黄色 ブドウ球菌 内在化と抗菌性化合物の細胞内有効性を研究するための酵素保護アッセイの改善
2021年9月8日
このプロトコルは、 黄色ブドウ球菌 の内在化の程度とヒト宿主細胞内で生き残る能力、ならびに抗菌性化合物の細胞内有効性を研究する方法を説明することを目的とする。
酵素保護アッセイは、ステープルアウレウスの内在化の程度と、接着細胞内で生き残る能力、ならびに抗菌性化合物の有効性を研究することを可能にする。改善された酵素保護アッセイは技術的な取り扱いを大幅に簡素化し、弱接着性細胞および懸濁液中の細胞から内在化細菌を回収することを可能にする。手順を実証するには、私の研究室の医師で博士課程の学生であるジョセリン・リガイルです。
感染アッセイの2日前に、種子A549上皮細胞は、24ウェルプレートのウェル当たり1ミリリットル当たり2.0倍から5番目の細胞の密度で、100%合流するまで5%の二酸化炭素で摂氏36度で48時間培養する。アッセイの日には、A549細胞を数えるために専用の3つのウェルから使用済み培養培地を取り除いて捨て、1ミリリットルの完全な感染培地を1ミリリットルずつ添加し、1ミリリットルのHoechst 33342と1ミリリットルのヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり1マイクログラムを含有する。細胞を30分間インキュベートし、次いで広視野蛍光顕微鏡を用いて、細胞数を数え、細胞の生存率を算出する。
細菌懸濁液を調製するには、チューブ内の完全な感染媒体の25ミリリットルを分配し、摂氏36度でそれを予熱する。次に、細胞密度計を用いて完全な感染培地で0.5のODにブドウ球菌懸濁液を調整し、次いで完全な感染培地で培養物を希釈して細胞接種のための細菌懸濁液を20ミリリットル調製し、1つの細胞数に応じて1つのMOIを達成する。次に、自動スパイラルプラターを用いて、細胞接種工程に使用する希釈細菌懸濁液の黄色ブドウ球菌負荷を決定し、摂氏36度で18〜24時間寒天プレートをインキュベートする。
翌日、コロニーカウンターを持つコロニーの数を数え、検査された各株の正確なMOIを計算します。細胞接種前に、低倍率顕微鏡で24ウェルプレートの全ウェルを観察し、細胞が健康で期待通りに成長していることを確認し、24ウェルプレートから使用済み細胞培養培地を取り除いて捨て、100%コンフルエント細胞を含む各ウェルに500マイクロリットルの細菌懸濁液を加えます。5%の二酸化炭素で摂氏36度で2時間細胞をインキュベートする。
改善された酵素保護アッセイを用いて細胞内細菌を定量化するために、4xリシスバッファー、2%トリトンX-100、トリプシン-EDTA、およびリソスタフィンストックをテキスト原稿に記載されているように作業溶液中で調製する。次に、リソスタフィンの働く溶液の250マイクロリットルに完全な感染培地の6ミリリットルを加えることによってリソスタフィンを補充する完全な感染培地の6.25ミリリットルを調製する。次に、リソスタフィンを添加した完全な感染培地を250マイクロリットルを各ウェルに加え、手でプレートを回転させることでプレートを軽く攪拌する。
リソスタフィンが細胞外細菌を殺すことを可能にするために、細胞を5%の二酸化炭素で摂氏36度で1時間インキュベートし、各ウェルに10マイクログラムのプロテイナーゼKを10マイクロリットルずつ加えてリソスタフィンを不活性化し、室温で2分間細胞をインキュベートする。次に、4倍のリシスバッファーを250マイクロリットル加えて、浸透衝撃で細胞を分解し、36°Cで10分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、ピペット細胞は、細胞が完全に分解され、均質化されていることを確認するために数回上下にリセートし、その後、各ウェルの黄色ブドウ球菌の負荷を決定し、摂氏36度で18〜24時間寒天プレートをインキュベートするために自動スパイラルプラターを使用します。
翌日、コロニーカウンターを有するコロニー数をカウントし、各ウェルの細胞内ブドウ球菌負荷を計算する。A549上皮細胞による黄色ブドウ球菌の2株の内在化をここに示す。リソスタフィンを除去するスメシュを含む酵素保護アッセイを用いて、平均細胞内負荷は、SF8300野生型およびfnbAおよびB遺伝子を欠く等原性変異体に対して、ミリリットル当たり4.46および0.49ログcfuであった。
リソスタフィンを不活性化するためにプロテナーゼKを使用する改善された酵素保護アッセイを使用して、負荷はそれぞれ1ミリリットル当たり4.53および0.56 log cfuであった。酵素保護アッセイを用いて測定した黄色ブドウ球菌に対するバンコマイシン、リファンピシン、およびレボフロキサシンの細胞内活性をここに描く。平均細胞内負荷は、対照用のミリリットル当たり4.57ログcfu、バンコマイシンの場合は4.51、リファンピシンでは3.03、レボフロキサシンでは2.91である。
酵素を除去するための集中的な打ち込みは、最も感染した細胞を取り外す傾向があり、不正確な結果を与え、改善されたプロトコルの使用をサポートする可能性があります。酵素保護アッセイの改善により、臓器不同でのステープル・アウレウス内装の研究が容易になり、パッティングにより使用される高含有スクリーニングシステムに容易に適応可能
概要
本研究では、ヒト宿主細胞における黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の細胞内への取り込みと、細胞内での生存メカニズムの解明に焦点を当てています。さらに、改良された酵素保護アッセイを用いて、本細菌に対するさまざまな抗菌化合物の有効性を評価します。
研究の主要構成要素
研究分野
- 微生物の病原性
- 抗菌応答
- 細胞内取り込みダイナミクス
背景
- Staphylococcus aureusは宿主細胞内で生存する能力を持つため、臨床的に重大な課題となっています。
- その細胞内への取り込み（internalization）を理解することは、感染症に対する治療戦略に寄与します。
- 従来の解析手法では、細菌の取り込み量を正確に定量化する上で限界がある可能性があります。
使用方法
- 細菌の内部移行を研究するための改良された酵素保護アッセイ
- 宿主細胞モデルとしてのA549上皮細胞
- 蛍光顕微鏡観察、リソスタフィン処理、およびコロニーカウント法
主な結果
- 改良されたアッセイを用いることで、Staphylococcus aureusの平均細胞内負荷量を定量的に有意に測定できた。
- 抗菌化合物の有効性は異なり、バンコマイシンはより高い細胞内活性を示した。
- 修正されたプロトコルにより、細菌の細胞内取り込みをより正確に測定することが可能となった。
結論
- 本研究では、宿主細胞内におけるStaphylococcus aureusの生存数を定量化するための効果的な手法を提示しています。
- この研究は、細菌感染に対する治療戦略を開発するために不可欠な知見を提供します。
よくある質問
産業上の重要性
非専門的な食細胞における抗菌薬の有効性を評価するには、細胞内細菌数の正確な定量化が不可欠であり、従来のアッセイでは病原体の持続性を過小評価する可能性があります。改良された酵素保護アッセイは、弱接着細胞や浮遊細胞から内部に取り込まれた細菌を回収する際における技術的な制限を解消し、初期段階の抗菌薬スクリーニングにおける信頼性を向上させます。これにより、細胞内 Staphylococcus aureus に対する化合物の活性を一貫して測定することが可能となり、メカニズム的なリスク低減が支持され、リード化合物の最適化に向けた意思決定に寄与します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値： 内部移行および細胞内生存における病原性因子の寄与を調査することを可能にし、抗感染戦略のターゲット検証を支援する。
- 運用上の価値： アイソジェニック株を比較するための再現可能な手法を提供し、病原体の持続性に関する遺伝的決定因子を明らかにする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 内在化したStaphylococcus aureusに対する化合物の有効性を評価するための、定量的な細胞内CFUリードアウトを生成する。
- 運用的価値： 細胞の脱落を引き起こす洗浄工程を排除し、オルガノイドを含む接着系および浮遊系のモデルにおけるアッセイの堅牢性を向上させる。
- 科学的価値： 溶解および回収工程を簡略化することで、ハイコンテンツスクリーニングへの適応を容易にし、抗菌プロファイリングのスループットを向上させる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 接着性非専門的食細胞および3Dオルガノイドシステムを用いて、細胞内ニッチを模倣した疾患関連モデリングを支援します。
- 運用的価値： 標準化された細胞内細菌量指標を提供することで、ヒット化合物の同定から前臨床評価までの連続性を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本アッセイは、表現型スクリーニングによるターゲットバリデーションから、主要な薬力学的エンドポイントとして細胞内病原体量を定量することによる前臨床有効性評価までを繋ぐ、抗菌薬探索の連続的なプロセスに組み込まれています。
- 探索生物学：制御されたMOIおよびリソスタフィン保護ステップを通じて、宿主・病原体相互作用および病原性メカニズムの仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：再現性のある定量的な細胞内CFU測定を提供し、異なる条件下での抗菌化合物の比較を可能にします。
- 分析：log CFU/mLの読み取り値を生成し、化合物の細胞内活性の順位付けや、タイムキル曲線または感染後治療効果の評価を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：原細胞やオルガノイドモデルに適用可能な、変換可能な細胞内有効性指標を提供することで、前臨床ワークフローへと繋げます。
- エンタープライズでの再利用：Staphylococcus aureus以外にも、複数の病原体や細胞型に適応可能な、再利用可能な細胞内感染プラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞外効果と細胞内効果を区別することで、抗菌作用におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：細胞内細菌の回収を標準化し、処理中の細胞喪失によるばらつきを最小限に抑えます。
- 戦略的価値：真の細胞内活性を持つ化合物を明らかにすることで、go/no-go判断を改善し、後期段階での失敗リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響：細胞内有効性データに基づいたリード化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にし、抗感染症プログラムにおける資本効率を向上させます。
実施上の考慮事項
- 細胞培養、感染多重度（MOI）の算出、および嫌気性または通性嫌気性病原体の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 正確なCFU定量には、リソスタフィン、プロテアーゼK、溶解バッファー、およびスパイラルプレーターへのアクセスが不可欠です。
- 研究室間でのMOI、リソスタフィン曝露時間、および不活化プロトコルの標準化が必要です。
- 初代細胞や3Dモデルに適応させる場合、リソスタフィンの浸透および溶解条件の最適化が必要になる可能性があります。
- 実用上の制限：アッセイ時間が24時間を超えるため、超高スループットスクリーニングキャンペーンにおいて制約となる可能性があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Determination of Cell Density and Viability
1:33
Preparation of the Bacterial Suspension
2:32
Cell Inoculation
3:03
Quantification of Intracellular Bacteria with Improved Enzyme Protection Assay (iEPA)
4:44
Results: Intracellular Staphylococcus aureus Load in Epithelial Cells
5:54
Conclusion
