Name: シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学ぶシロイヌナズナ種子の高スループット表面滅菌法。真空ポンプを用いた吸引装置で1日に数百サンプルを処理でき、機能的ゲノミクス研究の効率を大幅に向上させる堅牢なプロトコルです。

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この研究は、フォンダツィオーネ・E・マッハのエコゲノミクス・グループのコア・ファンドを通じてトレント自治州から資金提供を受けた。

1. 試薬および媒体調製
<ol><li>70%エタノール溶液を調製:蒸留水263mLに95%のテクニカルエタノールの737 mLを加えます。よく混ぜます。 注:無菌の作業台に70%エタノール溶液を準備してください。 注意:エタノールは非常に可燃性であり、目に深刻な刺激を引き起こす可能性があります。炎や熱源から遠ざけてください。目に触れた場合は、豊富な水ですすいでください。</li>
	<li>5%漂白液を調製する:家庭用漂白剤5mL(次亜塩素酸ナトリウム、NaClOの約3.5%を含む)を95mLの滅菌蒸留水に加えます。非イオン性洗剤(例えば、Tween 20)を数滴加え、十分に混ぜます。 注:ラミナーフードの中に5%の漂白剤溶液を準備してください。 注意:漂白剤の活性成分である次亜塩素酸ナトリウムは、非常に刺激性が高い。それは非常に腐食性であり、胃腸管に深刻な損傷を引き起こす可能性があります。接触した場合は、すぐに豊富な水ですすいでください。摂取の場合は、毒物管理センターまたは医師に相談して治療のアドバイスを受けてください。</li>
	<li>ハーフストレングスムラシゲとスクーグ(1/2 MS)培地26を準備します。<ol>
<li>蒸留水800mLにMS培地パウダー2.2g(ビタミンを含む)と10gのスクロースを加えます。1 M KOH を使用して溶液の pH を調整し、蒸留水を使用して 1 L までの体積を持って下さい。アリコート500mLを1Lボトルに入れ、4gの寒天を加えて固体培地を調製する。ソリューションをオートクレーブします。</li>
		<li>オートクレーブした後、水浴で媒体を50〜53°Cに冷却し、層流フードの下のペトリ皿に注ぎます。選択培地を調製するには、50mg/mLカナマイシンストック溶液の1000μL/Lを加える(蒸留水10mLに500mgのカナマイシン硫酸一水和物を混ぜ、フィルター滅菌して-20°Cで保存する)培地(50-53°C)に入れる。渦巻いてよく混ぜ、前に述べたようにペトリ料理に注ぎます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 吸引器のセットアップ
メモ: 計測器のセットアップは 図 1に要約されています。
<ol><li>真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレン(PE)チューブの一端に接続します。チューブのもう一方の端を、デカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。チューブの接合部を密閉フィルム(材料表)でしっかりと包み込み、気密接続を確保します。</li>
	<li>2番目のPEチューブをデカンテーションボトルのスクリューキャップの入口(ボトルの内側に突き出た穴)に接続します。チューブの反対側を水槽バルブの出口に合わせます。必要に応じて、接合部に沿ってシールフィルムで包み、空気漏れを除去します。</li>
	<li>使用直前に、薄層流れフードの下の水槽フィルターの入口に滅菌200 μLピペットチップを取り付けます。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62893/62893fig01.jpg"> 図1:滅菌液の高スループット除去用吸引装置の模式図。わかりやすくするために、単一の部品はスケールに描画されません。レター(A)は真空ポンプ、(B)リザーバーボトルが液体(エタノール、漂白剤、滅菌水)を集め、液体の還流を避けるバルブ、滅菌200μLピペットチップ、および(E)種子および滅菌液を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブを示す。矢印は、気流の方向を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62893/62893fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
種子の3スループットの高い液体表面滅菌
注:全体的な手順と 96 独立したサンプルを持つヒリン野生型(Col-0)(シロイヌナズナシス)種子の表面滅菌に必要な最小の時間を 図2にまとめます。
<ol><li>永久的なマーカーの48 x 1.5 mLのマイクロ遠心分離管の2つのバッチが進歩的な数とラベル。</li>
	<li>96個の無菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブ(チューブの円錐端の底面から約1〜2mm)のそれぞれに100-200シビジ種子を加えます。</li>
	<li>アリコート 70% エタノールの約 1000 μL を各チューブに 10 mL の滅菌血清学的ピペットを使用して、ラミナーフローフード (シード バッチ 1,48 チューブ) を使用し、慎重に蓋を閉じます。 注:分配された容積が種子の量の数倍高い限り、ソリューションを分配することは非常に正確である必要はありません。あるいは、このステップを層状フードの外側(非滅菌状態)で行う。</li>
	<li>シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。</li>
	<li>シェーカーからアダプターを取り外し、ベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。</li>
	<li>パルス関数(ほとんどのベンチトップ遠心分離機に存在する)を使用して種子を素早くスピンダウンし、1880 x g(〜15 s)に達します。 注: 長い時間またはそれ以上の遠心力は、種子の発芽に悪影響を与えます。</li>
	<li>アダプターから 48 個のチューブを 1 つのラックに移し、すべてのチューブを層流フードの下に開きます。チューブに取り付けられる蓋の部分に触れないでください。蓋が互いに近すぎる場合は、チューブを2つのラックに分割して取り扱いが容易にします。</li>
	<li>滅菌200 μL黄色の先端を、ラミナーフローフードの下の自家製アスピレーターのアクアリウムバルブ入口に取り付け、ポンプのスイッチを入れます。</li>
	<li>黄色の先端を種子のレベルのすぐ上に挿入して、液体を吸うときに種子に触れないようにします。または、先端をチューブの下部に素早く配置します。種子が液体の吸引をブロックする場合は、黄色の先端を排除し、新しいものを挿入します。</li>
	<li>アリコートは、層流フード内の10 mL滅菌血清学的ピペットを使用して、5%漂白剤の約1000 μLの各チューブに入る。</li>
	<li>すべての蓋をしっかりと閉じ、すべてのチューブをシェーカーアダプターに戻します。シェーカーで少なくとも3分間、8.0 Hzの振動周波数でチューブを振ります。</li>
	<li>1880 x g (~15 s) に達するために必要な時間のベンチトップ遠心分離機のパルス関数を使用して、種子を素早くスピンダウンします。</li>
	<li>新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプをスイッチします。</li>
	<li>漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に黄色の先端を挿入します。</li>
	<li>アリコートは、層流フード内の10 mLの無菌血清ピペットを使用して、1000 μLの殺菌されたH2Oの周りに各チューブに入る。 注: 2 つのシード バッチを組み合わせて、操作時間を最小限に抑えます。</li>
	<li>新しい滅菌200 μL黄色の先端を、層流フードの下の真空ポンプに接続された水槽バルブに取り付け、ポンプのスイッチを入れます。</li>
	<li>H2 Oを吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上に黄色の先端を挿入します。</li>
	<li>アリコートは、10 mLの滅菌血清学的ピペットを使用して、滅菌されたH2Oの約500 μLの各チューブに入り、層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができています。必要に応じて、チューブを室温で数時間、または一晩4 °Cに保ちます。</li>
	<li>十分な量の水で液体を収集するために使用される貯水池のボトルを充填し、それをオートクレーブ。その後、液体を通常のシンクに捨てます。 注:リザーバ内のすべての種子を殺すために液体をオートクレーブ。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62893/62893fig02.jpg"> 図2:96個の独立サンプルを用いたシロイヌナズナ種子の表面滅菌に必要な手順と最小時間の概要。 提示された実験では、96個の独立したサンプルが2つの等しいサイズのバッチで処理されます。手順全体は両方のバッチで同じで、並列処理されますが、バッチ 2 はバッチ 1 と比較して 1 ステップの遅延で処理されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62893/62893fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. 1/2 MSプレート上のシロイヌナズナのめっきとスコアリング
<ol><li>種子と300-400 μLの滅菌H2Oをペトリ皿に移し、1000 μLピペットで優しくピペットを入れます。</li>
	<li>10本のチューブを移管した後、抗生物質なしで溶かした1/2 MS培地の1.5〜2.0 mLの周りに各プレートに注ぎます。 注:固まりを避けるために、予め溶融し、その後、50〜53°Cに設定されたサーモスタットバスに1/2 MS溶融培地を保ちます。種子の発芽性を低下させないために、温度が58°Cを超えないようにしてください。</li>
	<li>すぐにプレートを旋回して、その中に種子を分配します。反対側のプレートをテープで貼ります。</li>
	<li>プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫(4°C)に入れて均一な発芽を得ます。</li>
	<li>100-120 μmol·m-2·s-1 と60%相対湿度の光強度で長い日の条件(16時間光/8時間暗)の下で23°Cに設定された成長チャンバーにプレートを移します。</li>
	<li>2日後、ラジクルの存在によって植物をスコア付けします。ラジクルの出現と緑色のコチルドン形成(2つのコチルドンの完全な開口部)を検出して、種子の発芽を評価します。</li>
</ol>5. 統計分析
注:ここでは、Tukeyの対次検定を統計的分析に使用しました。
<ol><li>0.01 未満の P 値は統計的に有意であると考えてください。少なくとも5つの生物学的複製ですべての実験を行う。</li>
</ol>

<ol><li>Somerville, C., Koornneef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fortunate+choice%3A+The+history+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).</li>
<li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).</li>
<li>Initiative, T. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
<li>Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+as+an+insertional+mutagen+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).</li>
<li>Speulman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-component+enhancer-inhibitor+transposon+mutagenesis+system+for+functional+analysis+of+the+arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome.</a> Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).</li>
<li>Jander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylmethanesulfonate+saturation+mutagenesis+in+Arabidopsis+to+determine+frequency+of+herbicide+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance.</a> Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Togninalli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AraPheno+and+the+AraGWAS+catalog+2020%3A+A+major+database+update+including+RNA-Seq+and+knock-out+mutation+data+for+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).</li>
<li>Lan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AtMAD%3A+Arabidopsis+thaliana+multi-omics+association+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database.</a> Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).</li>
<li>Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+isoprene+synthase+affects+ABA-and+drought-related+gene+expression+and+enhances+tolerance+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).</li>
<li>Czarnecki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+knock-down+of+six+non-family+genes+using+a+single+synthetic+RNAi+fragment+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-efficiency+genome+editing+in+arabidopsis+using+YAO+promoter-driven+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system.</a> Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).</li>
<li>Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+deletion+of+floral+development+genes+in+Arabidopsis+with+CRISPR%2FCas9+using+the+RNA+endoribonuclease+Csy4+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.</a> Horticulture Research. 6 (1), (2019).</li>
<li>Grefen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+and+in+vivo+interactions+of+the+Arabidopsis+thaliana+ethylene+receptor+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members.</a> Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).</li>
<li>Gazzani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+MIR168+paralogs+in+Brassicaceae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae.</a> BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).</li>
<li>Lee, S., Korban, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+Arabidopsis+thaliana+phytochelatin+synthase+%28AtPCS1%29+by+cadmium+during+early+stages+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development.</a> Planta. 215 (4), 689-693 (2002).</li>
<li>Long, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+FRET-FLIM+reveals+cell-type-specific+protein+interactions+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots.</a> Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).</li>
<li>Freire-Rios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+DNA+elements+mediating+ARF+transcription+factor+binding+and+auxin-responsive+gene+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+arabidopsis+plants%3A+Growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+and+salt+stress+tolerance+of+an+arabidopsis+glutathione+S-transferase+U17+knock-out+mutant+are+attributed+to+the+combined+effect+of+glutathione+and+abscisic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.</a> Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).</li>
<li>Li, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+a+large+dataset+indicates+that+internal+transcribed+spacer+%28ITS%29+should+be+incorporated+into+the+core+barcode+for+seed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).</li>
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<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+recapitulation+of+isoprene+synthase+evolution+from+ocimene+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases.</a> Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).</li>
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</ol>

すべての著者は利益相反を宣言しません。

種子の滅菌は、シロイヌナズナの機能研究の基本的なステップです。多くの異なる目的のために頻繁に行われますが、シロイヌズナでのハイスループット種子表面滅菌に関する限定的な研究が可能です。
これまで、最も高いスループットを有する方法の1つは、漂白剤と濃縮HClを混合して発生した塩素ガスを用いることで行なわれた。この方法は、限られた実務時間を必要としますが、それは人間に非常に有毒なガスを使用します27.また、表面滅菌する種子の数と表面種子滅菌の持続時間を慎重に制御する必要があります。種子が多すぎると、塩素ガスの投与量が種子コートに存在する微生物を完全に殺すには十分ではなく、種子バッチの広範な汚染をもたらす。一方、表面滅菌の持続時間が長すぎると、種子が殺されます。したがって、いくつかの利点にもかかわらず、燻蒸はシロイヌズナでの種子表面滅菌のための好みの方法ではない。
対照的に、28、29、30<sup class="xr...

シロイヌナズナは、ブラッシカ科に属する二分植物種です。その比較的短いライフサイクル(長い日の成長条件下で一世代あたり2ヶ月)、小さな植物のサイズ、および植物ごとに何百もの種子の生産と自己受粉は、それを最初の基本的な植物モデル種1、2にしました。さらに、そのゲノムは完全に配列3であり、広範な逆遺伝学ツール(飽和T-DNA、トランスポゾン、および化学的変異体化された集団)が利用可能である4、5、6、および効果的なアグロバクテリウム媒介変換は、さらに下流作業のための十分なトランスジェニックラインを得るために十分確立されている7 .したがって、過去20年間に、自然、遺伝的、表現型のバリエーション8、9を含む分子レベルで植物生物学の多様な側面を解剖するためのモデル種としてシロイヌナズナシスを使用して大きな進歩が達成されました。
シロイヌナズナの目的の遺伝子を機能的に特徴付けるためには、種子表面滅菌は、無菌培養を必要とする多くの下流プロトコルの前提条件となる真菌および細菌汚染物質を排除する。過剰発現10に対する遺伝的形質転換は、ノックダウン(RNA-I11)またはノックアウト(ゲノム編集12、13)の遺伝子機能、細胞内局在化14、プロモーター活性15、16、タンパク質タンパク質17およびタンパク質-DNA相互作用18の、最も一般的な用途のみを引用し、すべて種子表面滅菌工程を必要とする。したがって、その相対的な単純さにもかかわらず、種子表面滅菌は、多くの機能解析において基本的な役割を果たす。
これまで、2つの主要なカテゴリーの種子表面滅菌方法が、気相滅菌法または液相滅菌法19に基づいて開発されてきた。ガス相シード表面滅菌のスループットは中~高であるが、有害試薬塩素ガスを表面殺菌剤として用いることは、その広い用途を妨げている。逆に液相殺菌に基づく方法は、表面殺菌のためにエタノールや漂白剤溶液のような穏やかな化学物質に依存しており、塩素燻蒸よりも本質的に低い効率を有するにもかかわらず、より広く使用されています。一般に、液体試薬を用いる2つの異なる方法が一般的に使用されている。1つの主に使用される方法は、時間20、21の異なる期間の異なる濃度でエタノールと漂白剤で洗浄に基づいている。別の方法は、漂白剤のみの21、22の適用に基づいています。どちらの方法も主に小規模な種子表面滅菌に適用されます。しかしながら、多くの実験において、1つの変換15、23、または画面から得られる多くのシロイヌナズナのトランスジェニックラインを、異なる変換24,25から生成される多くのトランスジェニックラインを並行してスクリーニングする必要がある。我々の知る限りでは、高スループット種子表面滅菌のための液体ベースの方法は公開されておらず、これはほとんど認識されていないが、機能的ゲノミクスのアプローチのための重要なボトルネックである。したがって、種子表面滅菌のための安全で堅牢で高スループットな方法を開発することは、一度に多くの遺伝子の機能的特性評価の成功に向けて必要かつ重要なステップです。
この目的のために、現在の研究では、シロイヌナズナの種子の表面滅菌のための改善された方法が提示される。この方法は安全で、低コストで、非常に堅牢で、高スループットで、種表面滅菌の初めからペトリ皿の種子播種の終わりまで1時間以内に96本の独立したラインを取り扱うことを可能にします。この方法は、真空ポンプ、消耗品、プラスチック製品などの広く利用可能な基本的な実験室機器に依存しています。この改良された方法は、シロイヌナプシスおよび他の非モデル植物種における近代的な機能的ゲノミクスアプローチに十分なスループットを備えた種子表面滅菌を合理化するための安全でシンプルで手頃な価格のアプローチを科学界に提供する。

<table><tbody><tr><td>アクアリウムバルブ</td><td>Amazon</td><td>B074CYC5SD</td><td>2つのバルブと薄肉チューブを含むキット。バルブは、液体が無菌チップに戻るのを防ぎます</td></tr><tr><td>シロイヌナズナ Col-0 野生型種子</td><td>ノッティンガムシロイヌナズナストックセンター</td><td>N1093</td><td>野生型種子(カナマイシンに感受性)</td></tr><tr><td>シロイヌナズナトランスジェニックライン AdoIspS-79種子</td><td>NA</td><td></td> NA <td>トランスジェニックライン アルンド・ドナックスからのイソプレン合成酵素遺伝子を過剰発現し、Col-0バックグラウンドで変換され、カナマイシンに耐性があります (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34、2583&ndash;著者からのリクエストに応じて入手可能</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離</td>機 <td>エッペンドルフ</td><td>EP022628188</td> 種子のスピン<td>ダウンに使用される卓上微量遠心分離機</td></tr> ム<tr><td>ラシゲ&ビタミンを含むSkoog</td>媒体 <td>Duchefa</td><td>M0222</td><td>植物無菌培養のための標準培地</td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td>ブランド</td><td>26300</td><td>血清ピペットの操作に使用</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ 1</td><td>Roth</td><td>9591.1</td><td>真空ポンプからデカンテーションボトルへの接続用チューブ(内径:7mm、外径:9mm)</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ 2</td><td>Roth</td><td>9587.1</td><td>デカンテーションボトルから水槽用バルブへの接続用チューブ&nbsp;(内径:5mm、外径:7mm)</td></tr><tr><td>コネクタ付きスクリューキャップ</td><td>Roth</td><td>PY86.1</td><td>2ウェイディスペンサー スクリューキャップ GL45 ポリプロピレン製 デカンティングボトル用</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット</td><td>ブランド</td><td>27823</td><td>目盛り付きガラス(再利用可能)セロロジカルピペット。使い捨てピペットは</td></tr><tr><td>、Shakeret alの代わりに使用できます。</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>TissueLyser IIビーズミルは、通常、組織の均質化に使用されます。チューブにビーズを追加しなくても、シェーカーとして機能します。</td></tr><tr><td>テクニカルエタノール</td><td>ITW試薬(Nova Chimica Srl)</td><td>212800</td>エ<td>タノール96%v / v部分的に変性した技術グレード</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>メルクミリポア</td><td>655205</td>界<td>面活性剤として機能する非イオン性洗剤</td></tr>ユニバーサル<tr><td>チューブコネクタ</td><td>Roth</td><td>Y523.1</td>チューブ<td>接続の改善/簡素化に使用できます</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>メルクミリポア</td><td>WP6222050</td><td>に使用されます吸引装置を作る</td></tr></tbody></table>

シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

シロイヌナズナは、機能研究に最も広く使用されている植物モデル種です。シロイヌナズナの種子の表面滅菌は、この目的に向かって必要とされる基本的なステップです。したがって、数十~数百個のサンプル(トランスジェニックライン、エコタイプ、または変異体)を一度に処理するハイスループットシロイヌナズナシス種子表面滅菌法を確立することが最も重要です。一般的な真空ポンプから構築された自家製の吸引装置を用いたチューブ内の液体の効率的な除去に基づく種子表面滅菌法を本研究で紹介する。この方法で、1日に数百個のサンプルを処理することで、労働集約的なハンズオン時間を劇的に短縮することで、少しの労力で可能になります。シリーズタイムコース分析は、高い発芽率を維持することにより、表面滅菌の非常に柔軟な時間範囲をさらに示しました。この方法は、種子サイズに応じて吸引装置の簡単なカスタマイズ、および液体を排除するために望まれる速度で、他の種類の小さな種子の表面滅菌に容易に適応することができる。

種子滅菌手順全体に要する時間を評価するために、現在のプロトコルにおける液体処理96サンプルの時間差を計算し、従来のピペット法と比較した。この結果は、現在のプロトコルが時間を節約し、従来のプロトコルで液体処理時間をその 4 分の 1 に短縮することを示しています (表 1)。この表はさらに、現在のプロトコルの液体除去時間は、従来の方法よりも多くの時間を節約し、全体的に8倍の削減を行うことを強調しています。
種子滅菌の時間範囲の選択 長い殺菌ステップは汚染率を最小にするが、種子の発芽に悪影響を及ぼす可能性がある。汚染のない発芽率が最も高い種子滅菌の最良の時間範囲を決定するために、各滅菌ステップの異なる持続時間を試験し、種子発芽率と緑色コチルドン出現率の両方を評価した。2日目から4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノール滅菌の10分から40分までの時間範囲に有意な差は示さなかった。しかし、70%エタノールによる処理の40分から、発芽率は低下した(図3)。</st...

シロイヌズナ(シロイヌズナ)種子の表面滅菌のためのハイスループットプロトコルが提供され、真空ポンプで構成された簡単な吸引装置で液体処理ステップを最適化する。何百もの種子サンプルを1日で表面滅菌することができます。

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

このプロトコルは、モデル種シロイヌズナの機能的ゲノミクスにおける種子表面滅菌を改善する。この技術の主な利点は、1 日あたり数百サンプルの処理を可能にする、容易さと高スループットです。いくつかの簡単な変更を加えれば、この方法は他の多くのモデルや非モデルの植物種に適用できます。初めてのユーザーのために、彼らは両方の種子生存に不可欠であるとして、媒体の温度と遠心速度に注意してください。まず、蒸留水に95%の工業用エタノールを加え、十分に混合して70%エタノールを調製します。次に、95ミリリットルの滅菌蒸留水に家庭用漂白剤5ミリリットルを加えて5%漂白液を調製する。その後、漂白剤溶液に数滴の非イオン性洗剤を加え、十分に混ぜます。次に、ビタミンを含むMS培地粉末2.2グラムと800ミリリットルの蒸留水に10グラムのスクロースを加えて、半強度のムラシゲとスクーグ培地を調製します。水酸化カリウムのモル1個を用いて培地のpHを5.7に調整し、蒸留水を使用して体積を1リットルまで上げる。アリコート500ミリリットルの培地を1リットルのボトルに入れ、4グラムの寒天を加えて固体培地を調製する。オートクレーブした後、水浴で50〜53度まで冷却します。その後、層流フードの下にペトリ料理にそれを注ぎます。選択培地を調製するには、培地にカナマイシンを加え、先に示したようにペトリ皿に注ぎます。吸引器を設置するには、真空ポンプの入口を適当なサイズのポリエチレンチューブの一端に接続します。次に、チューブのもう一方の端をデカンテーションボトルの双方向蓋の出口に接続します。チューブの接合部を密閉フィルムでしっかりと包み込み、気密性を確保します。次に、デカンテーションボトルのスクリューキャップの入口に2番目のポリエチレンチューブを接続します。次に、薄いポリエチレンチューブを取り付けた水槽弁の出口にチューブの反対側を接続します。必要に応じて、シールフィルムで接合部を包み込んで、空気漏れを除去します。プログレッシブ番号を持つ48個の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブの2つのバッチにラベルを付けた後、96個の無菌マイクロ遠心チューブのそれぞれに100〜200のシロイヌナズナの種子を加え、チューブの円錐端の底から約1〜2ミリメートル上に追加します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを使用し、各チューブに70%エタノールの約1ミリリットルを加え、慎重に蓋を閉じます。シェーカーで8ヘルツの振動周波数で3分間チューブを振ります。次に、シェーカーからアダプターを取り外し、パルス機能を使用して種子を回転させるベンチトップマイクロ遠心分離機のバスケットに移します。チューブをラックに移した後、ラミナーフローフードの下のすべてのチューブを開きます。汚染を避けるためにチューブに取り付ける蓋の部分に触れないでください。次に、ラミナーフローフードの下に、無菌200マイクロリットルイエローチップを自家製アスピレーターの水槽用バルブ入口に装着し、ポンプをオンにします。液体を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。次に、10ミリリットルの滅菌血清学的ピペットを用いて、各チューブに5%漂白液の1ミリリットルをアリコートする。ふたを閉じてから、チューブをシェーカー アダプターに戻し、前に示したようにチューブを振ります。ベンチトップ遠心分離機のパルス機能を使用して種子を回転させた後、新しい無菌200マイクロリットルイエローチップを水槽バルブに取り付け、ポンプをオンにします。漂白剤溶液を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルの上に先端を挿入します。次に、10ミリリットルの無菌血清ピペットを用いて、各チューブに1ミリリットルの滅菌水をアリコートする。水槽弁に新しい滅菌200マイクロリットル黄色の先端を取り付けた後、ポンプのスイッチを入れる。水を吸うときに種子に触れないように、種子のレベルのすぐ上にチップを挿入します。最後に、各チューブに殺菌水のアリコート500マイクロリットル、および層流フード内のすべての蓋を閉じる。種をまく準備ができました。必要に応じて、チューブを室温で数時間または一晩で摂氏4度に保ちます。1ミリリットルのピペットを使用して、300〜400マイクロリットルの無菌水で種子をペトリ皿に移します。10本のチューブを移管した後、1.5~2ミリリットルの溶融半強度のムラシゲとスクーグ培地を各プレートに、抗生物質を入れずに注ぎます。素早くプレートを旋回して種を分配し、反対側にプレートをテープで貼ります。プレートをプラスチックまたはアルミホイルで包み、暗闇の中で3日間冷蔵庫に入れて均一な発芽を得ます。2日目、3日目、4日目、7日目に行われた発芽分析では、70%エタノールによる10~40分の殺菌時間の間に有意な差は示さなかった。しかし、殺菌時間が40分を超えると、発芽率は低下した。これに対応して、緑色のコチルドン出現率も低下した。研究に基づき、70%エタノールに対して3分間、5%漂白剤に対して3分間、種子を殺菌する最小時間として選択した。もともと使用されていた種子が微生物で汚染されていることを実証するために、非無菌種子をプレートに直接播種した。無菌種子と比較して、非無菌種子は、7日間の発芽後にプレート全体に広がる2日後に真菌の出現を示した。異なる種子サンプルを処理するために単一の滅菌ピペットチップを使用して行われた交差汚染アッセイは、カナマイシンを用いたプレートに播種されたコロンビア-0遺伝子型種子では緑色のコチルドンが観察されなかったことを示した。並行して、コロンビア-0種子ではカナマイシンなしでプレートに播種され、すべてのコチルドンは発芽後に緑色に見えた。これらの結果は、滅菌溶液を除去するために単一のピペット先端を使用したにもかかわらず、サンプル間の汚染の持ち越しを示さない。この手順は、遺伝子過剰発現、ゲノム編集、細胞内局在化、プロモーター活性、タンパク質とタンパク質-DNA相互作用などの他の多くの機能性ゲノミクス法の基礎となる。

high-throughput-robust-highly-time-flexible-method-for-surface

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。...

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する...

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

私たちは、 シロイヌナズナの種子から種皮寝具アッセイ（SCBA）を構築する手順を紹介します。 SCBAは、遺伝的およびin vitroで探索する強力なツールであることが示されたか休眠種子中の光の合図に応答して、胚乳を制御し種子の発芽。 SCBAは胚乳が胚の成長に影響を与えることが疑われるあらゆる状況下で適用可能な原則です。...

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

本研究の目的は、漂白剤や塩素ガス滅菌滅菌メディア上に成長した範囲のシロイヌナズナ遺伝子型の種子発芽の効果を決定するためだった。最適化された殺菌のプロトコルは、満足のいく種子の生存を提供しながら汚染微生物の増殖を防ぐために開発されています。...

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

測定し、特に根や芽、植物に細菌の付着を特徴付けるのための簡単な方法は、この資料に記載されています。...

植物実験室で測定した表面への細菌の付着

単純な汎用性、および低コストの in vitro水耕システムが正常に最適化されて、無菌条件下で大規模な実験を有効にします。このシステム...

無菌状態で小さな分子に対する植物の反応を評価するための柔軟な低コスト化の養液栽培システム

ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。...

浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq...

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

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植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

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シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

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シロイヌナズナ種子の表面滅菌のための高スループット、堅牢で高い時間融性の高い方法

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