Name: Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ ex vivoマウス網膜組織におけるミトコンドリア呼吸と解糖のリアルタイム測定法。蛍光センサーを用いてOCRとECARを測定し、網膜の代謝機能を解析します。

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この研究は、国立眼科研究所(ZIAEY000450およびZIAEY000446)の壁内研究プログラムによって支援されています。

すべてのマウスプロトコルは、国立眼科研究所(NEI ASP#650)の動物のケアと使用委員会によって承認されました。マウスは12時間の明暗条件で収容され、実験動物のケアと使用のためのガイド、実験動物資源研究所、およびヒトケアと実験動物の使用に関する公衆衛生サービスポリシーの勧告に従って世話をしました。
1. センサカートリッジのハイドレートとアッセイ媒体の準備
<ol><li>実験前日に、1 mLのキャリブレーション媒体をユーティリティプレートの各ウェルに加えます。ハイドロブースターカバーを上部に置き、カバーの開口部からセンサーカートリッジを下げます。センサーがキャリブレーションメディアに沈み込みになっていることを確認します。センサーカートリッジを37°CのCO2フリーインキュベーターに一晩インキュベートし、フルオロフォアを活性化します。 注:蒸発を防ぐために、インキュベーターは内部の水のトレイを保つことによって加湿され、センサーカートリッジカセットは透明なラップで包まれます。</li>
	<li>シーホースDMEM培地をグルコース、ピルビン酸、グルタミンを所望の濃度に添加して再構成してアッセイ培地を調製します。本稿で報告されたアッセイでは、アッセイ媒体中の基質の最終濃度は、グルコースの6mM、ピルビン酸の0.12mM、および0.5mMのグルタミンである。各アッセイプレートについて、実験当日にアッセイ培地の40mLが新鮮に調製される。</li>
	<li>製造者の指示26に従って、分析装置にアッセイプログラムをセットアップします。ここで示すアッセイでは、プロトコルは、ベースラインの測定の5サイクル、次にポートAを注入し、その後4サイクルの測定を注入し、次いでポートBを注入し、続いて4サイクルの測定を行う。各サイクルは、ミックス(3分)、待つ(2分)と測定(3分)で構成されています。</li>
</ol>2. アイレットキャプチャマイクロプレートのコーティングメッシュインサート
<ol><li>20 μLの細胞取り付け培地(例えば、Cell-Tak)に0.1 M重炭酸ナトリウム、9 μLの1 M NaOHを組み合わせてコーティングミックスを準備します。</li>
	<li>メッシュインサートを含むカセットの蓋を開きます。各メッシュ挿入物にコーティングミックスのピペット8 μL。ピペットチップを使用して、液滴を穏やかに塗りつぶしたり広げたりして、メッシュインサート全体にコーティングミックスを均等に分配します。</li>
	<li>カセットを閉じ、メッシュインサートが吸着のために少なくとも25分間室温でインキュベートできるようにします。</li>
	<li>アッセイ媒体の4 mLをメッシュインサートに直接ピペットしてメッシュインサートを洗浄します。カセットを軽く振って、すべてのメッシュインサートがアッセイ媒体で洗浄されるようにします。</li>
	<li>メッシュ挿入物は脇に置きます。使用する準備ができました。</li>
</ol>3. 注入化合物の準備
<ol><li>Bam15(10 mM)、ロテノン(10mM)、アンチマイシンA(10mM)、2-DG(500mM)の在庫アリコートを-80°C冷凍庫から取り出し、室温で解凍します。 注:2DG在庫は使用する準備ができています。他の薬剤は、作業ストックに希釈する必要があります.</li>
	<li>アッセイ媒体の10mLを37°Cの水浴で温めます。</li>
	<li>2段階希釈手順を使用して10 mM Bam15ストックを50 μMの作業在庫に希釈:20 mMストックの20 μLとDMSOの20 μLを混合して5 mM中間在庫を得ます。その後、上記の5 mM中間ストックの10 μLを、990 μLの予温アッセイ媒体と混合して、最終的な50 μMの作業ストックを得ます。</li>
	<li>希釈して10 mMロテノーンと10 mMアンチマイシンAストックを10 μMロテノーン/アンチマイシンA(Rot/AA)作業ストックに10 μM Rotenone/Antimycin AAの2ステップずつ組み合わせます:10 mMロテノーネのそれぞれ10 μLと10 mM Antimycin Aストックを80 μLのDMSOを持つAストックを1mM/AAの中間在庫にします。その後、上記の1mM中間ストックの10 μLを990 μLの予温アッセイ媒体と混合して、最終的な10 μM Rot/AA作業ストックを得ます。</li>
	<li>実験当日に上記の注入化合物の作業ストックを新たに準備し、センサーカートリッジの注入ポートにロードするまで室温で確保します。</li>
</ol>4. レチナル解剖とレチナルパンチ調製
<ol><li>安楽死27に関するAVMAガイドラインに従って、CO2窒息によりマウスを安楽死させる。 注:安楽死に必要な時間よりも長いCO2 チャンバーに動物を残してはなりません。</li>
	<li>目を引き起せ、ペトリ皿の氷古の1x PBSバッファーに入れ、解剖顕微鏡の下に置きます。</li>
	<li>慎重に除去, マイクロシザーで切断することにより, 眼球の外側に取り付けられた余分な直腸筋と視神経を切断.</li>
	<li>角膜(四肢)の端に穴を開けるために30 G針を使用してください。これはマイクロシザーの挿入部位として機能する。次に、細かい解剖マイクロシザーを使用して角膜の端に沿って円形のカットを行い、後部アイカップから分離します。</li>
	<li>鋭い解剖鉗子を使用して、角膜、レンズ、そして眼球から離れた膜膜のユーモアを取り除きます。</li>
	<li>細かい解剖マイクロシザーを使用して、アイカップの縁部の硬化層にいくつかの小さなカットを行います。レティナ層を切断しないでください。カットの両側の強膜組織にしがみつくには、2つの鋭い解剖鉗子を使用し、非常に慎重に神経の残線からそれを取り除くために強膜層を引っ張ります。すべてのクリンラが取り除かれ、無傷のレチンカップが得られるまで、アイカップの周りでこれを繰り返します。</li>
	<li>解剖マイクロシザーを使用し、それを平らにし、いくつかの異なるセクションを生成するために、レチンカップの放射状のカットを行います。 注:人の解剖スキルと新鮮なレチン組織を扱う経験に応じて、レチンカップをカットして3〜5つの異なるセクションを生成することができます。</li>
	<li>平らなレチナルカップの各セクションから1つのレチナルディスクをカットするために1ミリメートルの直径生検パンチャーを使用してください。 注:視神経の頭部から等しい距離で、眼のディスクを打ち抜くように注意してください。</li>
	<li>鉗子を使用して、事前にコーティングされたメッシュインサートを解剖シャーレに移します。2つの超微細なまつげブラシの助けを借りて、メッシュインサートにレチナルパンチディスクを置きます。このレチナルパンチディスクは、メッシュの中央に配置され、神経節細胞層側がメッシュと感光体層を上に向けて下に置かれます。 注:多くの場合、一部のRPE細胞は感光体に付着したままであり、これらの細胞の色素沈着は網膜パンチディスクの向きの指標として使用することができます。</li>
</ol>5. センサーカートリッジの注入ポートとキャリブレーションのロード
<ol><li>37°Cインキュベーターから、水和されたセンサーカートリッジプレートカセットを取り出します。ハイドロブースターカバーを取り外し、センサーカートリッジをユーティリティプレートに戻します。</li>
	<li>適切なポートに注入複合作業ストックソリューションの所望の容積をロードします。ピペットの先端を45°の角度で持ちます。ピペットチップを注入口の反対側の壁に対して先端のベベルを持つ注入口に途中で挿入し、各ポートにコンパウンドを静かにロードします。気泡の導入は避けてください。</li>
	<li>特定のアッセイについては、各注入口にロードされる化合物の容積については、装置使用ガイドを参照してください。本論文で示した実験では、50μM Bam15作業ストック(ミトコンドリア応力アッセイ用)の68 μLまたは10μM Rot/AA作業ストック(解糖率アッセイ用)の68 μLがポートAに積み込まれています。75 μLの10 μM Rot/AA 作業ストック(ミトコンドリア応力アッセイ用)または500 mM 2-DG作業ストックの75 μL(解糖率アッセイ用)をポートBに積み込みます。</li>
	<li>適切な注入を確実にするために、背景補正井戸とブランクウェルを含むプレートのすべての井戸の注入ポートをロードします。背景補正ウェル用に各ポートに各複合溶液をロードします。アッセイ媒体は、複合溶液の代わりに、バンクウェルの各ポートに置換することができる。</li>
	<li>ロードされたセンサーカートリッジプレートを蓋を外してアナライザマシンに取り付け、アッセイ実行前にキャリブレーションを開始します。キャリブレーションが終了すると、プログラムは自動的に一時停止し、レチンのパンチを含むアイレットキャプチャプレートとユーティリティプレートの交換を待つ。</li>
</ol>6. 小地捕獲プレートをロードし、アッセイの実行を開始
<ol><li>小地捕獲プレートの各ウェルにアッセイ媒体の607 μLを加える</li>
	<li>鉗子を使用して、レチナルパンチディスクを含むメッシュインサートのリムを上に持ち、ペトリ皿から取り出します。吸収ワイプティッシュのメッシュインサートの底を軽くタップして余分な液体を取り除き、小子捕獲プレートのウェルに入れます。レティナルパンチを含むすべてのメッシュ挿入物が、小子捕獲プレートに配置されるまで、このステップを繰り返します。背景補正ウェルと空白のウェルを空のメッシュインサートで塗りつぶします。</li>
	<li>2つのGraefe鉗子を使用して、各メッシュインサートのリムを慎重かつ軽く押し、それらが小地捕獲プレートの下部にしっかりと挿入されていることを確認します。</li>
	<li>37°Cインキュベーターに装填した小地捕獲プレートを5分間温める。</li>
	<li>キャリブレーションが完了した後にユーティリティプレートを取り出し、それを取り替えて、レティナルパンチを含む蓋をオフにして、アイレットキャプチャプレートに置き換えます。</li>
	<li>アッセイ実行を再開します。</li>
</ol>7. 実行終了とデータストレージ
<ol><li>実行が完了したら、センサーカートリッジとレティナルパンチを含む小口取り取りプレートを取り出します。データは自動的に .asyr ファイルとして保存されます。</li>
	<li>関連するデータ分析ソフトウェアを使用して、製造元のユーザーガイド26に従ってデータを表示および分析します。</li>
	<li>エクスポート機能を使用して、データの .xslx ファイルをエクスポートします。</li>
</ol>8. レチナルパンチサンプルの保存
<ol><li>アッセイ後、機械からプレートを取り出し、センサーカートリッジを取り外し、ピペットを使用して各ウェルからアッセイ媒体をそっと取り出します。</li>
	<li>カバーを貼り付け直し、パラフィルムストリップでプレートの側面を密封します。</li>
	<li>-80°Cで保管してください。</li>
	<li>正規化のために、各ウェル内のパンチの総DNAまたはタンパク質含有量を定量化します。</li>
</ol>9. データ分析
<ol><li>ミトコンドリアストレスアッセイ 注:測定されたOCR値(totalOCR)は、組織による全酸素消費量を表します。Bam15(アンカプラー)注射後、OCRは基底レベル(totalOCRbasal)から最大レベル(totalOCRmax)に増加し、Rot/AA注入に続いてダウンします。腐敗/AA注入後の残留OCR値(totalOCRRot/AA)は、非ミトコンドリア酸素消費量を表します。<ol>
<li>ミトコンドリア関連酸素消費量を次のように計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq01.jpg"> (Eq. 1)28
</li>
		<li>ミトコンドリアリザーブ容量(MRC)を次のように計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq2v4.png"> (Eq. 2)29 注: Bam15 注入前の 5 つの測定値の最後の読み取り値は、「基底」値として取られます (totalOCRBASAL および mitoOCRbasal)。Bam15注入に続く4つの測定値の中で最も高い測定値は、「最大」値(totalOCRmaxおよびmitoOCRmaxの場合)として使用されます。ロート/AA注入後の4つの測定の中で最も低い読書はtotalOCRRot/AAとして使用される。</li>
	</ol></li>
	<li>解糖率アッセイ 注:測定されたECAR値(totalECAR)は、組織の代謝活性による培地の総酸性化を表します。一般に、細胞外微環境の酸性化は、主に糖分解物、乳酸塩の押出によって生じる。ミトコンドリアTCAサイクルにおける基質の塞栓症はCO2の産生をもたらし、また、重炭酸塩への水和を通じて細胞外媒体を酸性化する。<ol>
<li>サブストラクトミトコンドリアは、グルエカーから培地酸性化(ミトECAR)を寄与し、グリコECARを得た。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq03.jpg"> (Eq. 3)28 注:ミトコンドリア呼吸とTCAサイクルは、強く結合されたプロセスです。ミトコンドリアからのCO2 の生産は、MItoOCRで測定可能なOXPHOSの割合の関数です。</li>
		<li>次のように mitoECAR を計算します。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq04.jpg"> (Eq. 4)28 ここで、CCF(CO2寄与係数)は経験的に計算された比率値であり、OXPHOSからのCO2媒介酸性化と各O2消費量からのH+寄与量を表します。このシステムの CCF は、事前に 0.6028 と判定されています。媒体酸性化の正確な測定は、媒体の緩衝能、計器装置pHセンサーの感度、及び有効な測定室容量によって決定される。ここで、BF(バッファファクター)とは、実験バッファ容量をインザシトゥのパラメータとし、有効測定チャンバに添加したH+またはOH-の量を1単位でpHレベルに変更することを表す。カスタマイズされたアッセイ媒体が使用される場合、BFは、緩衝因子プロトコル30に従ってアッセイ媒体に既知の量の酸を入れ、測定することができる。このプロトコルで使用されるシートホース DMEM 培地 pH 7.4 は、2.60 ミリモル H+/L/pH の事前に決定された BF を有する。このプロトコルで使用される小地捕獲板はVolmicrochamber= 16.6 μL31を有する。体積スケーリング係数Kvolは経験的に定められた定数です。Kvol値は、小子捕獲プレートには利用できないが、マイクロプレート28の値から計算することができ、マイクロチャンバの体積差を考慮して、0.41となる。 注:Rot/AAの注入はミトコンドリア呼吸を遮断し、ATP産生のために組織を解糖に切り替え、より高い乳酸塩押出およびECAR測定の増加に至る。解糖は2-DG注入で停止し、残りのECAR測定は、培地の非解糖および非ミトコンドリア酸性化を明らかにする。</li>
		<li>次のように解糖予備容量 (GRC) を計算します。 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62914/62914eq05.jpg"> (Eq. 5)32 ここで、Rot/AA注入前の5つの測定値の中で最後の読み取り値は、「基底」値(グリコECARBASAL)として取られる。Rot/AA注入後の4つの測定値の中で最も高い測定値は、「最大」値(glycoECARmax)として使用されます。2-DG注入後の4つの測定の中で最も低い読書は、glycoECAR2-DGとして使用される。</li>
	</ol></li>
	<li>正常化 注:正規化は、異なる年齢層のレチン組織からの測定値を比較する場合、または細胞数が異なる可能性のある野生型および病理学的/変性サンプル間での測定値を比較する際に不可欠です。<ol>
<li>各レチナルパンチディスク33,34のDNA含有量を評価するために、商業的に入手可能なキットを使用してください。</li>
		<li>あるいは、放射性免疫沈降アッセイバッファー(RIPAバッファー)を使用して、レチナルパンチから全タンパク質を抽出し、そのタンパク質含有量を正規化に使用します。 注:成人マウスのレチナの表面積は、以前は約20mm2であると判断されており、各レチナには約650万個のCells35が含まれています。したがって、各1mmの直径のレチナルパンチは、単一のレチナの〜1/25であり、〜260K細胞を含む。レチナルパンチのデータを他の組織サンプルまたは培養細胞のデータと比較する場合、これらの数値を参照することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、ex vivo、新たに解剖されたレチナルパンチディスクを使用してミトコンドリア呼吸および解糖活性のマイクロプレートベースのアッセイを実行するための詳細な手順を提供します。プロトコルは、次のように最適化されています: 1) ex vivoのレチン組織に適したアッセイ媒体の使用を保証します。2)は、マシンの最適な検出範囲内にあるOCRとECARの測定値を得るために、レチナルパンチディスクの適切なサイズを採用します。3)コーティングメッシュ挿入物は、測定サイクル中に安定した読み取りのためのレチナルパンチの粘着性を高めるために挿入します。4)各注射薬物化合物の最適濃度の使用;5)各ステップでミトコンドリア状態の高原に到達するために変更されたサイクル長さを確認する。試薬とプロトコルは、新世代のシーホースXFe24マシンに適応するために、以前に公開されたバージョン23から変更されました。前のプロトコル23で使用されたAmesのバッファの代わりに、グルコース、グルタミン、ピルビン酸を別々に添加することによって燃...

ミトコンドリアは、細胞代謝、シグナル伝達、ホメオスタシス、アポトーシスを複数の重要な生理学的プロセスを調整することによって調節する必須のオルガネラである1。ミトコンドリアは、酸化リン酸化(OXPHOS)を介してアデノシン三リン酸(ATP)を生成し、ほぼすべての細胞イベントをサポートするエネルギーを提供する細胞内の大国として機能します。細胞酸素の大部分はミトコンドリアで代謝され、好気呼吸中の電子輸送鎖(ETC)の最終的な電子アクセクサとして機能する。低量のATPは、グルコースをピルビン酸に変換するサイトゾルの解糖からも製造することができ、さらに乳酸に変換したり、ミトコンドリアに輸送したり、三カルボン酸サイクル(TCAサイクル)の基質であるアセチルCoAに酸化することができます。
このレティナは哺乳動物2において最も代謝活性の高い組織の1つで、高レベルのミトコンドリア呼吸と非常に高い酸素消費量を示す3。ロッドおよびコーン光受容体は、ミトコンドリア4の高密度を含み、OXPHOSは、retina5で最もATPを生成します。さらに、このレチナは、グルコースを乳酸5に変換することにより、好気性解糖6,7にも大きく依存しています。ミトコンドリア欠損症は、様々な神経変性疾患に関連しています8,9;そして、その独特の高エネルギー需要と, retinaは、特に代謝欠陥に対して脆弱です, ミトコンドリアOXPHOS4および解糖症10に影響を与えるものを含む.ミトコンドリア機能障害と解糖の欠損は、網膜11,12及び黄斑13変性疾患、加齢黄斑変性症10、14、15、16、および糖尿病網膜症17,18に関与している。したがって、ミトコンドリア呼吸および解糖の正確な測定は、レティナの完全性および健康を評価するための重要なパラメータを提供することができる。
ミトコンドリア呼吸は酸素消費率(OCR)の測定によって測定することができる。グルコースからピルビン酸への変換、そしてその後の乳酸塩への変換は、細胞外環境への陽子の押出および酸性化をもたらすことを考えると、細胞外酸性化率(ECAR)の測定は、グリコリシスフラックスの指標を提供する。このレティナは、基質の交換を含む、親密な関係と活発な相乗効果を持つ複数の細胞タイプで構成されるため、無傷のラミネーションと回路を持つ全レチン組織のコンテキストでミトコンドリアの機能と代謝を分析することが不可欠です。過去数十年にわたり、クラーク型O2電極および他の酸素マイクロ電極は、retina19,20,21における酸素消費量を測定するために使用されてきました。これらの酸素電極は、感度、大きなサンプル体積の要件、および通常、細胞および組織の文脈の破壊につながる懸濁試料の連続攪拌の必要性に大きな制限を有する。ここで説明するプロトコルは、ミトコンドリアのエネルギー代謝を解剖したばかりのex vivoマウスの残膜組織におけるミトコンドリアのエネルギー代謝を測定するマイクロプレートベースの蛍光技術を用いて開発された。それは懸濁および連続的なかき混ぜのための必要性を避けながら、ex vivoのレチナル組織の小さいサンプル(1mmのパンチ)を同時に使用してOCRとECARの両方の中間の実時間測定を可能にする。
ここで示されているのが、解剖したばかりのレチナルパンチディスク上のミトコンドリア応力アッセイおよび解糖率アッセイの実験手順です。このプロトコルは、ミトコンドリア関連代謝活動を、エキビボ組織のコンテキストで測定することを可能にする。培養細胞を用いて行うアッセイとは異なり、ここで得られた測定値は組織レベルでの結合されたエネルギー代謝を反映し、組織内の異なる細胞タイプ間の相互作用の影響を受ける。このプロトコルは、アイレットキャプチャプレートを備えたアジレントシーホース細胞外フラックス24ウェル(XFe24)アナライザの新世代に適応するために、以前に公開されたバージョン22,23から変更されます。アッセイ培地、注入化合物濃度、およびアッセイサイクルの数/持続時間も、レチン組織に対して最適化されています。レチナルパンチディスクの準備のために詳細なステップバイステッププロトコルが与えられています。プログラムのセットアップとデータ分析の詳細については、製造元のユーザーガイド24,25,26から入手できます。

<table><tbody><tr><td>1X PBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-デオキシグルコース (2-DG)、500 mM ストック溶液</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td>タツノオトシゴ XF DMEM 培地に溶解し、事前に準備</td></tr><tr><td>します 30 ゲージニードル</td><td>BD プレシジョン グライド</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシン A、10 mM ストック溶液</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>DMSO に溶解し、事前に準備</td></tr>します <tr><td>Bam15、10 mM ストック溶液</td><td>TimTec</td><td>ST056388</td><td>DMSOに溶解し、事前に準備</td></tr><tr><td>生検パンチャー、1 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning Life Sciences</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>CO2 asphyxiation chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖鉗子-Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Stright tip</td></tr><tr><td>Dissection鉗子-デュモン #7</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11274-20</td><td>湾曲した先端</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11051-10</td><td>湾曲した、鋸歯状の先端</td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15004-08</td><td>湾曲した先端</td></tr><tr><td>NaOH 溶液、1 M</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S8263</td><td>水溶液、事前に準備</td></tr><tr><td>ロテノン、10 mMストック溶液</td><td>シグマ</td><td>R8875</td><td>DMSOに溶解し、事前に準備</td></tr>します <tr><td>タツノオトシゴ校正媒体</td><td>アジレント</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 1.0 Mグルコース</td><td>アジレント</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 100 mMピルビン酸</td><td>アジレント</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF 200 mM グルタミン</td><td>Agilent</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF DMEM ミディアム</td><td>Agilent</td><td>103575-100</td><td>pH 7.4、5 mM HEPES タツ</td></tr>ノオトシゴ <tr><td>XFe24 Islet Capture FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103518-100</td><td>センサーカートリッジと Islet Capture マイクロプレート</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XFe24、細胞外フラックス分析装置</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム溶液、0.1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>水溶液、事前に準備</td></tr><tr><td>超極細まつげブラシ</td><td>テッド・ペラ</td><td>113</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

ミトコンドリア呼吸は、全ての細胞、特に高活性代謝を有するレチン系感光体の重要なエネルギー生成経路である。また、光受容体は癌細胞のような高い好気性解糖を呈する。これらの代謝活動の正確な測定は、生理学的状態および疾患状態における細胞恒常性に関する貴重な洞察を提供することができる。高スループットマイクロプレートベースのアッセイは、生細胞におけるミトコンドリア呼吸および様々な代謝活動を測定するために開発されています。しかし、これらの大部分は培養細胞用に開発されており、インタクトな組織サンプルやアプリケーション ex vivo用に最適化されていません。ここでは、マイクロプレートベースの蛍光技術を用いて、酸素消費速度(OCR)をミトコンドリア呼吸の指標として直接測定する詳細なステップバイステッププロトコル、ならびに細胞外酸性化率(ECAR)を解糖の指標として、無傷の ex vivo レチン組織で説明する。この方法は、正常に成人マウスのレティナの代謝活動を評価し、老化や病気の細胞機構を調査する際にそのアプリケーションを実証するために使用されています。.

ここで報告されるデータは、OCRトレースを示す代表的なミトコンドリア応力アッセイ(図1)およびOCRトレースおよびECARトレースを示す解糖率アッセイ(図2)であり、4ヶ月前のトランスジェニック Nrl-L-EGFP mice36 (C57B/L6バックグラウンド)から解剖したばかりの1mmのレチナルパンチディスクを使用して行った。これらのマウスは、正常なレチナルの発達、病変、生理学を変えることなく、特にロッド感光体でGFPを発現し、肛門の研究で広く使用されている。ここで提示したアッセイでは2つの Nrl-L-GFP リッターメートマウスが使用された。 Nrl-L-GFP マウスで発現されたGFPは、このプロトコルにおけるOCRおよびECARの測定を妨げない。各レチナから5つのレチナルパンチが採取された。10個のレチナルパンチをミトコンドリアストレスアッセイに使用し、残りの10を解糖率アッセイに使用した。シーホースXF...

ここで説明する、商業バイオアナライザを用いた ex vivo のレチナル組織サンプルにおけるミトコンドリアストレスアッセイおよび解糖率アッセイを行うための詳細なプロトコルを説明する。

Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...

このプロトコルは、2つの主要な生体エネルギー経路のリアルタイム分析を提供します: ミトコンドリア呼吸と解糖分解は、新たに解剖されたex vivoマウスのレチン組織で.伝統的なタツノオトシゴの分析は培養された単層細胞に焦点を当て、このプロトコルは、研究者が解剖たばかりの組織、特にレティナにおけるミトコンドリア活性を研究することを可能にする。この技術は、ミトコンドリアの活動と受け継がれ変性マウスモデルのレティナにおける解糖フラグを研究するために使用される。これは、肛門研究に有用なツールであり、潜在的な治療法を開発するために他のタイプの組織に適用される可能性もあります。このプロトコルの最も難しい部分は、新たに解剖されたマウスのretinaから品質のパンチディスクを得るですので、この技術を実行する個人は、良好な脱剖スキルを持っていることをお勧めします。実験の前日に、センサーカートリッジカセットを開き、ユーティリティプレートの各ウェルに1ミリリットルのキャリブレーション媒体を追加します。フルオロフォアを活性化するために摂氏37度の炭酸ガスを含まないインキュベーターで一晩インキュベートします。実験当日、ストックから希釈化合物の薬でアッセイ培地を調製します。摂氏37度の水浴でアッセイ媒体を温めます。テキスト原稿に記載されているように、マシン上でアッセイプログラムを設定します。メッシュインサートを含むカセットの蓋を開きます。各メッシュインサートにコーティングミックスのピペット8マイクロリットル、ピペットチップを使用して液滴を穏やかに広げ、メッシュインサート全体にコーティングミックスを均等に分配します。カセットを閉じ、メッシュインサートが吸収のために少なくとも25分間室温でインキュベートできるようにします。インキュベーション後、アッセイ媒体の4ミリリットルを直接インサートにピペットしてメッシュインサートを洗浄します。カセットを軽く振って、すべてのメッシュインサートがアッセイ媒体で洗浄されるようにします。レチナルパンチを準備するには、大人の安楽死マウスから目を外核にし、ペトリ皿の氷冷PBSに入れ、ペトリ皿を解剖顕微鏡の下に置きます。マイクロシザーを使用して視神経を切断し、眼球の外側に取り付けられた余分な筋肉を慎重に取り除きます。30ゲージ針を使用して、角膜の端に穴を開けます。その後、角膜の端に沿って円形のカットを行うために細かい解剖マイクロシザーを使用しています。鋭利解鉗子を使用して、眼球カップから角膜、レンズ、そして膜のユーモアを取り除きます。細かい解剖マイクロシザーを使用して、アイカップの縁部の硬化層にいくつかの小さなカットを行います。両側の強膜組織に保持し、神経性の残膜から除去するために非常に慎重に強膜層を引っ張るために2つの鋭い解離鉗子を使用してください。すべてのクリン

determination-mitochondrial-respiration-glycolysis-ex-vivo-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス...

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

新鮮な腫瘍ホモジナートにおけるミトコンドリア酸化リン酸化と電子移動能を評価する実用的なプロトコルと分析手法を開発しました。このプロトコルは、がんの開始、進行、および治療応答に寄与する様々なミトコンドリア機能を調査するために容易に適応することができる。...

切除された固形腫瘍均質物のミトコンドリア機能の分析的決定

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

ヒト網膜色素上皮細胞(H-RPE)の代謝状態は、その健康と機能を反映しています。ここでは、高解像度の呼吸測定を使用してH-RPEのリアルタイムの代謝フラックスを調べるための最適化されたプロトコルを紹介します。...

高分解能肺活量測定法を用いた初代ヒト網膜色素上皮細胞における生体エネルギーのリアルタイム解析

私たちは、網膜色素上皮(RPE)培養における酸素消費率(OCR)を測定するための新しいデバイスを紹介します。このデバイスは、プレートが標準細胞培養インキュベーター内にある間に、標準培地で標準細胞培養プレートで成長したRPEで一度に数週間OCRを測定できます。...

高分化型および分極した網膜色素上皮培養における酸素消費速度の長期モニタリング

このプロトコルは、一次マウスのマイクログリアにおける代謝再プログラミングを定量化するために解糖系ストレステストを費用対効果の高い方法で行います。分離および炎症刺激後、新たに調製されたpH調整試薬を用いて細胞外酸性化速度(ECAR)を測定し、その後タンパク質正規化を施して解糖分解シフトの正確かつ再現性のある評価を可能にします。...

細胞外フラックスアッセイを用いた一次ミクログリアにおける解糖系の研究

学ぶ ex vivoマウス網膜組織におけるミトコンドリア呼吸と解糖のリアルタイム測定法。蛍光センサーを用いてOCRとECARを測定し、網膜の代謝機能を解析します。

Ex Vivoのレティナル組織サンプルにおけるミトコンドリア呼吸と解糖の測定

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