Name: ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶTR-FRETアッセイによるヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の定量法。384ウェル形式で洗浄工程不要の高感度・高再現性の細胞シグナル伝達研究手法を習得できます。

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1. 細胞培養
<ol><li>加湿した37°C/5%CO2 </li></ol><ol><li><ol><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li><li><li><li></li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq01.jpg"> </li><li></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62915/62915eq02.jpg"> </li></ol>

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<li>Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+cell+culture+optimization+enhances+experimental+reproducibility+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells.</a> Scientific Reports. 8, 3029(2018).</li>
</ol>

競合する利益:ハイメ・パドロス、ミレイユ・カロン、ジュヌヴィエーヴ・シャテルは、この研究で使用されたサンダーTR-FRETアッセイキットを製造するBioAuxilium Researchの従業員です。さらに、Jaime PadrosとMireille CaronはBioAuxilium Researchの株主です。これは、データと資料の共有に関するすべてのJoVEポリシーに対する著者の遵守を変更するものではありません。

ウェスタンブロッティングやELISAベースの方法などの従来のリンタンパク質分析方法と比較して、THUNDER TR-FRET細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、少量のサンプル(15 μL)を使用し、384ウェルフォーマットのHTS用に設計されており、自動化に非常に適しています。アッセイプロトコルは柔軟性があり、中スループットおよび高スループットの両方のアプリケーションに容易に適合させることができます。アッセイは、2 プレート転送プロトコルまたは 1 384 ウェルプレートプロトコルのいずれかを使用して実行できます。2プレート転写プロトコルでは、細胞を1つの細胞培養プレートに播種、処理、および溶解し、続いて溶解物を別の白色検出プレート(ハーフエリア96ウェルまたは384ウェルプレート)に移して分析します。1-384ウェルプレートプロトコルでは、ワークフロー全体が同じウェルで行われ、液体移送ステップが不要になります。アッセイは、容量を比例的に減らすことで、1536ウェル形式に容易に適合させることができました。アッセイプロトコルに関係なく、調製する試薬溶液は3つしかなく、洗浄ステップはなく、アッセイは「添加のみ」のプロトコルに従って...

JAK/STATシグナル伝達経路は、多様なサイトカイン、インターフェロン、成長因子、および関連分子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしています1,2。これらのリガンドの特異的細胞表面受容体への結合はJAKの活性化をもたらし、JAKは特定のチロシン残基のリン酸化によってSTATタンパク質を活性化する。STATリン酸化は、それらの二量体化および核への転座をもたらし、そこで調節された標的遺伝子の転写にその効果を発揮する。STAT ファミリは、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、および STAT6 の 7 つのメンバーで構成されています。メンバーは、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、および免疫系調節を含む生理学的細胞プロセスの調節において複雑かつ不可欠な役割を果たす。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している3,4。したがって、天然細胞シグナル伝達環境におけるSTATタンパク質のリン酸化を評価する能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。
今日まで、STATを含む細胞内リン酸化タンパク質レベルを測定するために使用される従来の方法は、抗体ベースであり、ウェスタンブロッティング、ELISA、およびホスホフローサイトメトリーを含む。これらの異種の方法は、労力がかかり、時間がかかり、エラーが発生しやすく、スループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、しばしば信頼性が低い(特異性の問題など)5。対照的に、均質アッセイは、より少ない実験ステップを必要とし、より少ないサンプル量を使用し、HTSに従順である。細胞溶解物中のSTATのJAK依存性リン酸化を定量的にモニタリングするために使用できる5つの均質な細胞ベースの免疫アッセイプラットフォームが市販されている:SureFire、HTRF、LANCE、LanthaScreen、およびLumit。これらのプラットフォームにはそれぞれ長所と短所があります。
SureFireは発光酸素チャネリング技術に基づいており、ドナービーズとアクセプタービーズを使用して、一対の抗体を特異的に捕捉し、そのうちの1つはビオチン化されています。リン酸化タンパク質の存在下で、2つの抗体はドナービーズとアクセプタービーズを近接させ、化学発光シグナルの生成を可能にします6。汎用性と感度は高いものの、この技術は高価であり、培養液中のビオチンの影響を受け、周囲温度や光に非常に敏感であり、検出には特別なリーダーが必要です。HTRFとLANCEはどちらもTR-FRET技術に基づいており、ドナー分子として長寿命発光ランタノイドイオン錯体(ユウロピウムまたはテルビウムキレート、またはユウロピウムクリプテート)を使用し、アクセプター分子として遠赤色蛍光団7。ドナー分子またはアクセプター分子のいずれかで標識された2つのタンパク質特異的抗体が近接すると、FRETが発生し、アクセプター蛍光の増加およびドナー蛍光の減少を引き起こす。これらの長寿命蛍光シグナルは、時間分解およびレシオメトリック方式で測定できるため、アッセイ干渉を低減し、データ品質を向上させることができます。TR-FRETの他の利点は、光に敏感ではなく、繰り返し読み取りが可能で、長い信号安定性を示すことです。TR-FRETは、その汎用性、感度、および高い堅牢性のためにHTSに広く実装されていますが、すべての市販のTR-FRETベースのアッセイプラットフォームは高価であるため、学術的および小規模な産業研究所での幅広い採用を妨げています。LanthaScreenアッセイもTR-FRETベースの読み出しを使用しますが、緑色蛍光タンパク質(GFP)-STAT1融合タンパク質とテルビウム標識ホスホ特異的STAT1抗体を組み合わせた安定発現する操作されたU2OS細胞株に依存しています8。シグナル伝達タンパク質の選択が限られていることに加えて、この方法は高価なトランスフェクト細胞株を購入し、その適用性を低下させ、実験的アーチファクトの可能性を高める必要がある。Lumitは、NanoLuc Luciferase9の大小のNanoBitサブユニットで化学的に標識された二次抗体(抗マウスおよび抗ウサギ)を利用する一般的な生物発光免疫測定プラットフォームです。2つの一次抗体の標的タンパク質への結合は、二次抗体を近接させ、発光シグナルを生成する活性酵素を形成する。発光は一般に高感度で堅牢な読み出しですが、2つの異なる種で産生される一次抗体の要件により、アッセイ設計の選択肢が制限されます。さらに、複雑なサンプルマトリックスに二次抗体を使用すると、アッセイ干渉を受けやすくなる可能性があります。
したがって、HTSと互換性のある方法で個々のリン酸化タンパク質および総STATタンパク質を測定するための、信頼性が高く、迅速で、かつ手頃な価格の細胞ベースのアッセイプラットフォームの必要性が依然として存在する。このニーズに対応するために、強化されたTR-FRET技術(THUNDER)に基づいて新しいハイスループット細胞ベースのイムノアッセイプラットフォームが開発され、細胞ライセート中の内因的に発現された細胞内タンパク質(リン酸化または合計)のシンプルで高感度、堅牢で費用対効果の高い測定を可能にするように設計されています。この技術の利点は、優れたスペクトル適合性とTR-FRETシグナルを示すドナー/アクセプターFRETペア、厳密に検証された抗体、および最適化された溶解バッファーの組み合わせに由来します。これらのアッセイはサンドイッチイムノアッセイとしてフォーマットされ、簡単な3段階のワークフローを使用します(図1)。細胞は、まずタンパク質リン酸化を調節するように処理され、次いでキットに提供される特定の溶解緩衝液で溶解される。細胞溶解物中の標的リン酸化または総STATタンパク質は、標的タンパク質上の別個のエピトープを認識する一対のフルオロフォア標識抗体との単一の試薬添加およびインキュベーション工程で検出される(図2)。1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、2番目の抗体は遠赤色アクセプターフルオロフォア(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は溶液中のタンパク質に結合し、2つの標識を近接させる。ドナーのユウロピウムキレートを320または340nmで励起すると、アクセプターにFRETがトリガーされ、細胞溶解物中の標的タンパク質(リン酸化または合計)の濃度に比例した665nmで長寿命のTR-FRETシグナルを放出する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig01.jpg"> 図1:TR-FRETアッセイワークフロー ワークフローは、細胞処理、細胞溶解、TR-FRETを使用したタンパク質検出の3つのステップで構成されています。2プレートアッセイプロトコルでは、溶解液は白色384ウェル検出プレートに移されますが、1プレートプロトコルでは、すべてのステップが同じ白色384ウェル検出プレート(オールインワンウェルプロトコル)で行われます。使用されるアッセイプロトコルにかかわらず、タンパク質検出は同じ総容量(ウェルあたり20 μL)で行われます。略語: TR-FRET = 時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62915/62915fig02.jpg"> 図2:TR-FRETサンドイッチ免疫測定法原理。 1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、もう1つは遠赤色の小蛍光色素受容体(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は、細胞ライセート中の標的タンパク質(リン酸化または全)上の異なるエピトープに特異的に結合し、2つの蛍光色素を近接させます。320または340nmでのドナーユーロピウムキレートの励起は、ドナーからアクセプター分子へのFRETを誘発し、次いで665nmでシグナルを放出する。このシグナルは、細胞溶解物中のタンパク質の濃度に比例する。特定の標的タンパク質がない場合、ドナーとアクセプターの蛍光色素は互いに離れすぎているため、FRETは発生しません。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー移動;TR-FRET = 時間分解フレット;Ab = 抗体;FR = 極赤色。Eu - ユウロピウムキレート;P = リン酸化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62915/62915fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ここでは、THUNDER TR-FRETプラットフォームを使用する付着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の細胞内レベルを、合計STAT1、STAT3、STAT5、およびSTAT6とともに測定するための詳細なプロトコルが、384ウェルフォーマットで提供されています。これらのプロトコルは、2 プレート転写プロトコルまたは 1 プレートオールインワンウェルプロトコルのいずれかを使用した細胞処理、溶解、および TR-FRET ベースの標的タンパク質検出の手順を定義します。これらの細胞ベースのアッセイは、JAK/STAT経路の既知の活性化剤および阻害剤の薬理学的プロファイルを決定するために適用される。HTSのための選択されたアッセイの堅牢性と適合性が実証されています。最後に、アッセイ最適化のための主要な実験と、アッセイのトラブルシューティングに関する推奨事項について説明します。

<table><tbody><tr><td>96ウェルマイクロプレート、透明、平底、ポリスチレン、組織培養処理済み、滅菌</td><td>済み Corning</td><td>3595</td><td>これは、2プレートアッセイプロトコルを使用する際に細胞を培養するためのプレートです。他の細胞培養96ウェルプレートは、</td></tr><tr><td>384ウェルマイクロプレート、白色、低容量の</td><td>PerkinElmer</td><td>6007290</td>使用することができます <td>これは、2プレートまたは1プレートのアッセイプロトコルを使用する場合のTR-FRET検出用のプレートです。その他の少量の白色384ウェルプレートは、</td></tr><tr><td>A431細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555接着</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシール</td><td>PerkinElmer</td><td>6050185</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'を使用できます。改変イーグルミディアム(DMEM)</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL&nbsp;</td><td>THUNDER TR-FRETは、フェノールレッドを配合した培地に対応しています</td></tr><tr><td>EnVision Xcite マルチラベルプレートリーダー</td><td>PerkinElmer</td><td>2104-0020A</td><td>アッセイは、TR-FRETオプションを装備した様々なプレートリーダーで行うことができます</td></tr><tr><td>エルロチニブ塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>CDS022564</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン組織培養処理フラスコ</td><td>フィッシャー</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td> <td>Wisent</td><td>098-150</td><td></td></tr><tr><td>HeLa細胞株</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>JAK阻害剤 1</td><td>ケイマンケミカル</td><td>15146</td><td></td></tr><tr><td>オービタルプレートシェーカー</td><td>多くのオプションが利用可能</td><td>適用</td><td></td>されない</tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IFN&alpha;2b</td><td>ProSpec</td><td>CYT-460</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトIL-4</td><td>R&D Systems</td><td>204-IL</td><td></td></tr><tr><td>ロズウェル パーク メモリアル インスティテュート 1640 培地 (RPMI)</td><td>Wisent</td><td>350-007-CL</td><td>THUNDER TR-FRET は、フェノールレッド</td></tr><tr><td>を含む THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET細胞シグナル伝達アッセイキット</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT1PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT3PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET細胞シグナルアッセイキット</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT4P-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET細胞シグナルアッセイキット</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT5PT-500</td><td></td></tr><tr><td>THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET細胞シグナルアッセイキット</td><td>BioAuxilium Research</td><td>KIT-STAT6PT-500</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA 0.05%</td><td>Wisent</td><td>325-542-CL</td><td></td></tr><tr><td>U266B1細胞株</td><td>ATCC</td><td>TIB-196</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ミリQグレードの水(18 M&Omega;.cm)を希釈するためにLysis BufferおよびDetection Buffer</td></tr></tbody></table>

ヒト細胞中の内因性リン酸化statタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

ヤヌスキナーゼ(JAK)/シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因子(STAT)シグナル伝達経路は、サイトカインおよび成長因子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしている。STATタンパク質は、主にJAKによって媒介されるチロシンリン酸化によって活性化される。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している。したがって、天然細胞シグナル伝達環境内でのSTATタンパク質のリン酸化をモニターする能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。リン酸化STATタンパク質を定量するために利用可能な従来のアッセイ形式には、ウェスタンブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が含まれる。これらの異種の方法は、労働集約的でスループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、信頼性が低い(特異的な)ことがよくあります。均質な(洗浄なしの)方法が利用可能であるが、依然として高価である。 
ここでは、新規サンダー時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動(TR-FRET)プラットフォームを使用して、接着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の内因性レベルの384ウェルフォーマットで、高感度で堅牢で費用対効果の高い測定のための詳細なプロトコルが提供されています。細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、ハイスループットスクリーニング(HTS)用に設計されています。アッセイプロトコルは柔軟で、少量サンプル(15 μL)を使用し、1つの試薬添加ステップのみを必要とし、低スループットおよびハイスループットのアプリケーションに適合させることができます。各ホスホ-STATサンドイッチイムノアッセイは、既知のアゴニストおよび阻害剤を用いて最適化された条件下で検証され、予想される薬理学およびZ'因子値を生成する。TR-FRETアッセイはレシオメトリックであり、洗浄ステップを必要としないため、従来のアプローチよりもはるかに優れた再現性を提供します。この一連のアッセイは、細胞処理後の特異的リン酸化STATタンパク質のより包括的な分析、およびJAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび特性評価のための新しい費用対効果の高いツールを提供します。

各 THUNDER TR-FRET アッセイは、付着細胞 (HeLa または A431) または浮遊細胞 (U266B1) を JAK/STAT経路特異的アクチベーターまたはインヒビターで処理し、該当する場合は特定のリン酸化 STAT および総 STAT のレベルを測定することによって薬理学的に検証されました。アッセイは、2プレート転写プロトコルおよび事前に最適化されたアッセイ条件を使用して、384ウェルフォーマットで実施しました。図3、図4、図5、図6、および図7は、すべてのSTATアッセイについて得られた代表的な濃度反応曲線を要約する。 全体として、ホスホ-STATアッセイのすべての刺激剤および阻害剤濃度-応答曲線は、堅牢なTR-FRETシグナル、広いダイナミックレンジ、低いウェル間変動係数(典型的には≤5%)、および許容可能なS/B比を...

時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動細胞ベースのアッセイプロトコルは、384ウェルフォーマットの細胞溶解物中の内因性リン酸化シグナルトランスデューサおよび転写活性化剤(STAT)1/3/4/5/6タンパク質の単純、特異的、高感度、および堅牢な定量のために記載されています。

ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

TR-FRETベースのアッセイは、JAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび薬理学的特徴付けのための新しい費用対効果の高いツールを提供します。この技術は、ウェスタンブロットやELISAなどの従来の方法よりもはるかに簡単で、迅速で、再現性があり、堅牢です。洗浄工程は不要で、試薬は1回の工程で添加されます。このイムノアッセイプラットフォームは、特異的抗体が利用可能であれば、他の細胞シグナル伝達タンパク質に容易に適用することができる。再現性のあるアッセイを設計するには、適切な細胞培養方法を使用し、標準的な操作手順を確立する必要があります。さらに、細胞培養および処理条件を慎重に最適化する必要があります。手順を実証するのは、私たちの研究室の科学者であるジュヌヴィエーヴ・シャテルです。まず、HeLaおよびA431細胞を、10%FBSを添加したDMEMを用いて、加湿された摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で培養する。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、それらをトリプシン処理し、継代するか、アッセイに使用する。アッセイを実行するには、事前に最適化された密度で50マイクロリットルの細胞を適切な培養培地中の96ウェル組織培養処理プレートに分注し、次いでそれらを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーター内で一晩インキュベートする。翌日、ポリプロピレン製96ウェルプレートの12ウェルにわたって無血清培地で化合物を段階的に希釈することによって、試験化合物の中間2倍および4倍希釈系列を調製する。細胞刺激のために、シミュレータを含む無血清培地を2倍の濃度で50マイクロリットル加え、室温または37度で予め最適化された時間の間、細胞をインキュベートする。細胞阻害のために、阻害剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、室温または37度のいずれかで予め最適化された時間の間細胞をインキュベートし、次いで、刺激剤を含む無血清培地を4倍濃度で25マイクロリットル加え、予め最適化された時間にわたってインキュベートする。次に、細胞を溶解するために、1X補充溶解緩衝液を調製し、それにホスファターゼ阻害剤カクテルを加える。細胞培養培地を慎重に除去して廃棄した後、直ちに調製した1X添加溶解緩衝液50マイクロリットルを加え、適度な攪拌で振とう下で室温で30分間インキュベートする。TR-FRET検出のために、1X検出バッファー中に4X抗体検出ミックスを調製し、次いでEUAB1およびFRAB2抗体溶液、ならびにEUAB3およびFRAB4抗体溶液を1X検出緩衝液に調製する。最後に、予め希釈されたEUAB1を、リンタンパク質の検出のために予め希釈されたFRAB2と、総タンパク質の検出のために予め希釈されたEUAB3および予め希釈された

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Biochemistry

生物化学

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。...

SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

このビデオでは、試験タンパク質に特異的な抗体にタグされたドナーおよびアクセプター蛍光色素の助けを借りて、内因性タンパク質のリン酸化を決定するための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動またはTR-FRETアッセイについて説明しています。この技術は、細胞溶解物中の試験タンパク質のリン酸化を測定するために設計されています。...

細胞内のタンパク質リン酸化をモニタリングするための時間分解Forster共鳴エネルギー移動

ロイシンリッチリピートキナーゼ1および2（LRRK1およびLRRK2）は、GTPアーゼおよびキナーゼドメインの両方をコードし、細胞内でリン酸化されたマルチドメインタンパク質である。ここでは、それによってその全体的なセルラphophorylationレベルを測定する手段を提供する、32 Pオルトリン酸を用いて細胞内LRRK1とLRRK2を標識するためのプロトコルを提示する。...

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。...

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

ここでは、IRF3転写因子のリン酸化依存性活性化の詳細な分析を可能にする手順について説明します。これは、高分解能のSDS-PAGEとネイティブPAGEを組み合わせ、複数のリン酸化特異的抗体を用いたイムノブロットと組み合わせることで実現されます。...

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

本プロトコルは、リソソーム酵素の阻害と組み合わせたウエスタンブロッティングおよび免疫細胞化学は、サイトカイン様因子1（CLF-1との相互作用によって搬送される毛様体神経栄養因子受容体α（CNTFRα）のダウンレギュレーションを示すために使用することができる方法について説明します）およびエンドサイトーシス受容体sorLA。...

SorLAとCLC：ウェスタンブロッティング、リソソーム酵素の阻害、および免疫細胞化学によって実証されるようにCNTFRαのCLF-1依存ダウンレギュレーション

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。...

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

ペプチド競合アッセイは、種々の分子および免疫学的実験において広く使用されている。本稿では、in vitroオリゴペプチド競合キナーゼアッセイの詳細な方法と、特定のリン酸化部位を見出すのに有用な関連する検証手順について説明します。...

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

本プロトコルは、改良された一分子プルダウン(SiMPull)アッセイを用いてタンパク質リン酸化を定量するためのサンプル調製およびデータ分析について記載する。...

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

ここでは、生きたHepG2細胞におけるAkt活性化とリン酸化の時空間ダイナミクスを定量化するためのプロトコルを紹介します。フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)イメージングは、がん細胞におけるインスリンシグナル伝達経路と代謝調節に関する貴重な洞察を提供する強力なツールです。...

HepG2細胞における代謝制御Akt活性化ダイナミクスの生細胞フェルスター共鳴エネルギー移動イメージング

学ぶTR-FRETアッセイによるヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の定量法。384ウェル形式で洗浄工程不要の高感度・高再現性の細胞シグナル伝達研究手法を習得できます。

ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ

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