組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

それは異なる病理または処置で影響を受けることができるミトコンドリア基質フラックスをテストするので。例えば、今日はメトホルミン治療に対する癌細胞応答を明らかにするためにそれを使用します。それは十分な複製および各異なる材料のための適切な制御を有する間、細胞の最小数を必要とする。

分析器は研究用です。この技術は、ミトコンドリア代謝のエラーを識別することができ、ミトコンドリアに影響を与える戦士の薬物を評価するために使用することができます.手順を実証するカロリーナ・ヴァネコワは、私の研究室の学部生と研究技術者です。

A549細胞を列内のウェルあたり20,000個の密度で、2〜11のタツノオトシゴXF 96細胞培養マイクロプレートで開始する。列 1 と 12 を背景ウェルとして空のままにします。ブランクウェルに同量の細胞培養培地を充填し、加湿インキュベーターでセルを5%の二酸化炭素で培養します。

3~4時間後、ウェルズに100マイクロリットルの細胞培養培地を加える。実験群列7~11を1ミリモルメトホルミンで、対照群を等量の滅菌蒸留水で処理し、プレートをインキュベーターに戻します。センサーを水分補給するために、ユーティリティプレートにウェルあたり滅菌水のピペット200マイクロリットル。

その後、センサーを水中に浸しながら、センサーカートリッジを慎重に返却します。カートリッジを次の日まで摂氏37度で炭酸ガスフリーインキュベーターにインキュベートします。アナライザと制御装置のスイッチをオンにします。

計測器制御およびデータ取得ソフトウェアを起動し、テキスト原稿に記載されているようにアッセイプロトコルを設計します。グループ定義の下で、ポートAが注入された基板に応じて異なる4つの注入戦略を作成し、基板または略称の後に戦略を挙げてください。ポート D.Create にポート C とロテノーン アンティマイシン A の混合ポートにオリゴマイシンを割り当て、プレート マップの下で 8 つのグループに名前を付け、対応するウェルにグループを割り当てます。

次に、プロトコルをテンプレートを使用する準備として保存します。温度が一晩安定するように、アナライザのスイッチをオンのままにします。翌日、ユーティリティプレートから水を捨て、ユーティリティプレートにウェルごとに200マイクロリットルの事前温めキャリブラントを追加します。

測定時までカートリッジを二酸化炭素フリーインキュベーターに戻します。インキュベーター内の湿度の源を維持し、キャリブラントの急速な蒸発を避けるために、ファン速度を最小限にオフまたは減らします。テキスト原稿に記載されているように、ミトコンドリアアッセイ溶液、5%BSAおよび滅菌水を2回事前に加温した基質および阻害剤の働く溶液の5ミリリットルを調製する。

次に、税務原稿に記載されているように、注射器ポートに基質および阻害剤をロードする。[実行アッセイ]タブでキャリブレーションを行う場合は、開始実行をクリックしてアッセイを開始します。装填された検閲カートリッジを挿入し、キャリブレーションが完了するのを待ちます。

20ミリリットルのアッセイ培地を調製し、ミトコンドリアアッセイ溶液、滅菌水、5%BSAを50ミリリットルチューブに混合します。10マイクロモル組換えパーフリンゴライシンOの2マイクロリットルを加え、1ナノモルの濃度を達成する。そして、揺れや渦を避け、穏やかなピペットで混合物を再中断します。

使用するまで摂氏37度でチューブをインキュベートします。マルチチャネルピペットを使用して、細胞と空の空白のウェルズを2回洗浄し、事前に温めたカルシウムとマグネシウムフリーPBS溶液を使用します。PBSを廃棄し、細胞透過性のために予温アッセイ媒体の180マイクロリットルを加えます。

パーメアビライズ後すぐに、校正されたセンサーカートリッジのユーティリティプレートをパーメアビライズされた細胞を含むセルプレートに交換し、測定を開始します。治療群は、コハク酸誘発呼吸率が高い。メトホルミン治療に対するA549細胞の応答は、ヘップG2よりも高かった。ピルビン酸の熱い誘発呼吸について、A549細胞は5〜15分の間のHep G2細胞と比較して増加した誘導を示した。

同様の結果がグルタミン酸マレート誘発呼吸およびパルミトイルカルニチンの誘発呼吸について得られた。基質および阻害剤の適切な濃度を達成する。右側のボリュームを正しいポートにロードする必要があります。

ある基質の代謝経路の変化が同定された場合、その経路に関与する酵素およびトランスポーターの機能を評価する必要がある。