Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定
2021年8月4日
ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo のレチナル組織サンプルにおけるミトコンドリアストレスアッセイおよび解糖率アッセイを行うための詳細なプロトコルを説明する。
このプロトコルは、2つの主要な生体エネルギー経路のリアルタイム分析を提供します: ミトコンドリア呼吸と解糖分解は、新たに解剖されたex vivoマウスのレチン組織で.伝統的なタツノオトシゴの分析は培養された単層細胞に焦点を当て、このプロトコルは、研究者が解剖たばかりの組織、特にレティナにおけるミトコンドリア活性を研究することを可能にする。この技術は、ミトコンドリアの活動と受け継がれ変性マウスモデルのレティナにおける解糖フラグを研究するために使用される。
これは、肛門研究に有用なツールであり、潜在的な治療法を開発するために他のタイプの組織に適用される可能性もあります。このプロトコルの最も難しい部分は、新たに解剖されたマウスのretinaから品質のパンチディスクを得るですので、この技術を実行する個人は、良好な脱剖スキルを持っていることをお勧めします。実験の前日に、センサーカートリッジカセットを開き、ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルのキャリブレーション媒体を追加します。
フルオロフォアを活性化するために摂氏37度の炭酸ガスを含まないインキュベーターで一晩インキュベートします。実験当日、ストックから希釈化合物の薬でアッセイ培地を調製します。摂氏37度の水浴でアッセイ媒体を温めます。
テキスト原稿に記載されているように、マシン上でアッセイプログラムを設定します。メッシュインサートを含むカセットの蓋を開きます。各メッシュインサートにコーティングミックスのピペット8マイクロリットル、ピペットチップを使用して液滴を穏やかに広げ、メッシュインサート全体にコーティングミックスを均等に分配します。
カセットを閉じ、メッシュインサートが吸収のために少なくとも25分間室温でインキュベートできるようにします。インキュベーション後、アッセイ媒体の4ミリリットルを直接インサートにピペットしてメッシュインサートを洗浄します。カセットを軽く振って、すべてのメッシュインサートがアッセイ媒体で洗浄されるようにします。
レチナルパンチを準備するには、大人の安楽死マウスから目を外核にし、ペトリ皿の氷冷PBSに入れ、ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置きます。マイクロシザーを使用して視神経を切断し、眼球の外側に取り付けられた余分な筋肉を慎重に取り除きます。30ゲージ針を使用して、角膜の端に穴を開けます。
その後、角膜の端に沿って円形のカットを行うために細かい解剖マイクロシザーを使用しています。鋭利解鉗子を使用して、眼球カップから角膜、レンズ、そして膜のユーモアを取り除きます。細かい解剖マイクロシザーを使用して、アイカップの縁部の硬化層にいくつかの小さなカットを行います。
両側の強膜組織に保持し、神経性の残膜から除去するために非常に慎重に強膜層を引っ張るために2つの鋭い解離鉗子を使用してください。すべてのクリンラが取り除かれ、無傷のレチンカップが得られるまで、アイカップの周りでこれを繰り返します。それを平らにし、解剖マイクロシザーを使用していくつかの異なるセクションを生成するために、レティナルカップの放射状のカットを行います。
次に、直径1ミリメートルの生検パンチャーを用いて、扁平したレチナルカップの各部から1枚のレチナルディスクを切断する。視神経の頭部から等しい距離でパンチ。鉗子を使用して解剖ペトリ皿に事前コーティングされたメッシュインサートを移します。
2つの超細かいまつげブラシの助けを借りて、メッシュの表面を下にして、メッシュの中央にレチナルパンチディスクを置き、メッシュと感光体層を上に向けて、神経節細胞層の下に置きます。センサーカートリッジをロードするには、37°Cインキュベーターから水和センサーカートリッジプレートカセットを取り出します。ハイドロブースターカバーを取り外した後、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。
ピペットチップを45度の角度で保持し、ピペットチップを注入口の反対側の壁に対して傾斜して注入口に挿入することで、適切なポートに注入化合物溶液の所望の容積をロードします。コンパウンドを各ポートに静かに積み込みます。[実行開始]ボタンをクリックして、マシントレイを開いてキャリブレーションのために、センサーカートリッジを機械に取り付けます。
センサーカートリッジをマシンに取り込み、[準備完了] ボタンをクリックしてキャリブレーションを開始します。アセイ媒体の所望の容積を、小地捕獲板の各ウェルに積み込む。鉗子を使用して、レチナルパンチディスクを含むメッシュインサートのリムをつかみ、ペトリ皿から取り出します。
吸収ワイプティッシュのメッシュインサートの底を軽くタップして余分な液体を取り除き、小子捕獲プレートのウェルに入れます。このステップを繰り返し、レティナルパンチを含むすべてのメッシュインサートが、背景補正ウェルと空のメッシュインサートで埋める空の井戸を埋めるアイレットキャプチャプレートに配置されます。2 つの Graefe 鉗子を使用して、各メッシュ挿入物のリムを慎重かつ穏やかに押し、それらが、アイレットキャプチャプレートの底部にしっかりと挿入されるようにします。
装填した小地捕獲プレートを37°Cインキュベーターに5分間置いてウォームアップし、キャリブレーションが完了した後にユーティリティプレートを排出します。レチンブルパンチを含むアイレットキャプチャプレートに交換し、ロードセルプレートボタンをクリックしてアッセイの実行を再開します。実行が完了したら、イジェクトボタンをクリックして、レティナルパンチを含むセンサーカートリッジと小口キャプチャプレートを取り出し、完了ボタンをクリックして、データが自動的にASYRファイルとして保存され、画面が自動的に結果表示に変わります。
OCRトレースと解糖率アッセイを示すミトコンドリアストレスアッセイは、OCRおよびECARの両方のトレースを示し、解剖したばかりの1ミリメートルのレチナルパンチディスクを用いて行った。ミトコンドリアストレスアッセイでは、Bam15をミトコンドリアATP産生からプロトン勾配を切り離すために注入され、OCRが最大レベルに増加した。ロテノーンとアンチマイシンAを注入して、それぞれ複合体1と複合体3でミトコンドリア呼吸を阻害し、OCRの最小レベルへの低下をもたらした。
OCRの最大レベルと基底OCRレベルの最後の測定との差は、ミトコンドリア予備容量を反映しています。解糖率アッセイでは、ロテノーンとアンチマイシンAの注入はミトコンドリア呼吸を停止し、解糖を高く駆動します。解糖症は、ヘキソキナーゼ結合のためにグルコースと競合する2-デオキシdグルコースを注入することによって押収され、ECARは最小限のレベルに低下する。
糖ECAR基底レベルの最後の尺度における糖ECARの最大レベルの差は、解糖分解リザーブ容量を反映しています。信頼性の高いデータを生成するには、レチナルパンチディスクの良質を取得し、1.5時間以内に総解剖時間を制限することが重要です。実験に続いて、ウェル内のレチンディスクのタンパク質含有量のDNAを定量化し、それを使用してタツノオトシゴのデータを正規化することができます。
そこで、このプロトコルは、レティナの発達、老化、疾患を研究するために利用されました。グルコースや脂肪酸などの異なる燃料基質に対する組織の好みまたは依存性も分析した。
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概要
この研究は、市販のバイオアナライザーを使用して、ex vivoマウス網膜組織のミトコンドリア呼吸と解糖を評価するための詳細なプロトコルを提示します。この方法論により、研究者は新鮮に解剖された網膜組織の生体エネルギー代謝経路を正確に分析することができ、網膜変性モデルの理解を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生体エネルギー代謝学
- 網膜研究
背景
- このプロトコルは、ミトコンドリア活性と解糖速度のリアルタイム分析を可能にします。
- 従来の方法は主に培養細胞に焦点を当てており、実際の組織力学への洞察が限られていました。
- 遺伝性網膜変性マウスモデルの網膜組織に特化して設計されています。
- この技術は、治療法開発のために他の組織タイプにも適用可能かもしれません。
研究の目的
- 網膜組織のミトコンドリア機能と解糖を詳細に研究することを可能にします。
- 網膜変性における潜在的な代謝変化を調査します。
- ex vivo組織サンプルの生体エネルギー代謝経路の評価のための信頼性の高い方法を提供します。
使用された方法
- マウスのex vivo網膜組織は、市販のバイオアナライザーを使用して分析されました。
- プロトコルの成功的な実施には、網膜解剖の技術的専門知識が不可欠です。
- 重要なステップには、メッシュ挿入物の準備と網膜パンチディスクの手際よい取り扱いが含まれます。
- アッセイは、ミトコンドリアおよび解糖機能をそれぞれ評価するために、酸素消費率（OCR）と細胞外酸性化速度（ECAR）を測定します。
- 正確な結果を得るために、アッセイの前日の校正と準備ステップが必要です。
主要な結果
- ミトコンドリアストレスアッセイは、ミトコンドリア機能に影響を与える様々な化合物に対するOCR応答を示しました。
- 解離剤を通じて最大OCRレベルが達成され、ミトコンドリアの応答性を示しました。
- 阻害剤ではOCRの顕著な低下が観察され、ミトコンドリア呼吸の重要性が強調されました。
- 結果は、網膜変性モデルにおける代謝変化の研究の可能性を強調しています。
結論
- このプロトコルは、網膜組織における重要な代謝経路の評価を可能にし、網膜疾患の理解を進めます。
- この方法により、神経変性疾患に関連するミトコンドリア機能障害の詳細な検査が可能になります。
- 結果は、遺伝性網膜変性を管理するための将来の治療戦略に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Direct measurement of mitochondrial respiration and glycolysis in ex vivo retinal tissue enables high-fidelity metabolic profiling at early discovery and target validation stages. This approach provides predictive confidence for mechanistic de-risking in disease-relevant systems, supporting translational continuity from discovery through preclinical research. The protocol's adaptability to intact tissues addresses a critical gap in portfolio decision-making for metabolic and neurodegenerative disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathway function in physiologically relevant retinal tissue.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying mitochondrial and glycolytic reserve capacities.
- Facilitates functional target validation in models of retinal degeneration and aging.
Screening & Assay Development
- Prepares validated ex vivo tissue systems for downstream metabolic screening workflows.
- Delivers quantitative OCR and ECAR outputs for assay standardization and reproducibility.
- Enables reliable evaluation of metabolic modulators in intact tissue context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns metabolic readouts with disease-relevant phenotypes in retinal models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in metabolic and neurodegenerative pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling direct metabolic assessment in intact retinal tissue, supporting lead identification and translational biomarker development.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification in native tissue environments.
- Screening: Provides reproducible, quantitative OCR and ECAR measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates real-time metabolic traces and reserve capacity metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Connects metabolic function to disease progression and therapeutic response in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to other tissue types for broader portfolio impact.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metabolic target validation.
- Operational Value: Standardizes metabolic assays for reproducibility and scalability across tissue types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic and neurodegenerative disease assets.
Implementation Considerations
- Requires skilled tissue dissection and handling expertise for reproducible results.
- Needs access to microplate-based fluorescence instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue preparation and assay protocols.
- May require adaptation for different tissue types or disease models.
- Data normalization to DNA or protein content is essential for accurate interpretation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Hydrating Sensor Cartridge and Preparation of the Assay Medium
1:55
Coating Mesh Inserts of Islet Capture Microplate
2:35
Retinal Dissection and Retinal Punch Preparation
4:21
Loading the Sensor Cartridge Injection Ports and Calibration
5:09
Loading the Islet Capture Plate and Running Assay
6:31
Results: Mitochondrial Stress and Glycolytic Rate Assays
7:51
Conclusion
