュベートは、水を含むマイクロ遠心分離管にサンプルを加えることによって1〜2個のRNaseフリー水で混合物を沈殿させた後、賦形剤を含ませ、mRNAとポリβアミノエステルの混合物と同じ体積に20ミリモルヒープおよび4%スクロース溶液を加え、ピペット処理によって混合した。ポリプレックス溶液をマイナス80度で1時間凍結した後の凍結乾燥のために、一次乾燥を行い、水分補給を避けるためにポリプレックスをマイナス20°Cですぐに保存します。ポリプレックス再懸濁液の場合、乾燥したナノ粒子をマイナス20°Cのフリーザーから取り出し、対応する量の深い水素化水を迅速に添加して固体を再分散させ、所望の濃度を達成した。
ピペットは完全な再懸濁液まで穏やかに溶解し、ピペットは泡を積極的に避け、上下に上下に。蛍光顕微鏡による定性的評価のためのトランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされたヘラ細胞を含む96ウェルプレートを顕微鏡に載せ、目的の10倍を用いて可視化を開始する。まず、ホワイトバランスを適用してソフトウェアの背景参照を作成し、次に画像を取得して、解析中に画像を蛍光画像にオーバーレイします。
顕微鏡モードを反射モードに変更し、フィルターホイールを青色レーザーに移動してEGFPを可視化します。その後、同じ露光時間を採用するすべての条件や井戸の画像を取得します。フローサイトメトリーによる定量評価のために、1ウェルあたり100マイクロリットルのPBSを使用して96ウェルプレートでトランスフェクトされたヘラ細胞を洗浄します。
1ウェルあたり25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、摂氏37度で5分間インキュベートした後。細胞が剥離したら、以前に回収された培地を添加してトリプシンを不活性化し、ウェルあたり10%ホルマリンの31.25マイクロリットルを加え、20分間インキュベートして細胞を固定します。次にフローサイトメーターとソフトウェアをオンにし、プレートサンプルのボリュームの種類や、サンプル間の揺れやすすいなどの他のパラメータを含む、実験に適した条件を設定します。
最初に前方散乱光と側面散乱光の流量データを見て細胞を破片から区別することによって、正にトランスフェクションされた細胞の割合を定量化するための適切なパラメータを設定します。そして、振幅対高さをゲートと比較し、個々のセルを判別して、別の散布図をプロットします。トランスフェクションの1日前に、プレート10,000 JAWS II細胞を一晩インキュベーション用の96ウェルプレートでウェルした。
翌日、ウェルあたり0.6マイクログラムのmRNAで細胞をトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素で乾燥空気インキュベーターでプレートを24時間インキュベートします。翌日、25マイクロリットルのPBSでウェルに残った細胞を洗浄する。25マイクロリットルのトリプシンでPBSを吸引し、37°Cで5分間プレートをインキュベートして細胞を取り外します。
以前に回収したメディアを対応する井戸に追加して、トリプシン反応を停止します。その後、プレートを遠心分離し、培地を吸引し、PBSあたり50マイクロリットル、ホルマリン2.5%を加えて20分間摂氏4度でプレートをインキュベートし、プレートを遠心分離機で固定します。その後、PBSの50マイクロリットルとウェルあたり3%BSAを追加し、4°Cで30分間インキュベーター。
プレートを再びインキュベーション遠心分離した後、PBSに50マイクロリットルのマウスオボアルブミン抗体を加え、3%BSAとインキュベーターを摂氏4度で30分間加えます。遠心分離工程を繰り返し、その後、50マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、二次抗体を加え、摂氏4度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、遠心分離と洗浄の手順を繰り返します。次に、細胞と100マイクロリットルのPBSと2.5%ホルマリンを再懸濁して、フローサイトメトリー分析を行います。ナノ粒子を封入した新鮮で凍結乾燥したGFP mRNAの物理化学的特徴付けは、サイズおよびポリ分散度指数に有意な差を示さない。
ポリプレックスの透過電子顕微鏡は、直径約50ナノメートルの球形およびモノ分散ナノ粒子の形成を確認します。GFPを封入するレゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルポリプレックス、またはオボアルブミンのカプセル化効率データは、mRNAの種類に応じて有意差を示さない。EGFP発現の定性的分析を、JAWS II細胞株における24時間の事後のトランザクションをここに示す。
負のコントロールと定量的に比較した。パーセントGFP陽性細胞は、古典的なトランスフェクション試薬で行われる陽性対照と有意に高く、同等である。オボアルブミンmRNAはオリゴペプチドおよび修飾ポリβアミノエステルナノ粒子を含み、非トランスフェクト細胞と比較してトランスフェクト細胞におけるCD11bおよびCD86膜マーカーの顕著に高い発現によって見られる樹状細胞を活性化することができる。
活性原理としてのmRNAの使用に基づく当社のワクチン接種プラットフォーム、ならびに当社独自のポリマーは、予防および癌治療薬に使用されるように適応することができます。私たちは、がん免疫療法に貢献することを強調するために私たちの技術を使用することができます。ナノ粒子に腫瘍関連抗原をカプセル化し、がん治療を変えることができるから。
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概要
この記事では、ポリ（ベータアミノエステル）ポリマーを使用してmRNAナノ粒子を生成するためのプロトコルを紹介します。この方法は汎用性が高く、様々な核酸のカプセル化を可能にし、簡単な調製技術に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学分野
- ナノ粒子合成
- mRNA送達システム
- ポリマー材料
背景
- ポリマーナノ粒子は核酸をカプセル化できます。
- この技術は、カプセル化されたmRNAを変更することで容易に修正できます。
- 簡単な手順は研究者のアクセシビリティを向上させます。
- 凍結乾燥はナノ粒子の安定性を延長できます。
研究目的
- ポリマーナノ粒子を調製する簡単な方法を示す。
- 異なる核酸と細胞タイプにわたる技術の汎用性を紹介する。
- 免疫化アプリケーションの概念実証を提供する。
使用方法
- ポリ（ベータアミノエステル）ポリマーの調製。
- mRNAのナノ粒子へのカプセル化。
- ナノ粒子のインビトロ特性評価。
- 研究者による手順の実演。
主な結果
- このプロトコルはポリプレックスの効果的な形成を可能にします。
- 単純なピペッティング技術で粒子調製が十分です。
- 凍結乾燥によるナノ粒子の安定性の実証。
- 一段階で核酸のカプセル化に成功。
結論
- この方法はmRNAナノ粒子の調製を簡素化します。
- 様々な核酸に適用可能な汎用的なアプローチを提供します。
- この結果は免疫化戦略へのさらなる研究を支持します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables the rapid formulation of mRNA-loaded polymeric nanoparticles for vaccine development, addressing the instability and rapid clearance of naked mRNA. The versatility of poly(beta aminoester) polymers allows encapsulation of diverse nucleic acids, supporting both prophylactic and therapeutic applications. Lyophilization enhances storage stability, reducing distribution costs and enabling scalable manufacturing for oncology and infectious disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering mRNA encoding tumor-associated antigens or immunomodulatory proteins.
- Operational Value: Supports functional target validation through efficient transfection of dendritic cells, demonstrated by upregulation of CD11b and CD86 markers.
- Predictive Value: Provides quantitative transfection data via flow cytometry to assess antigen expression and immune activation, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible nanoparticle formulations with consistent size (~50 nm) and polydispersity, confirmed by physicochemical characterization and TEM.
- Operational Value: Uses simple pipetting and vortexing steps, enabling high-throughput preparation and lyophilization for long-term storage.
- Assay Readiness: Produces mRNA-loaded nanoparticles capable of transfecting HEK293 and JAWS II cells, supporting standardized immunoassay development.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical by enabling mRNA delivery that activates dendritic cells, a key step in cancer immunotherapy and vaccine efficacy.
- Disease-Relevant System: Demonstrates applicability to ovalbumin mRNA, a model antigen, supporting adaptation to tumor-associated antigens for cancer vaccinology.
- Risk Mitigation: Lyophilized nanoparticles show no significant change in size or PDI, ensuring batch consistency and reducing formulation-related failure risk.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling mRNA-based antigen delivery for immune activation studies prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by delivering mRNA encoding antigens or cytokines to assess immune cell activation in vitro.
- Screening: Delivers standardized, lyophilizable nanoparticles for reproducible transfection across cell types, supporting assay scalability.
- Analytics: Provides flow cytometry readouts for % GFP+ cells and marker expression (CD11b, CD86), enabling quantitative comparison of formulation efficacy.
- Translational Research: Supports continuity from in vitro dendritic cell activation to preclinical immune response modeling, particularly in cancer vaccine development.
- Enterprise Reuse: Platform adaptability to various mRNAs (e.g., GFP, ovalbumin, tumor antigens) allows reuse across multiple projects without reformulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mRNA delivery by providing a characterized, stable nanoparticle system with proven transfection efficiency.
- Operational Value: Simple preparation (pipetting, vortexing) and lyophilization enhance lab-to-lab reproducibility and reduce technical variability.
- Strategic Value: Enables rapid prototyping of mRNA vaccines, accelerating go/no-go decisions and reducing investment in ineffective candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating early efficacy data on antigen expression and dendritic cell maturation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, nanoparticle formulation, and flow cytometry.
- Needs access to vortexers, thermoblocks, lyophilizers, fluorescence microscopes, and flow cytometers.
- Standardization across teams requires consistent polymer:mRNA ratios and incubation conditions (25°C for 30 min).
- Adaptation to different mRNAs may require optimization of concentration and incubation time, though encapsulation efficiency remains consistent across transcripts.
- Lyophilization protocol includes freezing at -80°C, primary drying, and storage at -20°C to prevent rehydration and maintain nanoparticle integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Polyplexes Formation, Lyophilization, and Resuspension
2:44
In Vitro Characterization
4:34
In Vitro Functionality Tests: Capacity to Activate Model Immune Cells by Using Ovalbumin as Antigenic Model mRNA
6:24
Results: Nanoparticle Synthesis and Physicochemical Characterization, mRNA Encapsulation Efficiency, and In Vitro Results
7:45
Conclusion
